專利名稱：雞馬立克氏病病毒基因突變株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞馬立克氏病病毒(Marek′s disease virus，MDV)的突變株及其該突變株在雞抗病育種中的應(yīng)用，即利用本發(fā)明所涉及的這一雞馬立克氏病病毒突變株接種雞經(jīng)過一段時(shí)間，采血并分離雞血清，利用血清學(xué)的方法測(cè)定對(duì)雞馬立克氏病病毒的抗體滴度，以確定抗雞馬立克氏病病毒雞的存在，從而建立起抗雞馬立克氏病病毒的種群。本發(fā)明的背景雞馬立克病病毒是一種致腫瘤性皰疹病毒，其38kd磷蛋白(pp38)一直被看作是一種馬立克病腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)(Ikuta K.，Nakajima K，Naito M.et al. Int.J.Cancer，1985，35257-264.Nakajima K.et al.J.Gen.Virol.1987，681379-1389Calnek B W.Marek′s disease.In Diseases of Poultry，Calnek B W.et al.Eds，Iowa State University，Press，Ames，1992，302-334)，但對(duì)其在MDV致病和致腫瘤過程中具體的生物學(xué)作用卻一直不清楚。不久前本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的pp38基因產(chǎn)物(崔治中，Lee L F.中國(guó)病毒學(xué)報(bào)，1992，7106-112)，對(duì)雛雞可顯示某種免疫抑制作用(Cui Z and Qin A. Immunodepressive effects of therecombinant 38 kd phosphorylated protein of Marek′s disease virus.InCurrent Research on Marek′s Diseasea，Silva R F.et al.Eds.Rose Printingcompany，Inc.，Tallahassee，F(xiàn)lorida，USA，1996，278-283.崔治中，秦愛建·畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1997，2871-76)。但該系統(tǒng)仍不能完全代表在天然感染和發(fā)病狀態(tài)下pp38的作用，構(gòu)建和利用pp38突變型MDV則有利于解決這一問題。已有報(bào)道表明，能識(shí)別pp38的單克隆抗體H19可與所有測(cè)試過的I型致病性MDV株發(fā)生反應(yīng)(Lee L F，X Liu，and R L Witter.J.Immunol.1983，1301003-1006. Silva R F，and Lee L F.Virology，1984，136307-320)，但卻不能與I型MDV疫苗毒株CVI988反應(yīng)(Rispens BH，H van Vloten，N Mastenbroek et al. Avian diseeases，1972，16108-125Witter R L，R F Silva，and L F Lee. Avian diseases，1987，31829-840)。我們過去對(duì)pp38分子結(jié)構(gòu)分析表明，I型強(qiáng)毒MDV在致弱過程中，pp38基因中的一個(gè)堿基發(fā)生突變并導(dǎo)致一個(gè)氨基酸變異(Cui Z，L F Lee，J.L.liu et al.J.Virology，1991，656509-6515)；單克隆抗體H19識(shí)別的抗原決定簇不變而與強(qiáng)毒GA株相比，I型MDV的疫苗毒CVI988在pp38基因中有二個(gè)堿基突變并導(dǎo)致二個(gè)氨基酸的變異(Endoh D，MNikura，K Hirai et al.J.Vet.Med.Sci.1994，56823-826)。并導(dǎo)致失去為單克隆抗體H19所識(shí)別的強(qiáng)毒型抗原決定簇。本發(fā)明的目的本發(fā)明試圖構(gòu)建在pp38基因內(nèi)發(fā)生定向點(diǎn)突變的重組CVI988株病毒，以求在天然的狀態(tài)下研究MDV的pp38的生物學(xué)活性。同時(shí)利用其相應(yīng)的生物活性于抗病育種系統(tǒng)中，在進(jìn)行其它性狀篩選的同時(shí)以此進(jìn)行對(duì)雞馬立克氏病病毒有抗病性選育。本發(fā)明也還試圖采用定向點(diǎn)突變于馬立克氏病病毒的強(qiáng)毒以獲得制苗用弱毒株。本發(fā)明的特征本發(fā)明以LipofectAMINE為轉(zhuǎn)染試劑，用含有強(qiáng)毒型GA株的PP38全基因序列的重組pHA25質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染不被單克隆抗體H19識(shí)別的疫苗毒CVI988株MDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，用間接熒光抗體試驗(yàn)(FA)，篩選和克隆到能表達(dá)為單克隆抗體H19所識(shí)別的強(qiáng)毒型pp38抗原決定簇的CVI/rpp38株重組病毒。用35S-蛋氨酸標(biāo)記的病毒感染CEF溶解物和單克隆抗體作免疫沉淀反應(yīng)表明(圖2)，重組CVI/rpp38株病毒與天然疫苗毒CVI 988的病毒囊膜糖蛋白B的帶型完全相同，而不同于強(qiáng)毒株。然而單克隆抗體H19不能從天然強(qiáng)毒株感染的CEF溶解物中識(shí)別出任何條帶，但卻可從重組病毒CVI/rpp38及天然強(qiáng)毒株感染的CEF溶解物中識(shí)別出很強(qiáng)的pp38蛋白帶。