專利名稱：抑制素組合物和提高生產(chǎn)能力的方法
發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域一般來說，本發(fā)明涉及通過向鳥類施用一種包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的異源蛋白來提高鳥類生產(chǎn)能力的方法。本發(fā)明也涉及通過向鳥類施用一種融合基因產(chǎn)物來提高鳥類生產(chǎn)能力的方法，這種基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基鳥類抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。本發(fā)明還涉及上述的異源蛋白和融合基因產(chǎn)物以及產(chǎn)生這些產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
平胸類是不能飛行的，一般來說是大的行走(running)鳥類，這種鳥類涉及幾個(gè)目，包括下列物種鴕鳥、食火鳥、Rhea、食火雞和無翼鳥。食火鳥(Dromiceius novaehollandiae)是澳大利亞平胸類鳥，其特征在于初級翼及羽狀頭和頸。成年食火鳥高平均為大約6英尺，重大約150磅。駝鳥(Struthio camelius)是大的行走鳥類，其翼很小但腿很發(fā)達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)成年駝鳥高大約8英尺，重大約325至375磅。名詞＂rhea＂是鳥類目Rheiformes成員的通稱。Rheiformes是南美洲行走鳥類目，稱為美洲鴕鳥，其在其它特征上與真正鴕鳥的區(qū)別是它們體積小，具有羽狀頭和頸及三趾足(feet)。
鴕鳥和食火鳥長期以來在它們的天然生長環(huán)境南部非洲和澳大利亞分別具有重要的商業(yè)價(jià)值。對駝鳥產(chǎn)品的需求已有100多年了，實(shí)質(zhì)上它們的獸皮、肉和羽毛有廣闊的市場。例如，駝鳥皮用于靴子、手提包、外套、手提皮包、皮夾和許多其它物品。駝鳥羽毛用于時(shí)裝、化妝服和羽毛撣子。
相比而言，食火鳥是市場的新商品。對于加入了化妝品工業(yè)中使用的精油之相同的產(chǎn)品來說它是有價(jià)值的。皮下厚脂肪層提供的食火鳥油具有很強(qiáng)的滲透性，這種滲透性使之在化妝品乳油(例如去皺潤膚劑)中是有用的。而且對食火鳥油的可能的醫(yī)療用途(如治療關(guān)節(jié)炎)正在進(jìn)行試驗(yàn)研究。典型的成年食火鳥身高可達(dá)到1.6至1.9米或更多，體重可達(dá)30至45kg或者更多。食火鳥大約在一年成熟，青春期前后的食火鳥從來沒有顯示出性特異性表型差異。和駝鳥類似，在過去的幾年里美國的食火鳥種群也經(jīng)歷了急劇增長的時(shí)期。在美國，1994年食火鳥總數(shù)大約在150,000只(包括15,000對繁殖期的食火鳥)。預(yù)計(jì)1995年食火鳥總數(shù)將進(jìn)一步增加到500,000至750,000只，其中估計(jì)有45,000對繁殖期的食火鳥。
在一些國家對平胸類產(chǎn)品的需求日益增長，這些國家包括澳大利亞、比利時(shí)、以色列、加拿大、荷蘭、納米比亞、南非和津巴布韋。因此，在過去的幾年中，駝鳥、食火鳥以及程度較輕的rhea的國內(nèi)市場急劇增長。在過去的5年中，在美國能繁殖的駝鳥對數(shù)量和鴕鳥總量分別增加了7.5和20倍。據(jù)估計(jì)在1995年包括20,000對能繁殖的鴕鳥在內(nèi)，美國將有200,000只鴕鳥。飼養(yǎng)這些動(dòng)物的巨大的利益在于成年鳥以及幼鳥的明顯價(jià)值，尤其是能繁殖的鴕鳥的價(jià)格高達(dá)每對$75,000.OO或更多，能繁殖的食火鳥每對達(dá)$30,000.00或更多。三至四個(gè)月齡的幼年駝鳥的價(jià)格大約為$7,500.00，幼年的食火鳥的價(jià)格大約為$5,000.00。這些鳥的大多數(shù)是在三至六個(gè)月齡時(shí)被購買。
