專利名稱：含一種醚類脂/互補(bǔ)形類脂混合物的載體和其治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及含醚類脂的藥用組合物和涉及這種組合物在治療各種疾病如癌癥和炎癥中的用途。
本發(fā)明背景癌癥化療的目的一般在于在避免伴隨損害周圍細(xì)胞和組織的同時減慢癌細(xì)胞的生長或破壞癌細(xì)胞；因此最有效的抗癌劑是那些能最好地選擇性靶向進(jìn)攻癌細(xì)胞而使正常細(xì)胞相對不受影響的物質(zhì)。
醚類脂可有效的作為抗癌劑(參見例如Dietzfelbinger等(1993)；Zeisig等(1993)；Powis等(1990)；Berdel(1991)；Bhatia和Hadju(1991)；Reed等(1991)；Workman等(1991)；Workman等(1991)；Bazill和Dexter(1990)；Berdel(1990)；Counsell等(1990)；Tritton和Hickman(1990)；Muschiol等(1990)；Layton等(1980)；Runge等(1980)；Munder和Westphal(1990)；Lohmeyer和Workman(1995)；Lohmeyer和Bittman(1994)；英國專利1583661；美國專利3752886)。關(guān)于醚類脂對癌細(xì)胞的毒性已經(jīng)提出了幾種作用機(jī)制，包括癌細(xì)胞缺乏烷基裂解酶；所導(dǎo)致的不能水解醚類脂引起了其細(xì)胞內(nèi)積累并結(jié)果損害了細(xì)胞膜類脂組織。其它可能的醚類脂作用機(jī)制包括對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化作用水平的影響和細(xì)胞類脂代謝的破壞。
正常細(xì)胞一般具有避免或克服醚類脂潛在毒性作用的能力，而癌細(xì)胞卻沒有。但是，沒有這種能力的正常細(xì)胞如紅血細(xì)胞(“RBCs”)和癌細(xì)胞一樣會受醚類脂作用的破壞影響。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)源于RBCs暴露于醚類脂的溶血作用嚴(yán)重妨礙了醚類脂的治療用途(參見例如Houlihan等，1995)。解決這種醚類脂導(dǎo)致的細(xì)胞毒性問題的一種方法是將所述藥物混入到類脂基載體如脂質(zhì)體中。
本發(fā)明提供一種類脂基載體，它具有一種包含所述醚類脂和與所述醚類脂互補(bǔ)分子形狀的一種類脂的層狀類脂組分；這種形狀互補(bǔ)性可使比原本另外可能的濃度更高的醚類脂混入到類脂基載體中。以前并沒有介紹在本發(fā)明的藥用組合物中這種醚類脂和與其互補(bǔ)形狀類脂的新組合。PCT/US95/12721描述了除了一種具連接到甘油骨架第二個位置上的一個甲氧基的甘油基醚類脂外還包含膽甾醇、磷酰膽堿和磷脂酰乙醇胺-二羧酸衍生物的脂質(zhì)體。德國專利申請4132345描述了除了一種含甲氧基醚類脂外還包含膽甾醇和一種帶正電荷或負(fù)電荷類脂的脂質(zhì)體。日本專利申請61-022020描述了除了含乙?；虮；母视突杨愔膺€含膽甾醇和一種磷脂的脂質(zhì)體。Mende等人描述了包含一種等摩爾比率的醚類脂/膽甾醇組合的脂質(zhì)體的膜電勢改變作用。然而，這些文獻(xiàn)中沒有一篇描述了包含互補(bǔ)形的類脂和在第二位具一甲氧基的甘油基醚類脂的藥用組合物。
本發(fā)明概述已知醚類脂是有效抗癌劑；但是，也已知它們對一些正常細(xì)胞是有細(xì)胞毒性的。因此，醚類脂的有效治療用途需要一種輸送醚類脂的途徑使其毒性被緩解而其治療能力被維持。本發(fā)明以具一層狀類脂組分的類脂基載體的形式提供了這種途徑，所述層狀類脂組分包含一種含醚鍵甘油類脂即“醚類脂”和一種“互補(bǔ)形的類脂”即一種具有與醚類脂的分子形狀互補(bǔ)形狀的類脂。所述甘油類脂具有下列分子式
式中R1優(yōu)選為具有式-(CH2)n1CH3，更優(yōu)選為-(CH2)17CH3的基團(tuán)；Z優(yōu)選為氧。因此最優(yōu)選所述甘油類脂為
即“ET-18-OCH3”或(C-18醚類脂)。
所述互補(bǔ)形的類脂優(yōu)選自中性甾醇、中性甾醇/陰離子甾醇組合、心磷脂、二和三酰基甘油、二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(“DAPE”)或類似的類脂。更優(yōu)選所述互補(bǔ)形類脂是膽甾醇、膽甾醇硫酸鹽(sulfate)或膽甾醇和膽甾醇硫酸鹽的混合物。
含本發(fā)明的載體的藥用組合物治療上可用于例如通過將包括治療有效量的甘油類脂的組合物對哺乳動物給藥以降低哺乳動物腫瘤的大小。
附圖的簡要說明

圖1為各種類脂的單層膜的表面壓力對每分子平均分子面積(“MMAM”)的關(guān)系圖。類脂為ET-18-OCH3(a)、膽甾醇(b)、POPC(c)、DOPC(d)和DOPE(e)。膜以15cm2/min壓制。每條曲線是三次壓制的平均值。
圖2.A)作為ET-18-OCH3含量的函數(shù)的每分子平均分子面積，這里單層由與DOPC(●)、POPC(▲)、DOPE(■)或膽甾醇()混合的ET-18-OCH3形成。數(shù)據(jù)是3次試驗(yàn)的平均值，±S.D(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。虛線代表對基于各個MMAM值的簡單加合性的膽甾醇/ET-18-OCH3混合物的期待值(A0)。B)作為ET-18-OCH3函數(shù)的MMAM百分降低率。
