專利名稱：一種功能食品免疫牛奶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種功能食品免疫牛奶，本發(fā)明還涉及一種制備免疫牛奶的方法，具體涉及以免疫方法生產具有抗病毒和抗幽門螺旋桿菌免疫能力的功能性食品免疫牛奶的方法，屬于食品領域。
牛奶的營養(yǎng)價值與健身美容價值自古以來一直為人類所重視。在現代生活中，為了提高牛奶的飲用價值與營養(yǎng)價值，特別是因中小學生與老年人的需要，更注重了提高保健價值的研究，在口味、品種與方法上精益求精。以生物科技研制的免疫牛奶，成為當今食品科技的基本方向，是世紀交替時代的最新科技成果。
對于免疫牛奶的研究，經歷了多年的探索與實踐過程。Sharpe-SJ等人以一種多價疫苗為抗原，反復免疫奶牛制成了一種可以降低血漿膽固醇及血壓的脫脂免疫奶粉；Ishda-A等人以各種人類腸道桿菌，包括E.Coli,S.typhimurium,S.dysenteriae等26種細菌，為抗原，免疫奶牛，用所得的免疫牛奶讓AKR/J小鼠口服，結果表明這種免疫牛奶可以減少細菌從腸道侵襲到其他器官中的數目，加強同腸道相關的淋巴組織對抗腸道細菌侵襲的能力。EP0143345公開了一種超免疫牛奶，可用于治療心血管疾病和肺部疾病。EP0330521公開了一種抗高血壓的免疫牛奶，該文獻是利用常規(guī)的生物化學方法從牛奶中分離抗高血壓因子的方法。盡管以往對免疫牛奶進行了多方面的研究，但是，對免疫牛奶的研究多數只停留在單疫苗免疫或“雙抗法”免疫的方法上，實踐證明，單個疫苗免疫后效果不佳，產生的抗體主要集中在血液中，乳液中抗體含量不高，所制備的免疫牛奶不能達到實用商業(yè)價值。而且，到目前為止，尚未見有關使用采自人體的甲肝、乙肝病毒和幽門螺旋桿菌作為復合抗原來制備免疫牛奶的文獻報道。特別是，幽門螺旋桿菌的發(fā)現，對治療該細菌相關性疾病，如胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌等，產生了重大的技術性突破，然而，由于幽門螺旋桿菌的特殊生長環(huán)境，到目前為止，也沒有找到一種能夠對幽門螺旋桿菌具有特異性的抗菌素，來有效的殺死該細菌，給該細菌相關性疾病的治療帶來了許多困難。尋求一種對幽門螺旋桿菌有免疫特異性的活性物質是一種較好的治療途徑。
幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,HP)是一種螺旋型的革蘭氏陰性微需氧菌，存在于人類的胃部。這種細菌經口侵入人體后存在于胃粘膜上皮表面的粘液層中，能直接穿透這層粘液層粘附于下面的上皮細胞，存活多年甚至使宿主終生攜帶，在我國感染率達70％以上。在臨床及流行病學上具有重要意義。
在HP中，有一種大分子蛋白位于其表面，即表面暴露蛋白，也就是幽門螺旋桿菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP),OMP除起到結構作用外，還決定著細菌的活性性質，例如，擔負著決定什么物質可以進入細菌，什么物質可以分泌出細胞，以及細菌同它所在環(huán)境的相互作用等方面的重要作用，而且，OMP具有較強的免疫原性。尤其是HP外膜蛋白具有抑制人類白細胞趨化的作用，從而干擾機體的免疫功能，這是HP的真正致病機理。HP是通過一種粘附素緊緊地粘附于人胃上皮細胞表面，尤其特異性地粘附于含有甘油脂的受體表面，無粘附素的HP菌株則不象有粘附素的那樣粘附緊密，而這粘附素就是OMP成分之一。因此，具有HP特異性抗原的制備非常重要，不僅在HP感染的特異性血清學診斷上有巨大價值，而且在研究HP致病機理，以致于HP免疫制劑的制備也具有重大意義。但是，在HP菌株表面抗原中存在著與空腸彎曲菌的交叉抗原，在組織學檢菌和細菌培養(yǎng)的正確性，特別是在HP免疫制劑的制備應用上，受到很大影響。研究表明，第一代全菌抗原和第二代超聲粉碎抗原均易與空腸彎曲菌等成分發(fā)生交叉反應，因此，目前在提取HP種特異性純化抗原方面存在一定的難度，限制了幽門螺旋桿菌疫苗的制備，也給具有抗HP活性的免疫牛奶的制備帶來了困難。到目前為止，還沒有一種能夠有效的抗HP免疫制劑，也沒有一種抗HP的免疫牛奶問世。