對(duì)重組病毒CVI/rpp38感染CEF同時(shí)作直接病毒空斑計(jì)數(shù)及用單克隆抗體H19作FA染色顯示特異性病毒斑，兩者比較表明，重組CVI/rpp38病毒相當(dāng)穩(wěn)定。天然CVI988/Rispens的克隆株與重組病毒株CVI/rpp38在CEF上的復(fù)制特性幾乎完全相同。對(duì)病毒基因組上132bp片段重復(fù)區(qū)做PCR分析表明，重組和天然兩株病毒的含不同132bp重復(fù)片段拷貝數(shù)的帶型完全相同。但是兩種病毒在雞體誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的活性顯著不同。將經(jīng)幾乎同等細(xì)胞傳代次數(shù)的天然CVI988與重組CVI/rpp38分別接種3日齡SPF7×15系雜交雞(每羽約40,000pfu)，在感染后10天、16天和26天分別采血對(duì)GA株MDV感染的CEF作間接熒光抗體試驗(yàn)測(cè)定對(duì)MDV的抗體滴度。結(jié)果表明，感染了CVI/rpp38株重組病毒的雞對(duì)MDV的抗體反應(yīng)顯著延緩，且抗體滴度顯著低于天然疫苗毒CVI988感染的雞。接種天然CVI988株的雞，在感染后10天即有部分雞出現(xiàn)MDV抗體，在16天時(shí)所有14只感染雞全部出現(xiàn)抗MDV抗體，平均滴度為1∶86±29；在28天時(shí)達(dá)到1∶379±158；而接種CVI/rpp38的雞，在接種后10天沒有一只表現(xiàn)出MDV特異性抗體反應(yīng)，在20天時(shí)僅有個(gè)別雞產(chǎn)生很低的抗MDV抗體滴度，在28天時(shí)雖然所有雞都出現(xiàn)了抗體反應(yīng)，但其平均滴度僅為1∶65±33，顯著低于天然CVI988株感染雞(P＜0.001)(圖3)。
由于CVI/rpp38在雞誘發(fā)的抗MDV免疫反應(yīng)不僅產(chǎn)生較天然CVI988株慢而低，而且個(gè)體差異也相對(duì)較大(表1)，這就有可能把雞的不同個(gè)體對(duì)CVI/rpp38的抗體水平作為一種篩選標(biāo)記，用于對(duì)MD的抗病育種。本發(fā)明的詳細(xì)描述1 病毒CVI988/Rispens株I型弱毒MDV(Rispens B H，H van Vloten，N Mastenbroeket al.Avian diseeases，1972，16108-125)為美國(guó)農(nóng)業(yè)部腫瘤研究所保存的種毒，在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上培養(yǎng)。I型MDV特異性單克隆抗體H19(Lee LF，X Liu andRL Witter.J Immunol，1983，1301003-1006)能識(shí)別所有測(cè)試過的I型MDV，但唯獨(dú)對(duì)CVI988株病毒呈陰性反應(yīng)(Witter R L，R F Silva，and L F Lee.Avian diseases，1987，31829-840)。在構(gòu)建重組病毒前，用單抗H19對(duì)CVI988/Rispens株感染的CEF作間接免疫熒光試驗(yàn)(1FA)，在二塊分別含有約6000個(gè)病毒空斑的60mm平皿的CEF單層上，末發(fā)現(xiàn)能被單抗H19識(shí)別的空斑。
2 感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染為了構(gòu)建在pp38基因上能表達(dá)強(qiáng)毒型決定簇的重組CVI988/Rispens株病毒，分別以LipofectAMINE(Gibco BRL公司產(chǎn)品)為轉(zhuǎn)染試劑，用含有強(qiáng)毒GA株MDV的pp38基因克隆pHA25質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CVI988/Rispens株感染的CEF。質(zhì)粒pHA25是在對(duì)pp38基因測(cè)序過程的中間產(chǎn)物，它包含從起始編碼子上游580堿基直至越過轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的共2490bp的MDV特異性序列(Cui Z，L F Lee，J.L.liu et al.J.Virology，1991，656509-6515)。轉(zhuǎn)染過程原則上按LipofectAMINE廠家提供的使用說明書進(jìn)行。為了比較最適宜的轉(zhuǎn)染條件，分別在病毒接種前和接種后以不同濃度的LipofectAMINE和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CEF單層，并采用不同的轉(zhuǎn)染時(shí)間。待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為接種于60mm平皿中的第二代CEF，通常在接種后18小時(shí)當(dāng)細(xì)胞單層呈80-90％的密度時(shí)開始接種病毒或開始轉(zhuǎn)染。每塊60mm平皿的CEF單層上病毒接種量約6000個(gè)空斑。轉(zhuǎn)染前CEF單層用無血清無抗生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM洗二次后，再加入含不同劑量LipofetAMINE和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染液，在培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)中放置不同時(shí)間待停止轉(zhuǎn)染時(shí)，先用含犢牛血清的維持培養(yǎng)液5mL將CEF單層洗二次，再加入4～5ml含犢牛血清維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3～5天。