圖3.混入通過擠壓過一個100nm孔徑濾器形成的脂質(zhì)體中的ET-18-OCH3的溶血活性。各符號代表游離ET-18-OCH3(◆)、以40％(摩爾)混入具有類脂POPC(●)、DOPC(▲)、DOPE(■)和膽甾醇()的脂質(zhì)體的ET-18-OCH3。每個制備進(jìn)行三次并且誤差條(bar)代表S.D。脂質(zhì)體粒徑通過動態(tài)光散射測量并發(fā)現(xiàn)除了ET-18-OCH3/膽甾醇脂質(zhì)體平均直徑為77nm外各樣品均為約40nm。
圖4.類脂分子形狀對收集結(jié)構(gòu)影響的示意圖。涂黑區(qū)域代表親水類脂首基；陰影區(qū)域代表類脂的疏水烴區(qū)域結(jié)構(gòu)。
圖5.各種摩爾比率的ET-18-OCH3與其它類脂的混合物的磷核磁共振(x-軸ppm)(a)在23℃下的ET-18-OCH3/CHOL(60∶40摩爾比率)；(b)在23℃下的ET-18-OCH3/CHOL(50∶50摩爾比率)；(c)在23℃下的ET-18-OCH3/CHOL(40∶60摩爾比率)；(d)在37℃下的ET-18-OCH3/CHOL(40∶60摩爾比率)；(e)在23℃下的ET-18-OCH3/POPC(40∶60摩爾比率)；(f)在23℃下的ET-18-OCH3/DOPC(40∶60摩爾比率)；(g)在23℃下的ET-18-OCH3/DOPE(40∶60摩爾比率)；(h)在37℃下的ET-18-OCH3/DOPE(40∶60摩爾比率)；(a)的各向同性峰被定為0 ppm的值。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了具有層狀類脂組分的類脂基載體，它們包括互補(bǔ)形狀的類脂和具有一個三碳甘油骨架的類脂，即“甘油類脂”。這些甘油類脂包括一烴基鏈(“R1”)，其端頭的亞甲基碳通過一氧原子在1號位連接到甘油骨架上。因此，烴鏈通過醚鍵的方式連接到甘油骨架上以及本發(fā)明的甘油類脂是“含醚鍵”甘油類脂或“醚類脂”。一個甲基通過一個氧原子或一個硫原子在所述甘油骨架的2號位連接到甘油骨架上并且在3號位連接了一個磷酸膽堿基(-OP(O)3CH2CH2N(CH3)3)。因此，本發(fā)明的甘油類脂具有下列L-或D-異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)通式，盡管本發(fā)明優(yōu)選L-異構(gòu)體
R1是具有式Y(jié)1Y2的基團(tuán)，式中Y1是基團(tuán)-(CH2)n1(CH＝CH)n2(CH2)n3(CH＝CH)n4(CH2)n5(CH＝CH)n6(CH2)n7(CH＝CH)n8(CH2)n9。n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的和是一個9到23的整數(shù)。n1是零或一個1到23的整數(shù)，n3是零或一個1到20的整數(shù)，n5是零或一個1到17的整數(shù)，n7是零或一個零到14的整數(shù)，n9是零或一個1到11的整數(shù)；n2、n4、n6和n8各分別為零或1。Y1優(yōu)選飽和，具有式-(CH2)n1CH3，n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8因此均等于0。Y2是C(O)2H或CH3并優(yōu)選為CH3。
R1因此優(yōu)選是-(CH2)n1CH3，更優(yōu)選-(CH2)17CH3。Z是O或S，但是優(yōu)選O。因此本發(fā)明的甘油類脂優(yōu)選為
即1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-3-磷酸膽堿(C-18醚類脂，“EL-18”或“ET-18-OCH3”。
除了醚類脂外，所述層狀類脂組分包含其分子形狀與醚類脂互補(bǔ)的兩親類脂分子即“互補(bǔ)形類脂”。在含水環(huán)境中，兩親類脂一般具有錐形、圓柱形或倒錐形的分子形狀(圖4)。水合兩親類脂分子的具體形狀取決于分子的極性首基和疏水酰基鏈區(qū)域結(jié)構(gòu)的相對尺寸(參見例如Kumar等，1991；Rand等，1975；Madden和Cullis，1982；Wu等，1991；Wu和Chi，1991；和Israelachvill等，1976，各文獻(xiàn)內(nèi)容均通過引用并入本文)。
錐形類脂具有比其烴區(qū)域結(jié)構(gòu)橫截面小的首基表面積；這些類脂在含水環(huán)境中形成膠束，其中類脂首基繞著所述膠束的外部排列，而烴鏈在其內(nèi)部螯合。倒錐形類脂具有大于疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)橫截面面積的首基表面積；這些類脂形成了相反膠束，其中所述首基排列在其結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，所述烴繞著其外部排列。圓柱形類脂具有大致與其疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的橫截面面積相等的首基表面積。這些類脂可本身形成雙層，然后其烴鏈以一般為同一平面肩并肩的形式在所述雙層的內(nèi)部排列，而所述類脂首基朝著周圍水環(huán)境排列。
圓柱形類脂特別適合于形成層狀結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈兙哂械难刂浞肿拥拈L軸的對稱。這種對稱可讓所述類脂在雙層中采取同一平面肩并肩的形式，這種排列能提供最大程度地遮蔽疏水烴鏈免受與周圍水在能量上不利地接觸。