本發(fā)明目的是克服現有技術的缺陷，提供一種能夠有效地抵抗甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒以及幽門螺旋桿菌的免疫牛奶；本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述抵抗甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒以及幽門螺旋桿菌的免疫牛奶的方法；本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備幽門螺旋桿菌純化抗原的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備免疫牛奶所用的復合疫苗的制備方法。
本發(fā)明免疫牛奶的制備技術方案包括如下步驟一、奶牛質量的挑選選擇一至二胎，產后一至二個月的健康并強壯的奶牛，須有防疫證明。特別注意間隔開每頭牛的平均干奶期。一般要求奶牛的牛奶日產量不小于15-25KG。
二、飼養(yǎng)場的要求符合衛(wèi)生防疫的要求；飼料充足，新鮮；水質、空氣、飼料無污染；有足夠的陽光與空地；牛舍衛(wèi)生，水源充足，排泄沖洗系統良好；通風、冬天保暖；有實驗室。
三、復合疫苗的制備(一)、乙肝抗原的制備因為乙肝病毒(BHV)目前還不能進行細胞培養(yǎng)，我們的乙肝疫苗制備采用常規(guī)方法。
由人類無癥狀HBsAg攜帶者血漿提取HBsAg，菌種的篩選與純化非常重要，完全排除外來的和潛在的病毒及各種微生物，經純化、提煉、層析，除去人血漿蛋白質，純化出HBsAg，再進行滅活，最后加佐劑吸附后制成，濃度為10-30微克/ML。其基本工藝流程如下人類無癥狀HBsAg攜帶者血漿----除纖維蛋白----硫酸銨沉淀----等密度區(qū)帶離心----速率區(qū)帶離心----胃蛋白酶消化----滅活----吸附----防腐----疫苗。
(二)、甲肝抗原的制備(1)、于甲肝爆發(fā)點篩取甲肝患者，篩取甲肝IgM檢測陽性者，于急性黃膽出現前，取其糞便。
(2)、以PBS洗滌液制成懸液，以PBG沉淀，以差速離心進行抽提，再以超高速離心沉淀，以50倍濃縮于PBS中。
(3)、以上初步純化的提取物直接在分離培養(yǎng)基上劃線接種。于牛心、牛腦浸出液瓊脂培養(yǎng)，在37℃微需氧條件(75％N2,15％O2,10％CO2)飽和濕度下吸附培養(yǎng)2小時，然后用2％小牛血清及1％乳清蛋白維持。置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(4)、連續(xù)培養(yǎng)5周，每周換維持液一次，最后去維持液，用胰蛋白-EDTA液消化。細胞被離心收集后，以超聲破殼處理，抽提HAV。
(5)、以上方法連續(xù)傳15代。每代以直接免疫熒光監(jiān)視HAV病毒的增值。
(6)、以后用32℃繼續(xù)連續(xù)再培養(yǎng)5代。