圖1顯示出經(jīng)強(qiáng)毒GA株MDV的pp38基因克隆pHA25質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的弱毒CVI988/Rispens株MDV感染的CEF單層上產(chǎn)生的能在間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)中為單抗H19識(shí)別的重組病毒空斑。在用普通光觀察時(shí)，其周圍也有大量密集的病毒斑，但在IFA中這些CVI988/Rispens株的原始病毒形成的病毒斑均不被單抗H19識(shí)別。
3 重組病毒的篩選純化由于MDV在CEF上呈嚴(yán)格細(xì)胞結(jié)合性不產(chǎn)生游離病毒，使重組病毒的純化較為復(fù)雜。經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染后再接種病毒的CEF或在接種病毒后經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染的CEF繼續(xù)培養(yǎng)5天，觀察有無病毒空斑形成。不論有無明顯空斑形成，均將CEF單層用0.02％胰蛋白酶溶液從平皿上消化下，從每塊平皿上懸浮下的CEF再接種于二塊60mm平皿的新鮮CEF單層上，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天。當(dāng)有明顯空斑形成時(shí)，取一塊用單克隆抗體H19做間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)觀察有無陽(yáng)性病毒斑；如發(fā)現(xiàn)有IFA陽(yáng)性斑，將另一塊平皿上的CEF用胰蛋白酶液洗脫下，并接種于含新鮮CEF的96-孔培養(yǎng)板上，每塊60mm平皿中的感染CEF接種一塊或數(shù)塊96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)3～4天待空斑明顯后，吸去培養(yǎng)液加入50μl含0.02％胰蛋白酶的無血清DMEM培養(yǎng)液，在37℃下孵化5分鐘后，再于每孔中加入100μl含30％犢牛血清的培養(yǎng)液，用8孔道移液器將細(xì)胞吹打懸浮后，從每個(gè)96孔中各取病毒感染的CEF懸液約30μl接種于二塊含CEF單層的96-孔培養(yǎng)板各對(duì)應(yīng)孔中。在培養(yǎng)3～4天出現(xiàn)病毒空斑后，取出一塊板，將每孔中的空斑數(shù)記錄后，傾去培養(yǎng)液并用丙酮-乙醇(6∶4)混合液固定，用單克隆抗體H19作IFA，在熒光晃微鏡下觀察和記錄各孔陽(yáng)性病毒斑數(shù)。
選擇并標(biāo)記含1FA陽(yáng)性斑數(shù)比例高的孔，從另一塊培養(yǎng)板的相應(yīng)孔中，用胰蛋白酶液消化并懸浮感染CEF單層。將來自一個(gè)孔的感染細(xì)胞作連續(xù)二倍稀釋后分別接種于另一塊96-孔板的一系列孔的CEF單層中。培養(yǎng)2～3天待出現(xiàn)空斑后，取含5～20個(gè)空斑的孔，進(jìn)一步接種和篩選。如此重復(fù)3～4個(gè)循環(huán)，每次都選IFA陽(yáng)性斑比例最高的培養(yǎng)孔傳代，并逐漸減少每孔中接種的空斑數(shù)。直至確信IFA陽(yáng)性孔的病毒是從僅含有一個(gè)空斑的孔傳代而來，而且所有空斑都為IFA陽(yáng)性為止。以此確定為經(jīng)空斑純化的重組病毒。
為了排除CVI988原始毒種的不純對(duì)隨后實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，本發(fā)明在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)前即已用與隨后篩選方法相同的IFA檢查了毒種的純度。用免疫沉淀反應(yīng)對(duì)點(diǎn)突變株病毒特性鑒定也表明，突變株CVI/rpp38的pp38復(fù)合體及糖蛋白B復(fù)合體(主要及次要帶)的帶型均不同于天然H19+的超強(qiáng)毒株684-A的帶型；而其糖蛋白B復(fù)合體帶型則與其祖代CVI988/Rispens的克隆株完全相同。這證明了，CVI/rpp38不是污染的強(qiáng)毒而是來源于H19-的弱毒CVI988/Rispens。實(shí)際上，在以4萬(wàn)空斑單位的大劑量接種SPF雞后，H19+的CVI/rpp38突變株也同H19-的CVI988克隆株一樣不會(huì)引起雞的明顯病變。此外，CVI988株病毒在SPF上的復(fù)制及空斑形成均比其它I型MDV快得多，而本研究得到的重組CVI/rpp38在CEF上的復(fù)制和空斑形成特點(diǎn)也與CVI988原始病毒完全一樣，這些都表明CVI/rpp38重組病毒來源于CVI988/Rispens原始株。
4 細(xì)胞游離重組病毒的克隆和篩選經(jīng)空斑純化的重組病毒在CEF經(jīng)幾代擴(kuò)增后，將病毒感染的CEF懸浮于SPGA緩沖液中，用超聲波裂解CEF細(xì)胞以獲取細(xì)胞游離病毒(Calnek B W.et al.ApplMicrobiol.1970，20723-726)，將裂解液高速離心(10,000rpm/min)10分鐘，取上清經(jīng)0.45μ微孔濾器過濾后，以不同的稀釋度接種于數(shù)塊96-孔板的一系列孔的CEF單層上，在培養(yǎng)7天后觀察病毒空斑。選擇幾十個(gè)用盡可能高稀釋度游離病毒液接種的且只有一個(gè)空斑的孔，按前述方法用單克隆抗體H19做IFA，篩選經(jīng)細(xì)胞游離病毒克隆化的H19+重組病毒及克隆化的原H19-非重組病毒。