首基和烴鏈區(qū)域結(jié)構(gòu)尺寸不同的錐形和倒錐形類脂一般本身并不形成層。它們分子形狀的不對稱意味著對于遮蔽類脂的?；渽^(qū)免受與含水環(huán)境接觸來說雙層排列不是最有效的排列。在雙層中錐形和倒錐形類脂的肩并肩填充將會因?yàn)榉肿有螤畹牟粚ΨQ而讓很大部分的類脂的烴區(qū)域結(jié)構(gòu)暴露于含水環(huán)境中。反向(inverted)膠束(對于錐形類脂)和膠束(對于倒錐形類脂)暴露了這些類脂較少的烴區(qū)，因此對于這些類型的類脂來說是更適合的結(jié)構(gòu)。
但是，混合的錐形和倒錐形類脂可形成層，因?yàn)樗龌旌咸峁┝搜刂旌系念愔肿拥拈L軸的近似對稱。對于大致等摩爾的錐形和倒錐形類脂的混合物來說最大程度地將酰基鏈區(qū)與水隔離通過其在一雙層結(jié)構(gòu)中的排列提供。因此，“互補(bǔ)形類脂”是一種具有不對稱、非圓柱形分子形狀的類脂，其可與第二種不對稱形狀的類脂分子一起形成一種具有沿著混合分子長軸的大致對稱的一個類脂分子對。因此，對于倒錐形分子如本發(fā)明的甘油類脂來說，互補(bǔ)形狀類脂是一種錐形類脂。
兩親類脂的首基和?；渽^(qū)的相對尺寸和由此所述類脂的分子形狀可通過按照等式S＝V/(a)(I)[式中“V”是類脂的烴區(qū)域結(jié)構(gòu)的體積，“a”是所述類脂的首基表面積，“I”是烴鏈的長度]測定的類脂的填充參數(shù)“S”值表達(dá)。具有大致對稱形狀的圓柱形類脂具有約0.74-1的填充參數(shù)。其極性區(qū)比其疏水區(qū)域占更大空間的倒錐形類脂具有小于約0.74的填充參數(shù)。具有較小的極性區(qū)和較大的疏水區(qū)的錐形類脂具有大于約1的填充參數(shù)。因此，此中的“互補(bǔ)形類脂”是錐形的，因?yàn)槊杨愔堑瑰F形的，所述互補(bǔ)類脂也具有大于約1的填充參數(shù)。
由一類脂分子占據(jù)的空間量的度量也是一類脂分子在類脂形成的單層中占據(jù)的平均面積(“MMAM”)。各種類脂的MMAM值可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員按本發(fā)明所述如在下面的實(shí)施例1中所述的那樣測定。簡要地說，MMAM值可通過首先通過將類脂溶液滴加到水介質(zhì)的表面而在容納于一適合槽內(nèi)的水介質(zhì)表面上形成一所述類脂的單層而測定。將類脂溶液連續(xù)加到介質(zhì)表面直到表面壓力開始增加，然后降低所用槽的區(qū)域從而使面積也降低。記錄不同表面積的表面壓力并繪出面積對壓力曲線。通過將曲線的最陡部分外推到零壓力處的類脂表面積得到MMAM值。
在由錐形和倒錐形類脂混合形成的單層中類脂分子占據(jù)的平均面積可按照式A0＝X1·A1+X2·A2來計(jì)算(參見Ali等，其內(nèi)容通過引用并入本文)，其中“A0”是在二組分系統(tǒng)中類脂的期待MMAM，X1和X2是在所述混合物中類脂的相對摩爾百分比率，A1和A2是各類脂測得的MMAM值。因此，在二組分單層中類脂的混合將期待產(chǎn)生反應(yīng)每個組分類脂存在于混合物中的相對比例的每類脂分子的平均分子面積(“MMAM期待”)。就是說，按照上式計(jì)算，類脂的MMAM期待值將是加合值。
但是，在本發(fā)明的類脂層中當(dāng)甘油類脂與互補(bǔ)形狀的類脂混合時，MMAM值的加合并不是這樣。而是當(dāng)在本發(fā)明的層中類脂的每分子平均分子面積實(shí)際測量時(“MMAM實(shí)際”)，發(fā)現(xiàn)其至少比相應(yīng)的MMAM期待值低20％。就是說，在本發(fā)明的甘油類脂/互補(bǔ)形類脂層中由每個類脂分子占據(jù)的平均面積比按照上式測定的基于單個類脂的平均分子面積的原本期待值低至少約20％。因此，“互補(bǔ)形類脂”也是一種與按此中所述比例的甘油類脂在一層中混合時其MMAM實(shí)際比相應(yīng)的MMAM期待低至少約20％的類脂。
具體的互補(bǔ)形類脂沒有限制，包括中性甾醇；陰離子甾醇衍生物諸如磷酸鹽、硫酸鹽和有機(jī)二羧酸鹽衍生物；心磷脂；各種磷脂酰乙醇胺諸如二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(“DAPE”)；二和三酰基甘油；類脂質(zhì)；和這些類脂的混合物。另外的互補(bǔ)形類脂可由本領(lǐng)域技術(shù)人員按本發(fā)明所述(例如鑒別錐形類脂，其具有大于約1的填充參數(shù)并且其形成的甘油類脂/互補(bǔ)形類脂混合物具有比按此中所述計(jì)算的相應(yīng)MMAM期待值低至少約20％的按此中所述測得的MMAM實(shí)際值)容易地驗(yàn)證。
優(yōu)選的互補(bǔ)形類脂是中性甾醇和中性甾醇與陰離子甾醇衍生物的混合物，所述混合物中的中性甾醇與陰離子甾醇衍生物的摩爾比率優(yōu)選為約5∶1。更優(yōu)選所述互補(bǔ)形類脂是中性甾醇膽甾醇、陰離子甾醇衍生物膽甾醇硫酸鹽或5∶1(摩爾)膽甾醇與膽甾醇硫酸鹽的混合物。在本發(fā)明的層中互補(bǔ)形類脂優(yōu)選與甘油類脂混合，從而使類脂基載體的層狀類脂組分包含約30％(摩爾)到小于約50(摩爾)甘油類脂和大于約50％(摩爾)到70％(摩爾)互補(bǔ)形類脂。更優(yōu)選所述混合物含約40％(摩爾)甘油類脂和約60％(摩爾)互補(bǔ)形類脂。因此，在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類脂層基本上由約40％(摩爾)甘油類脂ET-18-OCH3和約60％(摩爾)互補(bǔ)形類脂(膽甾醇、膽甾醇硫酸鹽或5∶1摩爾比率的膽甾醇與膽甾醇硫酸鹽的混合物)組成。