(7)、將上述病毒菌株接種于人胚肺二倍體細胞中，置32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每28天傳一代，連續(xù)傳5代。得甲型肝炎病毒H2減毒株。將病毒減毒菌株凍存在-70℃培養(yǎng)基中。
實驗證明，用以上方法制取的甲肝減毒疫苗，已不能引起肝細胞病變，失去口服感染的能力，毒力已幾乎不存在。人與動物接觸后，血清谷丙轉氨酶均無異常升高，證明以上疫苗是相當安全的。但卻具有相當強的免疫原性，能誘導抗體產生，是一種較為理想的，實用的甲肝免疫疫苗。而且，遺傳性相當穩(wěn)定，連續(xù)傳代不發(fā)生返祖現象。
將上述甲肝病毒減毒株于人胚肺二倍體細胞中連續(xù)培養(yǎng)2代，溶于含氨基酸的鹽平衡溶液中，再經純化，抽提，消毒，最后制得甲肝疫苗。
(三)、幽門螺旋桿菌抗原的制備1、試劑、材料、儀器A、培養(yǎng)基(1)、牛心、牛腦浸出液瓊脂(2)、WCG無血培養(yǎng)基(3)、空腸彎曲菌選擇性瓊脂基礎(4)、胎兒彎曲桿菌瓊脂基礎(Campylobacter AgarBase)以上2、3、4培養(yǎng)基均為美國Sigma公司及美國BIORAD等公司產品。
B、菌株HP菌株來自胃鏡活檢標本的分離培養(yǎng)，包括慢性胃炎和消化性潰瘍病例。
C、試劑(1)、分子量標準蛋白(17.5-94KD)(2)、三羥甲基氨基甲烷(3)、三硝基甲苯(4)、辛基吡喃葡糖苷
(5)、十二烷基肌氨酸鈉(6)、EDTA乙二氨四乙酸(7)、Tween-20 TEMED烯酰氨，雙撐丙烯酰氨(8)、硫酸氨、氯化鈉、PBS洗滌液等。
(9)、抗生素組合(萬古霉素、二性霉素、TMP、多粘菌素B等)D、儀器電泳槽與電泳儀、分光光度計、離心機、磁力攪拌機、恒溫水浴儀等。
2、菌株與培養(yǎng)條件HP分離培養(yǎng)的關鍵在于及時處理標本，培養(yǎng)基和微需氧培養(yǎng)條件的選擇。
培養(yǎng)基利用腦、心浸出液的血瓊脂固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為自制培養(yǎng)基，其基本組成為利用新鮮小牛腦、心組織，其比例為6∶4，粉碎，勻漿，超聲粉碎后過濾，6000轉15分鐘離心取上清液)加入10％的小牛血清，瓊脂粉(瓊脂干粉0.5％)，加熱，在未凝結前加入以下物質，物質數量為總量的10％左右半胱氨酸、蛋白胨及抗生素組合，所述的抗生素組合是在1604常規(guī)培養(yǎng)液(其比例為每1000ml中加入L-精氨酸 200mgL-組氨酸 15mgL-天冬酰胺50mg L-天冬氨酸 20mgL-胱氨酸 50mg L-羥基脯氨酸 20mgL-谷氨酸 20mg L-谷酰氨 300mg谷胱甘肽 1.0mg甘氨酸 10mgL-異白氨酸50mg L-白氨酸 50mgL-賴氨酸鹽酸鹽40mg L-蛋氨酸 15mgL-苯基代丙氨酸15mg L-脯氨酸 20mgL-絲氨酸 30mg L-蘇氨酸 20mgL-色氨酸 5mg L-酪氨酸 20mgL-異戊氨酸20mg 維生素H 0.2mg泛酸鈣0.25mg 膽堿 3mg葉酸 1mg i-肌醇 35mg
淤酰胺1mg 對氨基安息香酸 1mg鹽酸維生素B6 1mg 核黃素 0.2mg鹽酸硫胺素1mg KCL 400mgCuCL 600mg硝酸鈣 100mg磷酸氫鈉 1512mg 硫酸鎂 100mg葡萄糖2000mg 酚紅 5mg以上組合以干冰或CO2調節(jié)PH值到7-7.2為止。)中再加入總量為5％-10％的萬古霉素(約10％)，二性霉素(20％)，TMP(5％)，多粘菌素B(55％)。在空腸彎曲菌選擇性瓊脂基礎，WCG無血培養(yǎng)基和胎兒彎曲桿菌瓊脂基礎(CampylobacterAgarBase)中補充以10％馬血和羊血，抗生素組合(組成同上)。制成平板后，置4℃冰箱待用。