表2顯示不同的轉(zhuǎn)染條件對(duì)CEF的狀態(tài)、MDV的空斑形成及H19+定向點(diǎn)突變株陽(yáng)性率的影響。從表中可見，對(duì)于60mm直徑平皿中的CEF單層來說，在2.5ml轉(zhuǎn)染液中的LipofectAMINE的最適用量是35μl，轉(zhuǎn)染液在37℃作用細(xì)胞12小時(shí)為宜，增加LipofectAMINE的濃度或延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間，都會(huì)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)及病毒空斑的形成有顯著不良影響。DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)在接種病毒后12小時(shí)進(jìn)行，如在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再接種病毒，則會(huì)顯著減少病毒斑的形成(比較試驗(yàn)A和B)。從表中還可見，當(dāng)轉(zhuǎn)染液對(duì)CEF單層的作用時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)(24小時(shí))，即使去除轉(zhuǎn)染液后在正常培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)5天左右，也沒有典型病毒斑形成(試驗(yàn)A、B、C)。但這并不意味病毒的死亡，如將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化懸浮后再接種新鮮CEF單層，又可顯出病毒空斑。在試驗(yàn)B和D中IFA陽(yáng)性病毒斑的比率幾乎在同一水平(0.2％及0.1％)，但由于在試驗(yàn)D中，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞單層繼續(xù)培養(yǎng)后直接可顯示大量病毒斑，因此試驗(yàn)D的轉(zhuǎn)染條件應(yīng)看作是最適宜條件。
5 免疫沉淀反應(yīng)按Yoshida S et al.(Virology，1994，200484-493)已報(bào)道的方式進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下經(jīng)感染了CVI988/Rispens克隆株和突變株CVI/rpp38或MDV超強(qiáng)毒株648-A的CEF單層平皿，在開始出現(xiàn)空斑時(shí)，傾去培養(yǎng)液，在用無血清無蛋氨酸DMEM培養(yǎng)液洗一次后，加入含35S-蛋氨酸(50μci/ml)的無蛋氨酸的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8小時(shí)后，在經(jīng)PBS液洗滌過的細(xì)胞單層上加入適量的溶細(xì)胞緩沖液(25mM Tris-HCl，pH7.5；150mM NaCl；0.1％SDS；1％去氧膽酸鈉；1％Triton X-100)。將經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞裂解液分別與單抗H19(Lee L F，X Liu，and R L Witter.J.Immunol.1983，1301003-1006)及MDV糖蛋白B的單抗BA4(Cui Z.et al. Monoclonal antibodiesagainst serotype 1-specific and groupcommon epitopes on theglycoprotein B of Marek′s disease viruses.InCurrent Research on Marek′sDiseasea，Silva R F. et al. Eds. Rose Printing company，Inc.，Tallahassee，F(xiàn)lorida，USA，1996，233-238)和IAN86(Lee LF，X Liu and RL Witter.J Immuno，1983，1301003-1006)反應(yīng)，并用葡萄球菌蛋白質(zhì)A-Sepharose CL-4B懸液(Pharmacia)吸附抗體抗原復(fù)和物，再在含SDS和2-巰基乙醇的10％聚丙烯酰胺凝膠中作電泳分離蛋白質(zhì)。
由圖2可見，在用35S-標(biāo)記的病毒感染細(xì)胞的溶解物作免疫沉淀反應(yīng)中，對(duì)MDV囊膜糖蛋白B的單抗BA4和IAN86可以從MDV的超強(qiáng)毒684-A株、CVI988/Rispens的克隆株及點(diǎn)突變CVI/rpp38株感染的CEF溶解物中識(shí)別出gp100、gp60和gp49復(fù)合體，且強(qiáng)度相同。這表明這三株病毒感染的CEF已被同位素同等水平標(biāo)記了。
單克隆抗體H19不能從CVI988/Rispens的克隆株感染細(xì)胞識(shí)別出任何條帶，但卻能從點(diǎn)突變的CVI/rpp38株桿感染細(xì)胞裂解物沉淀出典型的pp38復(fù)合體，如同對(duì)超強(qiáng)毒648-A株感染細(xì)胞一樣。
從免疫沉淀反應(yīng)還可看出，CVI988/Rispens克隆株與CVI/rpp38可與單抗BA4和IAN86產(chǎn)生的糖蛋白B抗原帶型完全相同，而不同于超強(qiáng)毒株648-A。而且CVI/rpp38與單抗H19產(chǎn)生的pp38復(fù)合體帶型也不同于MDV強(qiáng)毒株648-A。