已經(jīng)計(jì)算和測定了二組分類脂系統(tǒng)的MMAM值(見下面和圖3A和3B)，所述二組分類脂系統(tǒng)包括以二種類脂的各種摩爾比率的甘油類脂ET-18-OCH3和類脂棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(“POPC”)、二油酰磷脂酰膽堿(“DOPC”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)或膽甾醇(“CHOL”)。ET-18-OCH3與POPC或DOPC的混合物展現(xiàn)出至多10-15％MMAM的降低，即在所測的類脂濃度范圍內(nèi)存在10-15％MMAM期待值和相應(yīng)的MMAM實(shí)際值的差異。ET-18-OCH3/DOPE混合物也展現(xiàn)出小于約20％的MMAM降低。因此，POPC、DOPC和DOPE均不是互補(bǔ)形類脂。
但是，對于ET-18-OCH3濃度為約30-50％(摩爾)的ET-18-OCH3和膽甾醇的混合物來說，MMAM實(shí)際值比相應(yīng)的MMAM期待值的降低程度大于20％。例如40％(摩爾)ET-18-OCH3/60％(摩爾)CHOL混合物展現(xiàn)出約35％的MMAM降低，而50％(摩爾)/50％(摩爾)混合物展現(xiàn)出42％的MMAM值的降低。因此，在所述相同類脂濃度下，類脂混合物中用膽甾醇取代DOPE產(chǎn)生了與所獲MMAM降低程度的顯著差異。這種在ET-18-OCH3/CHOL和ET-18-OCH3/DOPE混合物間MMAM降低程度上的差異不能基于CHOL和DOPE的技術(shù)知識預(yù)測，因?yàn)檫@兩種類脂均是錐形以及兩者均具有約1.2-1.3的填充參數(shù)。然而，CHOL與甘油類脂混合獲得了大于約20％的MMAM降低，而DOPE沒有。所以，CHOL是一種“互補(bǔ)形類脂”，而DOPE不是。
按下面實(shí)施例2所述制備的ET-18-OCH3/CHOL、DOPE、POPC或DOPC脂質(zhì)體的溶血活性也已測定，如下文實(shí)施例3所示。下文圖3所示的結(jié)果是獲得樣品培養(yǎng)基中50％的紅血細(xì)胞溶血所需的各種脂質(zhì)體中的ET-18-OCH3濃度(H50)。數(shù)據(jù)表明對于ET-18-OCH3/膽甾醇脂質(zhì)體來說其H50值為661微摩爾(μM)，就是說為了使50％存在的紅血細(xì)胞溶解需要在介質(zhì)中有661微摩爾的醚類脂濃度。ET-18-OCH3/DOPE脂質(zhì)體展現(xiàn)出91μM的H50，即比ET-18-OCH3脂質(zhì)體大7倍以上的溶血作用；ET-18-OCH3/DOPC和ET-18-OCH3/POPC脂質(zhì)體分別具有38和26μM的H50值。因此與甘油類脂/非互補(bǔ)形類脂脂質(zhì)體混合物比較，在脂質(zhì)體中甘油類脂和互補(bǔ)形類脂的混合物顯著降低了甘油類脂的溶血能力并依此增強(qiáng)了其治療有效性。
甘油類脂和互補(bǔ)形類脂被混合在類脂基載體的層狀類脂組分中。最好，所述載體為一種脂質(zhì)體，它是一種具有單類脂雙層(單室脂質(zhì)體，“ULV”)或多類脂雙層(多室脂質(zhì)體，“MLV”)的自成型結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的脂質(zhì)體優(yōu)選為具有約25-200nm平均粒徑的多室脂質(zhì)體或單室脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體可通過各種方法制備(參見例如Deamer和Uster(1983)的一篇綜述文章)。這些方法包括(沒有限制)Bangham的制備多室脂質(zhì)體的方法(MLVs)；Lenk的、Fountain的和Cullis的制備具實(shí)際相等的層間溶質(zhì)分布的制備MLVs的方法(“SPLVs”；參見例如美國專利4522803、4588578、5030453、5169637和4975282)；和Papahadjopoulos等人的制備寡層脂質(zhì)體(“REVs”)的反向蒸發(fā)法(美國專利4235871)。ULVs可通過諸如超聲(參見Papahadjopoulos等(1967))或擠壓(美國專利5008050和5059421)從MLVs制備。本發(fā)明的脂質(zhì)體可通過任何一種這些文獻(xiàn)方法制備，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用并入本文。
可采用各種方法諸如超聲、勻化、French Press和研磨法從較大的脂質(zhì)體制備較小的脂質(zhì)體。擠壓法(參見美國專利5008050)可用于制備降低粒徑的脂質(zhì)體，即通過在加壓下使脂質(zhì)體通過給定所選尺寸的過濾器濾孔產(chǎn)生具有預(yù)定平均粒徑的脂質(zhì)體。切向流動過濾(參見WO89/008846)也可用于調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的粒徑，即產(chǎn)生整體具更少不均勻性、更均勻的規(guī)定粒徑分布的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體粒徑可通過多種易實(shí)施的方法如準(zhǔn)電子光散射法和使用儀器如Nicomp粒度儀測定。上面引用的文獻(xiàn)內(nèi)容通過引用并入本文。
此外，本發(fā)明的脂質(zhì)體可脫水、貯存并然后再生而保留其內(nèi)容物的基本部分。脂質(zhì)體脫水一般需要在脂質(zhì)體雙層的內(nèi)部和外部使用親水干燥保護(hù)劑諸如一種雙糖象蔗糖和麥芽糖(參見美國專利4880635，其內(nèi)容通過引用并入本文)。一般相信這種親水化合物防止了在脂質(zhì)體中類脂的重排，從而使其粒徑和內(nèi)容物在干燥處理和通過隨后的脫水時得以保持。適合質(zhì)量的這種干燥保護(hù)劑是它們?yōu)閺?qiáng)的氫鍵受體并且擁有保存脂質(zhì)體雙層組分的分子內(nèi)空間的立體化學(xué)特征?；蛘撸绻诿撍爸|(zhì)體制劑不冷凍可將干燥保護(hù)劑省去，足夠的水保存在隨后脫水的制劑中。