將活檢組織直接在分離培養(yǎng)基(即以上培養(yǎng)基)上劃線接種。在37℃微需氧條件(85％N2,10％O2,5％CO2)飽和濕度下培養(yǎng)72小時，菌株凍存在-2℃含15％甘油的布氏肉湯培養(yǎng)基中。
在無菌條件下，用棉簽輕輕刮取血平板表面的HP洗在0.05M的PBS(PH7.1)液體中，離心3000r/min×10min，用PBS洗滌3-4次，備用。
3、粗提全菌蛋白取HP備用菌離心2000轉/分×15分，去上清液，加入20ml0.05M PBS使細菌充分懸浮后，移至燒杯中，水浴震蕩，緩慢滴加約2ml 10％的SDS，至菌液澄清透亮后，置于冰浴中進行超聲粉碎(300mA×1分鐘，間隔1分鐘，4-5次)，離心8000r/min×20min，取上清液。以紫外分光光度計檢測上清液中蛋白含量(OD260及OD280)，按下面公式計算其濃度(mg/ml)。
C(蛋白)=1.45×OD280-0.74×OD260加入等量甘油分裝，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 4、外膜蛋白的制備(純化外膜蛋白OMP)ODG(辛基吡喃葡糖苷)提取取HP備用菌培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)方法是按常規(guī)培養(yǎng)條件，即取上述粗提的全菌蛋白，加等量1604培養(yǎng)液，無菌條件下，恒溫37℃培養(yǎng)。用PBS洗滌，離心沉淀后使之懸浮于0.6％W/L ODG(辛基吡喃葡糖苷)中，震蕩1小時提取外膜蛋白，離心2次6000r/min×15分鐘，取上清液，二次取得的上清液相加再離心30000r/min×30分鐘，在取上清液，加入硫酸銨至5％濃度，4℃過夜孵育離心35000r/min×25分鐘，取沉淀懸浮于含0.15M NaCL的0.05M三羥甲基氨基甲烷中。
5、硫酸銨分段鹽析將提取的外膜蛋白進行提純，提純方法如下用0.05M PBS(PH7.2條件)稀釋蛋白質，緩慢加入硫酸銨，同時用磁力攪拌機攪拌，4℃過夜，離心2000r/min×30分鐘，取上清液。按1∶0.5-1∶1的比例加入0.05M PBS溶解，再次以硫酸銨按不同的飽和度(最終飽和度分別為30％,50％,80％,100％)進行鹽析，分別取得不同純度的外膜蛋白。(鹽析按下表)
測定OD260及OD280，按上述公式計算蛋白含量，分別為2.4mg/ml,3.2mg/ml,3.8mg/ml，和1.1mg/ml。加入等量滅菌甘油分裝后置-20℃?zhèn)溆谩?br> 6、蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)采用SDS-PAGE不連續(xù)緩沖系統，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％。
取以上粗提全菌蛋白及以上四種濃度的外膜蛋白各15μl，加入等量2×SDS樣品緩沖液，蛋白最終濃度分別為1.2mg/ml,1.6mg/ml,1.9mg/ml，和0.6mg/ml，混勻后置100℃水浴3-5分鐘。采用Tris-甘氨酸緩沖系統恒流電泳，濃縮膠20mA，分離膠30mA，待溴酚藍指示劑移至凝膠下緣1cm處，終止電泳，染色后，觀測結果如下HP全菌蛋白的不同菌株超聲粉碎后經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，共有7條主要蛋白條帶，其分子量分別為128KD,74KD,64KD,61KD,43KD,34KD,31KD和12KD。次要蛋白條帶略有差異。但具有HP特異免役原性的抗原只有61KD,48KD與31KD。因此，未經提純的HP全菌蛋白特異性不強。