6.雞體試驗(yàn)將經(jīng)幾乎同等細(xì)胞傳代次數(shù)的天然CVI988與重組CVI/rpp38分別接種三日齡SPF7×15系雜交雞(每羽約40,000pfu)，在感染后11天、17天和27天分別采血對(duì)GA株MDV感染的CEF作間接熒光抗體試驗(yàn)測(cè)定對(duì)MDV的抗體滴度。結(jié)果表明，感染了CVI/rpp38株重組病毒的雞對(duì)MDV的抗體反應(yīng)顯著延緩，且抗體滴度顯著低于天然疫苗毒CVI988感染雞。接種天然CVI988株的雞，在感染后10天即有部分雞出現(xiàn)抗MDV抗體，在16天時(shí)所有14只感染雞全部表現(xiàn)出抗MDV抗體，平均滴度為1∶86±29；在28天時(shí)達(dá)到1∶379±158；而接種CVI/rpp38的雞，在接種后10天沒有一只雞表現(xiàn)出MDV特異性抗體反應(yīng)，在20天時(shí)僅有個(gè)別雞產(chǎn)生很低的抗MDV抗體滴度，在28天時(shí)雖然所有雞都出現(xiàn)了抗體反應(yīng)，但其平均滴度僅為1∶65±33，顯著低于天然CVI988株感染雞(p＜0.001)。但接種了不同株病毒的雞在體重及胸腺、脾臟和法氏囊的重量無明顯差異。
應(yīng)用天然CVI988株及重組CVI/rpp38接種SPF雞后對(duì)抗MDV特異性抗體的滴度比較表明，重組病毒感染雞的抗MDV特異性抗體反應(yīng)受到顯著抑制，其滴度明顯低于天然CVI988病毒。而在這二株病毒間的唯一區(qū)別就是，在重組病毒CVI/rpp38中，其天然CVI988株的pp38基因被強(qiáng)毒株的pp38基因所取代，疫苗株CVI988的pp38基因不含有能為單抗H19所識(shí)別的抗原決定簇。這一試驗(yàn)不僅證明了強(qiáng)毒pp38能抑制對(duì)MDV的特異性免疫反應(yīng)，而且這一抑制作用與H19抗原決定簇相關(guān)。
感染了CVI/rpp38株重組病毒的雞對(duì)MDV的抗體反應(yīng)顯著延緩，且抗體滴度顯著低于天然疫苗毒CVI988感染雞，而且個(gè)體差異也相對(duì)較大(表1)這就可以把雞的不同個(gè)體對(duì)CVI/rpp38的體液抗體水平作為一種篩選指標(biāo)，即在抗病育種過程進(jìn)行其它性狀篩選的同時(shí)以此進(jìn)行對(duì)雞馬立克氏病病毒有抗病性的選育，選出對(duì)有雞馬立克氏病病毒有抗病性的雞個(gè)體，再經(jīng)同樣方法不斷篩選和培育而成。7 培育MDV弱毒疫苗株的可能本發(fā)明還包括在強(qiáng)毒型MDV的pp38基因上實(shí)施反方向突變，將有可能成功的致弱病毒，使之成為安全有效的MDV弱毒疫苗制苗毒株這一方法，即為利用突變法致弱MDV強(qiáng)毒并研制新型的基因工程疫苗這一潛在的應(yīng)用方法。
表1 接種CVI/rpp38及CVI988/Rispens后抗MDV抗體滴度分布接種后17天接種后27天接種病毒株1∶12 1∶25 1∶50 1∶100 1∶12 1∶25 1∶50 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800CVI988/ 0 2 1 11 0 0 0 1 2 10 1RispensCVI/rpp381 0 0 0 1 2 5 6 0 0 0注在接種CVI988/Rispens株后17天，所有14只雞都產(chǎn)生了不同滴度的抗MDV抗體，而在接種CVI/rpp38株后17天，在測(cè)試的14只雞中只有一只產(chǎn)生抗MDV抗體，這只雞可能對(duì)毒力型pp38的免疫抑制作用有一定抵抗力，因而其后代有可能對(duì)MDV也有較大的抵抗力。
表2 不同轉(zhuǎn)染條件對(duì)細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染和重組效率的影響試驗(yàn)A 試驗(yàn)B 試驗(yàn)C 試驗(yàn)D轉(zhuǎn)染開始時(shí)間 感染病毒前 感 染 后 12 小 時(shí)轉(zhuǎn)染液LipofectAMINE45μl40μl 60μl35μlpHA25 DNA 4μg 4μg 6μg 8μg總量 2.5ml2.5ml 2.5ml2.5ml轉(zhuǎn)染持續(xù)時(shí)間 24hrs24hrs 24hrs12hrs在正常維持培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3天CEF單層 不好 不好 不好 良好MDV斑不明顯不明顯不明顯 約4,000個(gè)胰蛋白酶消化后盲傳至含新鮮CEF單層的96孔培養(yǎng)板1FA+孔22/9674/396 1/19219/192FA+斑33/30,000 275/120,000 2/60,000 52/60,000重組病毒陽(yáng)性率0.01％0.2％ 0.003％ 0.1％注1.在每次轉(zhuǎn)染中，將轉(zhuǎn)染的CVI988-CEF再感染含CEF的96-孔培養(yǎng)板并培養(yǎng)3天。待MDV病毒斑出現(xiàn)時(shí)，每塊96-孔板再接種于二塊96-孔板，后二塊板須孔-孔對(duì)應(yīng)，其中一塊用于IFA篩選，另一塊保留于培養(yǎng)箱中用于檢出的FA+重組病毒的相應(yīng)孔病毒保種。
2.出現(xiàn)FA+病毒斑的孔數(shù)/總檢查孔數(shù)。
3.FA+病毒斑數(shù)/檢查孔大約總病毒斑數(shù)(平均每孔病毒斑數(shù)×總檢查孔數(shù))。微生物的寄存本發(fā)明中的病毒-馬立克氏病病毒CVI/rpp38點(diǎn)突變株已于1997年12月11日寄存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0334圖注圖1.
用單抗H19篩選到的呈IFA陽(yáng)性的MDV點(diǎn)突變株CVI/rpp38在CEF單層上形成的病毒斑。在普通光顯微鏡下，其周圍還可見許多病毒斑，但在紫外光下，均呈IFA陰性反應(yīng)。
圖2.