本發(fā)明的脂質(zhì)體可含有一種或多種另外的生物活性劑，即除了生物活性的甘油類脂外的一種或多種生物活性劑?！吧锘钚詣笔强山o予動物的任何化合物或組合物。它們包括用于成象或其它診斷形式的制劑和在動物體上具有生物活性的制劑。生物活性劑包括(但不限于)抗病毒劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗寄生蟲藥、抗代謝物、antiglaucomic、抗炎或抗腫瘤化合物、碳水化合物、氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)、免疫球蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑、染料、毒素、酶、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、糖蛋白、放射性標(biāo)記物、不透射線化合物、熒光化合物、細(xì)胞受體蛋白質(zhì)、細(xì)胞受體配體、散瞳化合物、血管擴(kuò)張劑、支氣管擴(kuò)張劑、局部麻醉劑、生長促進(jìn)劑、再生劑等。
通過將生物活性劑溶解于類脂或用于制備脂質(zhì)體的水相中可將一種或多種生物活性劑負(fù)載到脂質(zhì)體中。或者，通過首先形成脂質(zhì)體、例如通過跨越最外面的脂質(zhì)體雙層的pH梯度建立一電化學(xué)勢并然后將可離子化劑加到脂質(zhì)體外面的水介質(zhì)中來將可離子化的生物活性劑負(fù)載到脂質(zhì)體中(參見Bally等美國專利5077056和WO86/01102，其內(nèi)容通過引用并入本文)。最好，所述另外的生物活性劑為一種抗炎藥或抗腫瘤劑。
此中也提供包含含本發(fā)明載體的組合物，如含藥學(xué)上可接受載體的組合物。這種載體一般可接受用于與動物的治療或診斷劑的給藥相聯(lián)系的用途。藥學(xué)上可接受的載體按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于測定和計(jì)算范圍內(nèi)的多種因素制備，所述因素包括(但不限于)具體所給的藥劑以及其濃度、穩(wěn)定性和所需要的生物利用率；用所述組合物治療或診斷的疾??；受治療者，其年齡、大小和一般情況；和組合物的欲給藥途徑如經(jīng)鼻、經(jīng)口、經(jīng)眼、經(jīng)局部、經(jīng)皮、經(jīng)陰道、經(jīng)皮下、乳房內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)靜脈或經(jīng)肌內(nèi)(參見例如Nairn(1985))。用于非腸道生物活性劑給藥的一般藥學(xué)上可接受的載體包括例如D5W(一種含5％(重量/體積)葡萄糖水溶液)和生理鹽水。藥學(xué)上可接受的載體可包含另外的組分例如那些增強(qiáng)活性組分穩(wěn)定性的物質(zhì)如保存劑和抗氧化劑。
本發(fā)明的組合物可通過一般為本領(lǐng)域接受的標(biāo)準(zhǔn)途徑對哺乳動物用藥。給藥的途徑如經(jīng)靜脈、經(jīng)動脈、經(jīng)皮下或經(jīng)肌內(nèi)或經(jīng)腹膜內(nèi)給藥根據(jù)本發(fā)明所述的用于決定和計(jì)算的正常技術(shù)范圍內(nèi)的多個因素選擇。所述因素包括(沒有限制)受治療者的年齡、體重和一般健康情況；想要達(dá)到的藥物的生物利用率；待治療疾病的具體形式；所用載體；和所給治療劑的劑量。
正如上文所述，本發(fā)明的甘油類脂可能是治療上有效的抗癌劑。只要層狀形式的與互補(bǔ)形類脂混合的甘油類脂可使甘油類脂的似洗滌劑樣的活性直接對著腫瘤而使正常細(xì)胞如紅血細(xì)胞免受負(fù)面影響即可。因此，本發(fā)明的組合物可通過包括一有效量的甘油類脂的組合物的給藥降低腫瘤的大小來用于哺乳動物如人類的治療中。
甘油類脂的“有效量”是有效降低已經(jīng)給予甘油類脂藥的哺乳動物中的腫瘤大小的類脂量。有效量一般按照多種因素如被治療者的年齡、大小和一般情況、所治療的癌癥和欲采用的給藥途徑選擇并通過各種方式例如為提供了本發(fā)明方法的普通技術(shù)人員所熟知和易實(shí)施的劑量范圍試驗(yàn)決定。一般來說，所述甘油類脂的有效量是每公斤受治療者體重約1到1000毫克。
可通過用本發(fā)明的組合物降低腫瘤的體積來治療的癌癥包括(但不限于)白血病、淋巴瘤、肉瘤和癌以及腦癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。按照本發(fā)明的實(shí)踐治療的動物可給予一種或多種另外的生物活性劑，即除了甘油類脂外的一種或多種生物活性劑。這種另外的生物活性劑可與所述甘油類脂/互補(bǔ)形類脂分別給藥，也可作為包含于這些類脂中的相同組合物的一部分給藥。
本發(fā)明可從下面的實(shí)施例更好地理解。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解這些實(shí)施例只用于后面權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的說明。