而提取的HP外膜蛋白(OMP)經SDS-PAGE結果顯示，純化的OMP只含有分子量為31KD和61KD二條主要蛋白帶。并且其主要蛋白帶61KD不與空腸彎曲菌發(fā)生交叉反應，具有HP外膜蛋白特異抗原性。
將提取的OMP蛋白液和粗提的全菌蛋白作CLO試驗，可知也包含了尿素酶成分。證實了是HP外膜蛋白的有效成分。
7、將提純的HP菌OMP抗原，于56℃1小時水浴滅活，飽和硫酸氨溶液沉淀，透析后低溫(4-6℃)保存?zhèn)溆谩?br> (四)復合疫苗的制備將羊毛脂與石蠟油按3∶1混合，然后取與抗原體積總量相等的體積比例倒入研缽，逐步磨進抗原。甲肝、乙肝抗原各約60-90μg，最后加進幽門螺旋桿菌抗原300-500μg，同樣磨合?？乖偭康捏w積總共約7-10ml，制成不完全佐劑。最后按總體積的約2％研磨進結核菌或卡介苗與同體積的多聚核苷酸、水楊酸、鎂鹽，制成完全佐劑。最后組成復合疫苗制劑，并必須在6小時內使用完畢，備用時儲存于4-6℃冰箱中。
四、奶牛的免疫學處理將制備好的復合疫苗于奶牛頸部頸椎兩邊分3-4點皮下注射。
第一階段每隔7-10天進行一次注射，這一過程延續(xù)4-5次。然后休息約45天。
第二階段再按每隔7-10天連續(xù)二次注射等量的不含佐劑的抗原疫苗。最后一次注射后第9天采樣檢測。如合格即可進入正常生產。
如不合格，休息一個月，再按第二階段進行一次注射，檢測再不合格，則認為牛的體質與免疫反應的個體差異，此牛只能淘汰。
五、免疫牛奶中活性物質效價檢測采用酶標法檢測。
1、試劑1)、包被緩沖劑(PH9.6)Na2CO31.59克
NaHCO32.93克蒸餾水 1000毫升2)、洗滌液1M Tris(24.2克/200毫升)10毫升1M Hcc 8.4毫升吐溫-200.25毫升蒸餾水 500毫升3)、稀釋液Ha2HPO412H2O 2.9克KH2PO40.2克NaCL 8.5克吐溫-200.5毫升卵蛋白 1-5毫克蒸餾水至 1000毫升4)、底物溶液0.05M檸檬酸(2.1克/200毫升) 48.6毫升0.1MNa2HPO4(7.0毫克/200毫升)51.4毫升3％雙氧水 100微升鄰苯二胺 40毫克5)、2M H2SO42、包被抗原甲肝抗原；乙肝抗原；幽門螺旋桿菌抗原；用包被液緩沖稀釋(最好用96孔進口酶標板包被)，4℃過夜。包被這一步一定不能省。用作對照的普通白奶也須在冰箱內過夜。
其中免疫奶與對照組普通白奶的稀釋用稀釋劑，最好先按1∶10稀釋，充分攪拌，再按比例繼續(xù)稀釋；乙肝抗原濃度為10MG/ML，實用為200微升乙肝抗原加包被液至2毫升；甲肝抗原濃度為10MG/ML，實用為200微升乙肝抗原加包被液至2毫升；幽門螺旋桿菌抗原濃度為0.026MG/ML，實用為50微升幽門螺旋桿菌抗原加包被液至2毫升。
第二天用洗滌液洗板二至三次。用卵清蛋白(1-2％)封閉。每孔300微升。過夜。
用洗滌劑洗板二至三次，把免疫奶充分搖勻。洗清后將免疫奶作一抗加入。按比例稀釋的免疫奶，與對照組的按同比例稀釋的普通白奶，均用稀釋劑稀釋，稀釋比例一般按1∶10；1∶20；1∶40；1∶80；1∶160；1∶320；1∶640等按比例上去。充分攪拌，每孔100微升，37℃溫浴1-1.5小時。
用洗滌劑洗板二至三次，加二抗(羊抗牛辣根標記的，或兔抗牛的都可以，1∶1000稀釋，可從市場上獲得)每孔100微升，37℃溫浴1-1.5小時。
用洗滌劑徹底洗板，三次以上，加底物溶液(鄰苯二胺)100微升/孔，37℃溫浴30分鐘。