35S-蛋氨酸標(biāo)記物的免疫沉淀反應(yīng)。MDV的超強(qiáng)毒648-A株(A)、突變株CVI/rpp38(B)和CVI988/Rispens的克隆株(C)感染的CEF的裂解物分別與抗MDV糖蛋白B的單抗BA4和抗I型MDV的pp38單抗H19表現(xiàn)出不同的帶型。
圖3.
在3日齡接種突變株CVI/rpp38(實(shí)線)和天然CVI988/Rispens株(點(diǎn)虛線)MDV-CEF后，雞血清中抗MDV的熒光抗體滴度動(dòng)態(tài)序列目錄1.馬立克氏病病毒強(qiáng)毒GA株的pp38基因ORF的編碼序列(堿基1-870編碼290個(gè)氨基酸，隨后兩個(gè)相隔的終止編碼子，共879個(gè)堿基)根據(jù)Cui et al.Journal of Virology，1991，65(12)6509-6515.
2.馬立克氏病病毒強(qiáng)毒GA株的pp38的氨基酸序列(共290個(gè)氨基酸的多肽)根據(jù)Cui et al.Journal of Virology，1991，65(12)6509-65153.馬立克氏病病毒人工致弱毒R2株的pp38基因ORF的編碼序列(堿基1-870編碼290個(gè)氨基酸，隨后兩個(gè)相隔的終止編碼子，共879個(gè)堿基)根據(jù)Cui et al.Journal of Virology，1991，65(12)6509-65154.馬立克氏病病毒人工致弱毒R2株的pp38的氨基酸序列(共290個(gè)氨基酸的多肽)根據(jù)Cui et al.Journal of Virology，1991，65(12)6509-65155.馬立克氏病病毒疫苗弱毒CVI988/Rispens株的pp38基因ORF的編碼序列(堿基1-870編碼290個(gè)氨基酸，隨后兩個(gè)相隔的終止編碼子，共879個(gè)堿基)根據(jù)Endoh et al.Journal of Veterinary Medical Science，1994，56(5)823-826
6.馬立克氏病病毒疫苗弱毒CVI988/Rispens株的pp38的氨基酸序列(共290個(gè)氨基酸的多肽)根據(jù)Endoh et al.Journal of Veterinary Medical Science，1994，56(5)823-826.
7.本發(fā)明中的馬立克氏病病毒疫苗弱毒CVI988/Rispens株的點(diǎn)突變株CVI/rpp38株的pp38基因ORF的編碼序列8.本發(fā)明中的馬立克氏病病毒疫苗弱毒CVI988/Rispens株的點(diǎn)突變株CVI/rpp38株的pp38的氨基酸序列(共290個(gè)氨基酸的多肽)9.CVI/rpp38株病毒與其它病毒株pp38基因DNA序列差異位點(diǎn)10.CVI/rpp38株病毒與其它病毒株pp38氨基酸序列差異位點(diǎn)序列11 ATGGAATTCGAAGCAGAACACGAAGGGCTGACGGCGTCTTGGGTCGCCCCCGCTCCCCAG61 GGTGGAAAAGGGGCGGAGGGCCGCGCAGGGGTCGCCGACGAGGCAGGGCATGGGAAAACA121 GAAGCGGAATGCGCCGAGGACGGCGAGAAATGCGGGGACGCCGAGATGAGCGCTTTGGAT181 CGGGTCCAGAGGGACCGGTGGAGATTCAGTTCTCCGCCCCCTCACTCTGGAGTCACGGGG241 AAGGGGGCTATTCCAATAAAGGGTGATGGGAAGGCGATAGAATGCCAGGAGCTAACCGGA301 GAGGGAGAGTGGCTGTCACAGTGGGAGGAGCTACCGCCTGAGCCCCGGAGGTCAGGGAAT361 GAACATCTTGACGAAAGTCGGTATGCGAAACAAACCGAAAGGGGTAGCTCTACGGGGAAA421 GAAGAGGGAGATGGTATGAAGCAGATGGGGGAGCTTGCCCAGCAGTGCGAAGGAGGAACA481 TATGCGGACTTGCTTGTCGAAGCAGAGCAAGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCATTAATG541 CTGGCCGAAAGACAAAACCCAAATATATTGGGGGAGCATTTGAATAAAAAACGGGTTCTT601 GTACAACGACCCCGTACTATTCTATCCGTGGAGTCAGAGAATGCAACAATGCGTTCTTAT661 ATGCTGGTTACATTGATCTGTTCTGCAAAATCATTATTACTAGGATCGTGCATGTCATTT721 TTCGCTGGTATGTTAGTCGGTAGAACGGCAGACGTAAAAACACCATTATGGGATACTGTA781 TGTTTGTTAATGGCTTTCTGTGCAGGCATTGTCGTTGGGGGAGTGGATTCTGGGGAGGTG841 GAATCTGGAGAAACAAAATCTGAATCAAATTAA序列21 MEFEAEHEGLTASWVAPAPQGGKGAEGRAGVADEAGHGKTEAECAEDGEK51 CGDAEMSALDRVQRDRWRFSSPPPHSGVTGKGAIPIKGDGKAIECQELTG101 EGEWLSQWEELPPEPRRSGNEHLDESRYAKQTERGSSTGKEEGDGMKQMG151 ELAQQCEGGTYADLLVEAEQAVVHSVRALMLAERQNPNILGEHLNKKRVL201 VQRPRTILSVESENATMRSYMLVTLICSAKSLLLGSCMSFFAGMLVGRTA251 DVKTPLWDTVCLLMAFCAGIVVGGVDSGEVESGETKSESN序列31 