此外，把養(yǎng)殖平胸類作為替代傳統(tǒng)形式的畜牧業(yè)有很大利益。一些與平胸類有關(guān)的因素使養(yǎng)殖平胸類優(yōu)先成為替代一些傳統(tǒng)形式的畜牧業(yè)(即養(yǎng)殖肉牛、豬和羊)的方式。這些因素包括較高的食物轉(zhuǎn)化率、更大的集中飼養(yǎng)的能力、大的體形，提高的繁殖能力和這些動(dòng)物特殊的肉營養(yǎng)價(jià)值。
例如，和雞肉或者火雞內(nèi)相比，類似牛肉的紅色駝鳥肉包含極少的脂肪、卡路里和膽固醇。更具體地說，85克的駝鳥肉含有2克脂肪、58毫克的膽固醇和97卡的熱量。相反，85克的火雞肉含有3克脂肪、59毫克的膽固醇和135卡的熱量。86克的雞肉含有3克脂肪、73毫克的膽固醇和140卡的熱量。85克的牛肉(牛排)含有15克脂肪、77毫克的膽固醇和240卡的熱量。最后，85克的豬肉含有19克脂肪、84毫克的膽固醇和275卡的熱量。(駝鳥肉的數(shù)值來自AMSI質(zhì)量實(shí)驗(yàn)室報(bào)道#0800100。其它肉的數(shù)值來自U.S.D.A手冊No.8，“食品的營養(yǎng)價(jià)值”)。和駝鳥相類似，食火鳥肉是一種低脂肪的紅色肉。更具體地說，100克的食火鳥肉含有1.7克脂肪、57.5毫克的膽固醇和109卡的熱量(食火鳥肉的數(shù)值來自得克薩斯公司的Silliker實(shí)驗(yàn)室)。
而且，如鴕鳥等的平胸類在12月齡時(shí)能提供大約100磅肉，因此在一段較短的時(shí)間內(nèi)提供了相當(dāng)多的肉。
平胸類何以是優(yōu)于傳統(tǒng)形式的畜牧業(yè)的替代物的例證是下列鴕鳥和牛的比較。首先，駝鳥有42天的妊娠或孵化期，而牛需要280天。第二，平均每只駝鳥每年生產(chǎn)20多個(gè)后代，而牛每年生產(chǎn)一個(gè)后代。第三，駝鳥的食物轉(zhuǎn)化率不到2∶1，而母牛的食物轉(zhuǎn)化率是5∶1。第四，鴕鳥從受孕到屠宰的天數(shù)為大約407天，而牛為645天。最后，鴕鳥除了肉和皮革之外，它們還有羽毛，而牛不能生產(chǎn)除了肉和皮革之外的產(chǎn)品。
考慮這些屬性以及世界人口對肉類需求的日益增長(肉具有營養(yǎng)價(jià)值且脂肪和膽固醇含量低，并且可以以對環(huán)境的最小負(fù)面影響有效地生產(chǎn)肉類)，平胸類工業(yè)未來的增長有很高的潛力。
目前對平胸類的需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于供給。然而，在大多數(shù)育齡雌性平胸類中，平胸類生產(chǎn)者受到不理想的蛋生產(chǎn)的限制。依據(jù)不同的物種，目前大多數(shù)平胸類的生產(chǎn)能力為每年10-20個(gè)蛋，而認(rèn)為它們產(chǎn)蛋的遺傳潛力每年超過60個(gè)。例如，野生的高產(chǎn)鴕鳥在繁殖時(shí)期大約每48小時(shí)產(chǎn)一個(gè)蛋，野生的高產(chǎn)食火鳥在繁殖時(shí)期大約每72小時(shí)產(chǎn)一個(gè)蛋。相比之下，鴕鳥的產(chǎn)蛋能力通稱是5-10天產(chǎn)一個(gè)蛋，食火鳥通常4至8天產(chǎn)一個(gè)蛋。
只有每年產(chǎn)生足夠數(shù)量的平胸類子代，平胸類的屠宰市場才能發(fā)展。按照某些預(yù)測，為了保持屠宰市場的供給，每年必須至少有250,000個(gè)鳥。因此，提高生產(chǎn)能力的方法將大大促進(jìn)屠宰市場的發(fā)展。因此，需要提高鳥類(特別是平胸類，如鴕鳥和食火鳥)生產(chǎn)能力的組合物和方法。