終止，用2M硫酸，50微升/孔。讀板，波長492MM。
計算樣品實測OD平均數除以對照組按同比例稀釋白奶的OD平均數，得出相對活性效價數。相對活性效價數大于1.2為陽性，大于1.5為合格。
六、免疫牛奶的正常生產每次免疫學處理后第8天開始至第9天結束，是免疫奶牛乳汁中對抗對應抗原的抗體(即各種特異性免疫活性球蛋白)的生成峰值期，也就是免疫牛奶的采集期。
每次免疫學處理的間隔周期為10天以上。也就是說，當正常生成時，每10天中有2天可以采集到符合標準的免疫牛奶。非峰值期采集的牛奶一般不符合標準。
七、免疫牛奶的采集、儲運、消毒、保存按甲級牛奶的國際規(guī)定，牛奶離體2小時內必須進行快速冷凍處理。如果不具備此條件，盡可能做到牛奶離體后盡快風吹散熱，并盡快分裝進入冰箱(4℃)，在4℃條件下，不超過10小時內進行同位素輻射，輻射強度一般在4K左右。輻射后的牛奶效價要跌去5-10％。
八、免疫牛奶的混合、消毒、均質。
按照上述方法生產的免疫牛奶，稱作免疫原乳，免疫原乳須經稀釋才能形成產品，而稀釋是以同類產品普通牛奶按需要以一定比例稀釋。稀釋比例一般為1∶1-1∶1000，優(yōu)選為1∶10-1∶1000，更優(yōu)選為1∶100-1∶1000。由生產廠家決定，只要求消毒時按常規(guī)牛奶巴氏消毒法，120℃時不超過半分鐘(常規(guī)為4秒)。效價跌去不會超過10％，能達到免疫牛奶的監(jiān)測規(guī)范的基本要求。
本發(fā)明生產的免疫牛奶其優(yōu)點為抗病毒特別是抗腸道病毒，包括甲肝及乙肝病毒。長期服用，可有效的抵御與降低甲型及乙型肝炎特別是肝癌的發(fā)病率，對其他病毒性疾病也有抗病毒作用。
抗幽門螺旋桿菌長期服用，可有效地抵御與降低胃炎、消化性潰瘍，特別是胃癌的發(fā)病率。任何胃炎，消化性潰瘍，胃癌患者均有減輕癥狀的作用。本發(fā)明由于采用特定的工藝，制備的幽門螺旋桿菌抗原純度高，純化的HP外膜蛋白具有較強的有效的HP特異抗原性，與空腸彎曲菌無交叉反應，因此，所生產的免疫牛奶能夠特異性地有效地預防與治療幽門螺旋桿菌相關性疾病，如消化性潰瘍等。
免疫活性強本發(fā)明采用“復合疫苗-多次免疫疫苗接種法”，提高了牛奶中活性物質的含量。實踐證明單個疫苗免疫后效果不佳，產生的抗體主要集中在血液中，乳液中的抗體含量不高。不能進行工業(yè)化生產而產生商業(yè)價值。由于本發(fā)明的復合疫苗相互間的作用與復雜的生理反應，乳液中抗體的含量大幅上升，免疫效價提高，達到商業(yè)價值。由于本發(fā)明采用多次疫苗接種法，使奶牛接受反復刺激，不斷加強抗體的產生，比一般的疫苗接種法能得到更高濃度的免疫牛奶。
本發(fā)明的復合疫苗具有以下優(yōu)點一是可將幾種抗原聚合成大分子顆粒，激發(fā)巨噬細胞吞噬，增強免疫作用；二是油性的佐劑研磨水性的抗原，實行油包水，可在局部延緩吸收，刺激作用較持久，從而不斷產生免疫作用；三是本發(fā)明所使用的佐劑，本身又稱免疫誘出劑，可直接興奮網狀內皮系統，激活免疫活性細胞，增加抗原的免疫原性。
實施例第一步，制備復合疫苗將羊毛脂與石蠟油按3∶1混合，然后取與抗原體積總量相等的體積比例倒入研缽，逐步磨進抗原。甲肝、乙肝抗原各約60-90μg，最后加進幽門螺旋桿菌抗原300-500μg，同樣磨合。抗原總量的體積總共約7-10ml，制成不完全佐劑。最后按總體積的約2％研磨進結核菌或卡介苗與同體積的多聚核苷酸、水楊酸、鎂鹽，制成完全佐劑。最后組成復合疫苗制劑，備用儲存于4-6℃冰箱中。
第二步，奶牛的免疫學處理將制備好的復合疫苗于奶牛頸部頸椎兩邊分3-4點皮下注射。
第一階段每隔7-10天進行一次注射，這一過程延續(xù)4-5次。然后休息約45天。