ATGGAATTCGAAGCAGAACACGAAGGGCTGACGGCGTCTTGGGTCGCCCCCGCTCCCCAG61 GGTGGAAAAGGGGCGGAGGGCCGCGCAGGGGTCGCCGACGAGGCAGGGCATGGGAAAACA121 GAAGCGGAATGCGCCGAGGACGGCGAGAAATGCGGGGACGCCGAGATGAGCGCTTTGGAT181 CGGGTCCAGAGGGACCGGTGGAGATTCAGTTCTCCGCCCCCTCACTCTGGAGTCACGGGG241 AAGGGGGCTATTCCAATAAAGGGTGATGGGAAGGCGATAGAATGCCAGGAGCTAACCGGA301 GAGGGAGAGTGGCTGTCACAGTGGGGGGAGCTACCGCCTGAGCCCCGGAGGTCAGGGAAT361 GAACATCTTGACGAAAGTCGGTATGCGAAACAAACCGAAAGGGGTAGCTCTACGGGGAAA421 GAAGAGGGAGATGGTATGAAGCAGATGGGGGAGCTTGCCCAGCAGTGCGAAGGAGGAACA481 TATGCGGACTTGCTTGTCGAAGCAGAGCAAGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCATTAATG541 CTGGCCGAAAGACAAAACCCAAATATATTGGGGGAGCATTTGAATAAAAAACGGGTTCTT601 GTACAACGACCCCGTACTATTCTATCCGTGGAGTCAGAGAATGCAACAATGCGTTCTTAT661 ATGCTGGTTACATTGATCTGTTCTGCAAAATCATTATTACTAGGATCGTGCATGTCATTT721 TTCGCTGGTATGTTAGTCGGTAGAACGGCAGACGTAAAAACACCATTATGGGATACTGTA781 TGTTTGTTAATGGCTTTCTGTGCAGGCATTGTCGTTGGGGGAGTGGATTCTGGGGAGGTG841 GAATCTGGAGAAACAAAATCTGAATCAAATTAA序列41 MEFEAEHEGLTASWVAPAPQGGKGAEGRAGVADEAGHGKTEAECAEDGEK51 CGDAEMSALDRVQRDRWRFSSPPPHSGVTGKGAIPIKGDGKAIECQELTG101 EGEWLSQWGELPPEPRRSGNEHLDESRYAKQTERGSSTGKEEGDGMKQMG151 ELAQQCEGGTYADLLVEAEQAVVHSVRALMLAERQNPNILGEHLNKKRVL201 VQRPRTILSVESENATMRSYMLVTLICSAKSLLLGSCMSFFAGMLVGRTA251 DVKTPLWDTVCLLMAFCAGIVVGGVDSGEVESGETKSESN序列51 ATGGAATTCGAAGCAGAACACGAAGGGCTGACGGCGTCTTGGGTCGCCCCCGCTCCCCAG61 GGTGGAAAAGGGGCGGAGGGCCGCGCAGGGGTCGCCGACGAGGCAGGGCATGGGAAAACA121 GAAGCGGAATGCGCCGAGGACGGCGAGAAATGCGGGGACGCCGAGATGAGCGCTTTGGAT181 CGGGTCCAGAGGGACCGGTGGAGATTCAGTTCTCCGCCCCCTCACTCTGGAGTCACGGGG241 AAGGGGGCTATTCCAATAAAGGGTGATGGGAAGGCGATAGAATGCCAGGAGCTAACCGGA301 GAGGGAGAGTGGCTGTCACGGTGGGGGGAGCTACCGCCTGAGCCCCGGAGGTCAGGGAAT361 GAACATCTTGACGAAAGTCGGTATGCGAAACAAACCGAAAGGGGTAGCTCTACGGGGAAA421 GAAGAGGGAGATGGTATGAAGCAGATGGGGGAGCTTGCCCAGCAGTGCGAAGGAGGAACA481 TATGCGGACTTGCTTGTCGAAGCAGAGCAAGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCATTAATG541 CTGGCCGAAAGACAAAACCCAAATATATTGGGGGAGCATTTGAATAAAAAACGGGTTCTT601 GTACAACGACCCCGTACTATTCTATCCGTGGAGTCAGAGAATGCAACAATGCGTTCTTAT661 ATGCTGGTTACATTGATCTGTTCTGCAAAATCATTATTACTAGGATCGTGCATGTCATTT721 TTCGCTGGTATGTTAGTCGGTAGAACGGCAGACGTAAAAACACCATTATGGGATACTGTA781 TGTTTGTTAATGGCTTTCTGTGCAGGCATTGTCGTTGGGGGAGTGGATTCTGGGGAGGTG841 GAATCTGGTGAAACAAAATCTGAATCAAATTAA序列61 MEFEAEHEGLTASWVAPAPQGGKGAEGRAGVADEAGHGKTEAECAEDGEK51 CGDAEMSALDRVQRDRWRFSSPPPHSGVTGKGAIPIKGDGKAIECQELTG101 EGEWLSRWGELPPEPRRSGNEHLDESRYAKQTERGSSTGKEEGDGMKQMG151 ELAQQCEGGTYADLLVEAEQAVVHSVRALMLAERQNPNILGEHLNKKRVL201 VQRPRTILSVESENATMRSYMLVTLICSAKSLLLGSCMSFFAGMLVGRTA251 DVKTPLWDTVCLLMAFCAGIVVGGVDSGEVESGETKSESN序列71 ATGGAATTCGAAGCAGAACACGAAGGGCTGACGGCGTCTTGGGTCGCCCCCGCTCCCCAG61 