實(shí)施例實(shí)施例1每分子平均分子面積(“MMAM”)測量含所述醚類脂ET-18-OCH3制劑的每分子平均分子面積使用來自KSV Instruments(Trumbull，Connecticut)的配有一雙隔層結(jié)構(gòu)和一Wilhelmy天平的Langmuir-Blodgett微池測定。ET-18-OCH3制劑用溶解于9∶1己烷∶乙醇的溶劑系統(tǒng)中的類脂粉末制備。制備單類脂溶液和混合物，使其通過磷酸鹽精確定量(Chen等，1956)和膽甾醇測定(Rudel和Morris，1973)的總類脂濃度為約1.5mM。通過將樣品滴加到池中心的水面(10mM HEPES，150mM NaCl緩沖液，pH7.2)上形成單層。添加樣品直到表面壓力剛開始上升到零以上，這時記錄添加樣品的精確體積。等待三分鐘待溶劑蒸發(fā)和單層穩(wěn)定后，以15cm2/min的速率減少所述單層的表面積并記錄表面壓力。溶液水平維持在低于池頂部邊緣以下1mm以防止泄漏；由于其親水性質(zhì)維持與隔層(由Delrin組成)的接觸。
從按上述獲得的數(shù)據(jù)繪制壓力對面積曲線(參見圖1和2)，并且通過將曲線最陡部分外推到在零表面壓力處的值確定MMAM值。在該研究中對任何類脂測得的最高崩潰壓力(≤47 mN/m)比用二飽和的PC分子獲得的值(＞62 mN/m)低很多，表明崩潰壓力不是技術(shù)限制的人造的結(jié)果。所有試驗(yàn)均在23℃下進(jìn)行。獲得了EL-18與所述類脂膽甾醇、POPC、DOPC或DOPE的混合物的面積對表面壓力分布。膽甾醇和DOPE兩者具有倒錐形；以前用核磁共振和X-射線的研究已經(jīng)表明CHOL和DOPE與錐形類脂溶血-磷脂酰膽堿混合時形成層狀結(jié)構(gòu)(參見R and等，1975；Madden和Cullis，1982；Wu等，1991)。因?yàn)楸砻娣e的降低，表面壓力隨類脂填充入有機(jī)體結(jié)構(gòu)取向的單層而增高，每個均成為該類脂的特征；在高表面壓力下，所述單層崩潰。通過將所述曲線最陡部分外推到在零表面壓力處的值確定MMAM(A0)值；其結(jié)果如下ET-18-OCH372.82；CHOL44.82；DOPE82.32；POPC82.02；DOPC82.02。
在每種類脂的不同摩爾百分比率下，ET-18-OCH3與CHOL、DOPE、POPC和DOPC的混合物的MMAM值從圖2所示的表面積對壓力曲線獲得。對于各種ET-18-OCH3/類脂混合物來說，MMAM值的百分降低率順序?yàn)槟戠薮迹荆綝OPE＞POPC＞DOPC。由DOPE提供所述類脂混合物的MMAM降低為至多少于20％。但是(參見圖3A)，1∶1的ET-18-OCH3/CHOL混合物具有低于期待值(在圖中由虛線表示)約252的實(shí)際MMAM。已知膽甾醇和DOPE兩者均具有倒錐形，令人驚奇的是和DOPE相比，由膽甾醇的類脂混合物提供了MMAM值更大的降低。
實(shí)施例2脂質(zhì)體制備所有磷脂從Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama)購置。膽甾醇從Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri)購置；所有使用的類脂和試劑均是最高純度。脂質(zhì)體的制備首先通過將適用類脂在溶劑中混合并使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將類脂干燥成薄膜以及將形成的膜用緩沖溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)水合。在沒有進(jìn)一步處理情況下將得到的分散體用于核磁共振分析。對于溶血作用研究，類脂分散體被重復(fù)地擠壓通過規(guī)定孔徑的聚碳酸酯Nucleopore膜(Nuclepore Corp.，Pleasanton，California)。將脂質(zhì)體首先通過0.2μm孔徑的膜10次，然后通過0.1μm孔徑的膜10次。對于ET-18-OCH3/膽甾醇來說，在通過0.2μm孔徑過濾器和最后通過0.1μm孔徑過濾器前先使混合物通過0.4μm孔徑過濾器10次。脂質(zhì)體粒徑使用來自Pacific Scientific(Menlo Park，CA)的一臺NicompModel 270/370亞微細(xì)顆粒粒度儀(Submicron ParticleSizer)通過準(zhǔn)彈性光散射測定。
首先，測定ET-18-OCH3/類脂系統(tǒng)水合手搖分散體的磷NMR信號以證實(shí)層狀相的存在(參見圖2)。在23℃和37℃下具有膽甾醇和DOPE的40％(摩爾)ET-18-OCH3的磷NMR譜圖是典型的層狀態(tài)類脂譜圖(Gruner，1992)。對于DOPC和POPC與ET-18-OCH3的混合物，在較寬的層狀圖形的頂部有一另外的各向同性組分。對于小和大脂質(zhì)體的混合物來說譜圖相似(Hope等，1986)并且譜線寬度似乎太寬(半峰寬3.6-3.9ppm)而不會是ET-18-OCH3膠束(Kumar等，1988)。為了測定該組分是混合膠束結(jié)構(gòu)還是小的多孔結(jié)構(gòu)，收集離心時在溶液頂部不形成塞狀物的部分(混合物漂浮)，并通過薄層層析(TLC)測定ET-18-OCH3與類脂的比率(如下面實(shí)施例5中所述)。所述比率基本上和本體樣品相同，顯示該結(jié)構(gòu)為小脂質(zhì)體不是富含ET-18-OCH3的膠束結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3溶血作用按實(shí)施例2所述制備含40％(摩爾)ET-18-OCH3的脂質(zhì)體。為了保證均勻的粒徑分布，將所有脂質(zhì)體擠壓。對于具有稍大于其它樣品(40nm)的最終粒徑分布(77nm)的ET-18-OCH3/膽甾醇混合物來說，擠壓較為困難(需要較高壓力)；但是，沒有發(fā)現(xiàn)在最終制備物中類脂的比率與擠壓前不同。