第二階段再按每隔7-10天連續(xù)二次注射等量的不含佐劑的抗原疫苗。最后一次注射后第9天采樣檢測。
第三步，采集免疫原乳在每次免疫學處理后第8天開始至第9天結束，采集符合標準的免疫牛奶。按甲級牛奶的國際規(guī)定，牛奶離體2小時內進行快速冷凍處理。
第四步，免疫牛奶的混合、消毒、均質。
按照上述方法生產的免疫原乳，按1∶1000比例用普通白奶進行稀釋，按常規(guī)牛奶巴氏消毒法，120℃常規(guī)消毒4秒。制得達到免疫牛奶監(jiān)測規(guī)范基本要求的免疫牛奶。
權利要求
1.一種免疫牛奶，其特征在于它含有抗甲型肝炎抗體、抗乙型肝炎抗體和抗幽門螺旋桿菌的抗體。
2.根據權利要求1所述的免疫牛奶，其特征在于它是以甲型肝炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗和幽門螺旋桿菌疫苗組成的復合疫苗免疫奶牛而制備的免疫牛奶。
3.根據權利要求2所述的免疫牛奶，其特征在于它是以復合疫苗多次給奶牛接種而制得的免疫牛奶。
4.根據權利要求3所述的免疫牛奶，其特征在于它是以復合疫苗按照下述方法免疫接種奶牛而制得的牛奶將制備好的復合疫苗于奶牛頸部頸椎兩邊分3-4點皮下注射；第一階段每隔7-10天進行一次注射，延續(xù)4-5次，然后休息約45天；第二階段再按每隔7-10天連續(xù)二次注射等量的不含佐劑的抗原疫苗，最后一次注射后第9天采樣檢測；在每次免疫學處理后第8天開始至第9天結束，采集符合標準的免疫原乳。
5.根據權利要求4所述的免疫牛奶，其特征在于它是以普通牛奶按1∶1-1∶1000的比例稀釋免疫原乳制得的牛奶。
6.根據權利要求5所述的免疫牛奶，其特征在于它是以普通牛奶按1∶10-1∶1000的比例稀釋免疫原乳制得的牛奶。
7.根據權利要求5所述的免疫牛奶，其特征在于所述的稀釋比例為100-1∶1000。
8.根據權利要求2所述的免疫牛奶，其特征在于所使用的復合疫苗是按照下述方法制備的疫苗將羊毛脂與石蠟油按3∶1混合，然后取與抗原體積總量相等的體積比例倒入研缽，逐步磨進抗原，甲肝、乙肝抗原各約60-90μg，最后加進幽門螺旋桿菌抗原300-500μg，同樣磨合，抗原總量的體積總共約7-10ml，制成不完全佐劑，最后按總體積的約2％研磨進結核菌或卡介苗與同體積的多聚核苷酸、水楊酸、鎂鹽，制成完全佐劑，最后組成復合疫苗制劑。
9.根據權利要求8所述的免疫牛奶，其特征在于制備復合疫苗所用的幽門螺旋桿菌抗原的制備方法是取人體幽門螺旋桿菌活體，經純化后第三代細胞培養(yǎng)，采用分段鹽析法一次提純幽門螺旋桿菌的外膜蛋白，56℃1小時水浴滅活，飽和硫酸氨溶液沉淀，透析后保存?zhèn)溆谩?0、根據權利要求9所述的免疫牛奶，其特征在于所述的分段鹽析法是將提取的外膜蛋白用0.05M PBS,PH7.2，稀釋，緩慢加入硫酸銨，同時用磁力攪拌機攪拌，4℃過夜，離心2000r/min×30分鐘，取上清液，按1∶0.5-1∶1的比例加入0.05M PBS溶解，再次以硫酸銨按不同的飽和度進行鹽析，最終飽和度分別為30％,50％,80％,100％，分別取得不同純度的外膜蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫牛奶,該牛奶是以甲肝、乙肝抗原和幽門螺旋桿菌抗原制備的復合疫苗免疫奶牛而生產的免疫牛奶,具有抗甲肝病毒、乙肝病毒和幽門螺旋桿菌的作用,其免疫活性效價高,特異性強。無任何毒副作用。
文檔編號A61K39/395GK1210017SQ9711684
公開日1999年3月10日 申請日期1997年9月1日 優(yōu)先權日1997年9月1日
發(fā)明者黃河 申請人:黃河