除了最近出現(xiàn)的平胸類工業(yè)外，也存在許多涉及已經(jīng)發(fā)展得很好的家禽物種的工業(yè)，主要是蛋雞(單冠白來亨雞(Single Comb White Leghorn))、肉雞(適合烤焙的雞)、火雞、鴨、鵝、鵪鶉。世界范圍內(nèi)對家禽肉和蛋產(chǎn)品的需求是巨大的，并且在過去的10年里，一直在穩(wěn)定地增長。
以下試圖描述美國家禽肉工業(yè)(除了平胸類生產(chǎn))的規(guī)模和復(fù)雜程度。為了便于討論，應(yīng)該知道目前的人口數(shù)字(美國人口普查，1990數(shù)據(jù))表明美國大約有250百萬居民。此外，到2000年美國的人口計(jì)劃為大約275百萬，這個(gè)數(shù)字代表從1990年到1995年的25百萬人口的增長(使用U.S.D.A1995年計(jì)劃數(shù)字)。每人消耗的適合烤焙的雞肉和火雞肉平均分別為76.7和18.1磅(參見，未署名的，家禽加工參考手冊，肉類加工，Vol.33(9)22-25.(1994)和Bowman，M.，牛肉和豬肉食品產(chǎn)值的競爭，肉類加工，Vol.33(12)16-25，(1994))。在過去的5年里折算成每人平均消耗的家禽肉為94.8磅。
另外，據(jù)報(bào)道家禽肉消費(fèi)呈穩(wěn)定增長趨勢。例如，每人消費(fèi)的雞已增加了大約28磅(從1985年55.6磅到1995年83.5磅)。同樣，每人消費(fèi)的火雞已增加了大約2.5磅(從1989年15.9磅到1995年18.4磅)。預(yù)計(jì)這種雞和火雞肉產(chǎn)品消費(fèi)趨勢的增加將隨著人類人口的預(yù)期增長(參見上文引用的數(shù)字)而增加。如果這兩個(gè)預(yù)測正確，那么至2000年，只在這個(gè)國家每年將消耗大約16.6百萬噸雞和火雞肉。這種家禽消費(fèi)增加的趨勢與下列事實(shí)直接相關(guān)，即認(rèn)為家禽肉是對＂心臟有益的＂食品(動(dòng)物脂肪含量低)，并且由于其便宜的價(jià)格(pricewise)，其在與更貴的紅色肉(如牛肉、豬肉和小羊)競爭上具有優(yōu)勢。
由于對產(chǎn)品的需求日益增長，因此提高雞和火雞生育母雞的生產(chǎn)能力對目前快速增長的工業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。滿足消費(fèi)者需求和保持肉價(jià)格的競爭優(yōu)勢，雞和火雞的生育者的任務(wù)是繼續(xù)生產(chǎn)盡可能多的種蛋。因此，任何能夠增加蛋生產(chǎn)(甚至是小量的增加)的方法都將產(chǎn)生重要的經(jīng)濟(jì)效益。
例如，在一個(gè)生產(chǎn)周期(大約為1年)另外產(chǎn)15個(gè)蛋的單一生育雞的母雞(以飼養(yǎng)一個(gè)母雞為基礎(chǔ))的方案如下。以目前市場雞的價(jià)格($0.16/雞)出售這些額外孵化的雞，將獲得$2.00的收入，繼續(xù)飼養(yǎng)這些雞，出售雞肉將獲得$10-12.00的收入(是考慮到飼料成本和固定成本的合適推斷)。因?yàn)楣烙?jì)到在美國生育雞的母雞超過60百萬只母雞，所以經(jīng)濟(jì)收益為大約$750+百萬。保守地估計(jì)來自家禽(包括所有其肉類消費(fèi)增加的家禽，不包括平胸類)工業(yè)肉方面(meat-side)的全部收入在$1-2十億之間(包括可以由火雞生育者(以及母雞，包括鴉、鵝和鵪鶉的專業(yè)化家禽業(yè)務(wù)和上文討論的雞肉在內(nèi)的雌鳥)生產(chǎn)能力提高而預(yù)測的收入)。
應(yīng)該注意到，家禽業(yè)在這個(gè)國家主要作為食用蛋業(yè)首先發(fā)展的。接下來當(dāng)為提高家禽的體重(肉雞肉)而進(jìn)行選擇時(shí)，這種遺傳選擇對蛋生產(chǎn)率是有害的。換句話說，蛋生產(chǎn)與選擇增加的體重后所發(fā)現(xiàn)的遺傳變化呈負(fù)相關(guān)。因此，通過內(nèi)分泌操縱(本發(fā)明考慮了這一點(diǎn))提高雞和火雞的雌禽(肉型禽)的生產(chǎn)能力的潛力在肉型禽中大于單冠白來亨雞(自19世紀(jì)20年代末為加強(qiáng)蛋生產(chǎn)選育的禽)。另一方面，如下所述，在美國產(chǎn)蛋禽比生育雞的禽多出3至4倍。因此，當(dāng)考慮到可能影響的鳥群的大小，甚至產(chǎn)蛋鳥生產(chǎn)能力很小的改進(jìn)都是巨大的。