按先前所述(Perkins等，1992)評價溶血作用。簡要地說，將每個樣品順序用緩沖溶液稀釋并且每個稀釋溶液取0.3ml與0.3ml經(jīng)洗滌的人的紅血細(xì)胞[4％PBS溶液(v/v)]混合。對于對照來說，則將0.3ml紅血細(xì)胞懸浮體與0.3ml緩沖溶液(陰性溶血作用對照)或0.3ml蒸餾水(陽性溶血作用對照)混合。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品置于37℃培養(yǎng)箱中并攪拌20小時。將試管在低速(2000g)下離心10分鐘沉淀出紅血細(xì)胞。移出二百微升上清液并與1ml水混合。溶血作用通過使用島津2101紫外-可見掃描分光光度計(jì)(Shimadzu Corp，Kyoto，Japan)在550nm處測定吸光度定量。100％溶血作用被定為最大量的從游離ET-18-OCH3獲得的溶血作用。
圖3顯示了四種ET-18-OCH3脂質(zhì)體制劑和游離ET-18-OCH3的溶血曲線圖。溶血作用最小的是ET-18-OCH3/膽甾醇脂質(zhì)體，其產(chǎn)生50％溶血的ET-18-OCH3濃度(H50)為661μM。這種制劑的溶血作用比ET-18-OCH3的H50為91μM的ET-18-OCH3/DOPE脂質(zhì)體小7倍以上。ET-18-OCH3/DOPC和ET-18-OCH3/POPC制劑展現(xiàn)出類似的H50值(分別為38和26μM)；游離ET-18-OCH3的H50值為16μM。比較含40％(摩爾)或60％(摩爾)ET-18-OCH3的ET-18-OCH3與膽甾醇的小單室脂質(zhì)體(“SUVs”)的溶血活性。60％(摩爾)ET-18-OCH3SUVs的溶血活性與游離ET-18-OCH3相當(dāng)。這證明了我們的懷疑，即同溶血-PC(Kumar，1991；Kumar等，1988)一樣，在1∶1化學(xué)計(jì)量以上ET-18-OCH3并不形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4磷核磁共振(NMR)光譜在23℃或37℃的溫度下，在Bruker AC300 NMR分光計(jì)上(BrukerInstrments，Billerica，Massachusetts)獲得121.51MHz下的光譜。使用6微秒脈沖獲得16K點(diǎn)，掃描寬度為50kHz。用50Hz線展寬處理3000獲得值的平均值。脂質(zhì)體樣品通過水合混合類脂的干燥膜制得(見上)。使用從Alexis Corp.(San Diego，California)購買的ET-18-OCH3進(jìn)行NMR分析。除了ET-18-OCH3/膽甾醇混合物含40mg/ml ET-18-OCH3(60-90mg/ml總類脂)外，所有樣品含總共20mg/mlET-18-OCH3(約60mg/ml總類脂)。
在23℃和37℃下，40％(摩爾)濃度的ET-18-OCH3與膽甾醇和DOPE的混合物的磷NMR研究結(jié)果(參見圖5)顯示所述類脂為層形態(tài)。對于DOPC和POPC與ET-18-OCH3的混合物，在更寬的層狀圖形頂部有一另外的各向同性組分。
實(shí)施例5薄層層析(TLC)首先將含水樣品以0.8∶2∶1的比率與甲醇和氯仿混合形成單一相。然后將等分試樣加到硅膠板上并在氯仿/甲醇/水(65∶25∶4)中展開，然后用碘蒸汽顯色。同時也展開每種類脂標(biāo)準(zhǔn)品。
參考文獻(xiàn)Bazill等“在醚類脂對WEHI-3B、HL60和FDCP-Mix A4細(xì)胞作用中的胞吞作用”，Cancer Research，50，7505-7512，1990年，11月1日。
Berdel“醚類脂和衍生物作為探索性抗癌藥”，Onkologie，199013245-250。
Bhatia等“抗癌活性硫醚PAF類似物的選擇性合成”，Lipids，26(12)，1424-1430，1991。
Chem等“顯微測定磷”，Anal.Chem.，28(11)，1756-1758；1956。
Deamer等“脂質(zhì)體的制備方法和機(jī)理”，in Liposomes，MarcelDekker，ed.M.Ostro，1983，27-51。
Dietzfelbinger等“通過體外用醚類脂清洗和冷藏從骨髓中除去乳腺癌細(xì)胞”，Cancer Research 53，3747-3751，1993年，8月15日。
Gruner“非層狀類脂相”，in The Structure of BiologicalMembranes，1992，CRC Press，ed.P.Yeagle，Buffalo，NY.，222-223頁。
Kumar等“Phosphlipid Deitribution and Headgroup Motionin Phosphatidylcholine Liposomes of Different Size”，Biophys.J.，53，1988，121a。
Layton等“脂質(zhì)體與細(xì)胞相互作用細(xì)胞特異毒性與類脂組成的關(guān)系”，Eur J Cancer，16，1529-1538，1980。
Madden等“通過洗滌劑穩(wěn)定作為不飽和磷脂酰乙醇胺的雙層結(jié)構(gòu)，”BBA，684(1982)，149-153。
Nairn等.，“溶液劑、乳劑、懸浮液和提取液”，in PharmaceuticalSciences，1985，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
Papahadjopoulos等“磷脂模型膜，I.水合液晶的結(jié)構(gòu)特征”，BBA 135(1967)624-638。
Powis等“細(xì)胞毒性的醚類脂類似物對磷脂酰肌醇磷脂酶的選擇性抑制”，Cancer Research 52，2835-2840，1992年，5月15日。