GGTGGAAAAGGGGCGGAGGGCCGCGCAGGGGTCGCCGACGAGGCAGGGCATGGGAAAACA121 GAAGCGGAATGCGCCGAGGACGGCGAGAAATGCGGGGACGCCGAGATGAGCGCTTTGGAT181 CGGGTCCAGAGGGACCGGTGGAGATTCAGTTCTCCGCCCCCTCACTCTGGAGTCACGGGG241 AAGGGGGCTATTCCAATAAAGGGTGATGGGAAGGCGATAGAATGCCAGGAGCTAACCGGA301 GAGGGAGAGTGGCTGTCACAGTGGGAGGAGCTACCGCCTGAGCCCCGGAGGTCAGGGAAT361 GAACATCTTGACGAAAGTCGGTATGCGAAACAAACCGAAAGGGGTAGCTCTACGGGGAAA421 GAAGAGGGAGATGGTATGAAGCAGATGGGGGAGCTTGCCCAGCAGTGCGAAGGAGGAACA481 TATGCGGACTTGCTTGTCGAAGCAGAGCAAGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCATTAATG541 CTGGCCGAAAGACAAAACCCAAATATATTGGGGGAGCATTTGAATAAAAAACGGGTTCTT601 GTACAACGACCCCGTACTATTCTATCCGTGGAGTCAGAGAATGCAACAATGCGTTCTTAT661 ATGCTGGTTACATTGATCTGTTCTGCAAAATCATTATTACTAGGATCGTGCATGTCATTT721 TTCGCTGGTATGTTAGTCGGTAGAACGGCAGACGTAAAAACACCATTATGGGATACTGTA781 TGTTTGTTAATGGCTTTCTGTGCAGGCATTGTCGTTGGGGGAGTGGATTCTGGGGAGGTG841 GAATCTGGTGAAACAAAATCTGAATCAAATTAA序列81 MEFEAEHEGLTASWVAPAPQGGKGAEGRAGVADEAGHGKTEAECAEDGEK51 CGDAEMSALDRVQRDRWRFSSPPPHSGVTGKGAIPIKGDGKAIECQELTG101 EGEWLSQWEELPPEPRRSGNEHLDESRYAKQTERGSSTGKEEGDGMKQMG151 ELAQQCEGGTYADLLVEAEQAVVHSVRALMLAERQNPNILGEHLNKKRVL201 VQRPRTILSVESENATMRSYMLVTLICSAKSLLLGSCMSFFAGMLVGRTA251 DVKTPLWDTVCLLMAFCAGIVVGGVDSGEVESGETKSESN序列9**GA株 #319 CAG-TGG-GAG #327R2株 CAG-TGG-GGGCVI988/Rispen8CGG-TGG-GGGCVI/rpp38 CAG-TGG-GAG序列10* *GA株 #105 S-Q-W-E-E #109R2株 S-Q-W-G-ECVI988/RispensS-R-W-G-ECVI/rpp38 S-Q-W-E-E
權(quán)利要求
1 一種自然界尚不存在的MDV弱毒，其特征在于它是通過重組DNA技術(shù)而在基因組中導(dǎo)入點(diǎn)突變而得到MDV弱毒株，命名為CVI/rpp38(1997年12月11日已送藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO.0334)。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDV，其特征在于它具有與疫苗弱毒CVI988的完全相同的病毒囊膜蛋白B帶型而不同于強(qiáng)毒株病毒。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDV，其特征在于它含有能為單克隆抗體H14所識(shí)別的與強(qiáng)毒型pp38抗原一樣的抗原決定簇。
4 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDV，其特征在于它的基因組序列中第319～327是與強(qiáng)毒GA株相同，即為CAG-TGG-GAG，而不同于弱毒CVI988/Rispens株的CGG-TGG-GGG。
5 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDV，其特征在于它的氨基酸序列中第105～109是與強(qiáng)毒GA株相同，即為S-Q-W-E-E，而不同于弱毒CVI988/Rispens株的S-R-W-G-E。
6 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDV，其特征在于用它感染雞后雞對(duì)MDV的抗體反應(yīng)顯著延緩，且抗體滴度顯著低于天然疫苗毒CVI988感染雞。
7 一種可用于MD抗病育種雞的篩選方法，其特征在于它含有根據(jù)權(quán)利1～6的一種病毒。
8 一種可用于MDV強(qiáng)毒致弱的方法，它包括在致弱過程中采用獲得權(quán)利要求1～6所述MDV弱毒的點(diǎn)突變技術(shù)在強(qiáng)毒型MDV的pp38基因上實(shí)施反方向突變的技術(shù)。
全文摘要
經(jīng)定向點(diǎn)突變獲得的重組雞馬立克氏病病毒弱毒株CVI/rpp38。用
文檔編號(hào)A61P31/00GK1196390SQ97125858
公開日1998年10月21日 申請(qǐng)日期1997年12月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月26日
發(fā)明者崔治中, L·李 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)