Reed等“抗腫瘤醚聯(lián)磷脂誘導(dǎo)的急性骨髓性白血病KG-1細(xì)胞分化成最大值相位樣細(xì)胞”，Life Sciences，49，1221-1227，1991。
Runge“由烷基溶血磷脂破壞人實(shí)體瘤”，JNCI，64(6)，6/1980，1301-1306。
Tritton等“如何殺死癌細(xì)胞膜和細(xì)胞信號作為癌化療的靶”，Cancer Cells，April 1990，95-105。
Stedman氏醫(yī)學(xué)詞典，707-708頁。
Stedman氏醫(yī)學(xué)詞典，123-124頁。
Workman“抗癌醚類脂作為胞內(nèi)選擇性決定性因素的胞吞作用”，Cancer Cells，3(8)，315-317，1991年8月。
Workman等“血小板活性因子(PAF)拮抗劑WEB 2086不調(diào)節(jié)PAF或抗癌烷基溶血磷脂ET-18-0-甲基和SRI 62-834在HL-60前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中的細(xì)胞毒性”，生化藥理學(xué)，41(2)，319-322，1991。
Wu等“含合成糖脂的脂質(zhì)體的改進(jìn)體內(nèi)作用”，BBA，674(1981)，19-29。
Zeisig等“游離脂質(zhì)體烷基磷酸膽堿的體內(nèi)抗腫瘤活性”，Anti-Cancer Drugs，4，57-64，1993。
權(quán)利要求
1.一種具有一層類脂組分的類脂基載體(a)一種具有下式的甘油類脂(glycerolipid)和(b)一種互補(bǔ)形的類脂，其中R1是一個具有式Y(jié)1Y2的基團(tuán)；Y1是-(CH2)n1(CH＝CH)n2(CH2)n3(CH＝CH)n4(CH2)n5(CH＝CH)n6(CH2)n7(CH＝CH)n8(CH2)n9；n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的和是一個9到23的整數(shù)；n1是零或一個1到23的整數(shù)，n3是零或一個1到20的整數(shù)，n5是零或一個1到17的整數(shù)，n7是零或一個零到14的整數(shù)，n9是零或一個1到11的整數(shù)；n2、n4、n6和n8各分別為零或1；Y2是CH3或CO2H；Z是氧或硫；甘油類脂構(gòu)成約30％(摩爾)到少于約50％(摩爾)的所述類脂組分；互補(bǔ)形類脂構(gòu)成大于約50％(摩爾)到至多約70％(摩爾)的所述類脂組分；和所述類脂的MMAM實(shí)際比所述類脂的MMAM期待低至少約20％。
2.權(quán)利要求1的載體，其中R1是(CH2)17CH3。
3.權(quán)利要求1的載體，其中Z是O。
4.權(quán)利要求1的載體，其中所述甘油類脂是
5.權(quán)利要求1的載體，其中所述互補(bǔ)形類脂是一種中性甾醇、選自硫酸鹽、磷酸鹽和有機(jī)二羧酸鹽衍生物的陰離子甾醇衍生物、二或三酰基甘油、心磷脂或二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺。
6.權(quán)利要求5的載體，其中所述互補(bǔ)形類脂是一種中性甾醇膽甾醇。
7.權(quán)利要求5的載體，其中所述互補(bǔ)形類脂包括一種中性甾醇和一種陰離子甾醇衍生物。
8.權(quán)利要求7的載體，其中所述中性甾醇是膽甾醇和所述陰離子甾醇衍生物是膽甾醇硫酸鹽(sulfate)。
9.權(quán)利要求8的載體，其中所述中性甾醇和陰離子甾醇衍生物以各自約5∶1的摩爾比率存在于所述類脂中。
10.權(quán)利要求1的載體，其中所述甘油類脂構(gòu)成所述層狀類脂組分的約40％(摩爾)，所述互補(bǔ)形類脂構(gòu)成所述層狀類脂組分的約60％(摩爾)。
11.權(quán)利要求1的載體，其中所述甘油類脂是
以及其中所述互補(bǔ)形類脂是膽甾醇、膽甾醇硫酸鹽或膽甾醇和膽甾醇硫酸鹽的5∶1(摩爾)混合物。
12.權(quán)利要求11的載體，其中所述甘油類脂構(gòu)成所述類脂的約40％(摩爾)，所述互補(bǔ)形類脂構(gòu)成所述類脂的約60％(摩爾)。
13.權(quán)利要求1的載體，為一種脂質(zhì)體。
14.權(quán)利要求13的載體，其中所述脂質(zhì)體是具有約50-250 nm平均粒徑的單室脂質(zhì)體。
15.權(quán)利要求14的載體，其中所述脂質(zhì)體是一種多室脂質(zhì)體。
16.一種包含權(quán)利要求1的載體的組合物。
17.權(quán)利要求16的組合物，包含一種藥學(xué)上可接受的載體。
18.一種減小哺乳動物中腫瘤尺寸的方法，包括將一定量權(quán)利要求17的組合物對所述哺乳動物給藥，所述組合物包含能有效降低生長量的甘油類脂。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述甘油類脂的有效量為每公斤所述哺乳動物體重約1毫克到約100毫克。
全文摘要
本發(fā)明提供類脂基載體,它具有由一種醚類脂和一種互補(bǔ)形類脂組成的層狀類脂組分。這種新的類脂混合物可容許將醚類脂以比以前可能的更高濃度混入到載體中。含所述載體的藥用組合物可用于治療,例如用于癌癥的治療。
文檔編號A61P35/00GK1240348SQ97180612
公開日2000年1月5日 申請日期1997年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月15日
發(fā)明者W·珀金斯, E·梅林, J·C·弗蘭克林, A·S·雅諾夫 申請人:利普索姆公司