下面討論食用蛋業(yè)在這個(gè)國家的規(guī)模和重要性。人均蛋消費(fèi)自1989至1992年保持在相當(dāng)穩(wěn)定的水平，其變化范圍為30.0至30.4磅(參見表653主要食品的人均消費(fèi)，美國1984-92；農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)表，1993，U.S.D.A.國家農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)表，U.S.Govt.印刷辦公室，華盛頓特區(qū)，p.457；1993和1994的數(shù)據(jù)沒有)。食用蛋消費(fèi)增長速率在美國一直停滯可能主要與公眾擔(dān)心消費(fèi)過多的膽固醇含量很高的蛋黃有關(guān)。
盡管人均蛋消費(fèi)率呈穩(wěn)定趨勢，但產(chǎn)蛋禽的數(shù)量卻穩(wěn)定地增長，從1990年的228.8百萬只雌禽到1994年的240.7百萬只(參見Bell，D.D.，加利福尼亞大學(xué)統(tǒng)計(jì)報(bào)告月刊，表28產(chǎn)蛋禽本月農(nóng)場中的數(shù)量，1980-93，UC Riverside)。產(chǎn)蛋雌禽的數(shù)量不斷增加的趨勢簡單地反應(yīng)了對蛋需求的增加，以滿足人口的增加、蛋和蛋產(chǎn)品出口的增加或者還有其它不確定的因素。無論什么理由，由于世界上幾乎80％的蛋生產(chǎn)不在美國，這表明在美國食用蛋市場上任何可認(rèn)識到的積極影響可能擴(kuò)大5倍，以達(dá)到其對世界范圍經(jīng)濟(jì)的影響。然而，如果把這種計(jì)算只限定在美國，以人均消費(fèi)量穩(wěn)定在大約30.2磅和在下一個(gè)5年中美國人口將增加到275百萬為基礎(chǔ)，這樣到2000年，只在這個(gè)國家每年將生產(chǎn)4.2百萬噸雞蛋。
由于許多影響決策的來亨雞生產(chǎn)周期的復(fù)雜特性(如通過換羽更新小母雞的成本、換羽對換羽后生產(chǎn)性能的不良影響、換羽期間蛋銷售額的損失等等)的存在，提高產(chǎn)蛋禽的蛋生產(chǎn)性能很難獲得經(jīng)濟(jì)效益。然而，以僅為上述討論的規(guī)模一半的每個(gè)雌禽為基礎(chǔ)，斷定蛋雞產(chǎn)蛋的增加就意味著幾百萬經(jīng)濟(jì)效益是不合理的。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)將詞組＂提高生產(chǎn)能力＂理解為使雌禽在下面的一個(gè)或多個(gè)方面得到增加促進(jìn)產(chǎn)蛋的開始；促進(jìn)最大蛋生產(chǎn)期的開始；延長產(chǎn)蛋期；增加產(chǎn)蛋強(qiáng)度；或者增加一生的總產(chǎn)蛋。此詞組還包括改進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率；提高蛋殼質(zhì)量；或者改進(jìn)其對不利產(chǎn)蛋條件(如熱脅迫、過分擁擠、營養(yǎng)不良和噪音)的抗性。此詞組意味著使雄禽在下面一個(gè)或多個(gè)方面有所增加加速青春期的開始或者精子的產(chǎn)生；促進(jìn)最大精子生產(chǎn)期的開始；延長精子的生產(chǎn)；增加精子的產(chǎn)生強(qiáng)度(精子數(shù))；增加射精體積；提高精子的生存能力；增加睪丸激素的產(chǎn)生；或者增加性欲。
最近，已經(jīng)研究了激素抑制素可以作為增加哺乳動(dòng)物排卵的潛在手段。抑制素是主要由生殖腺產(chǎn)生的肽激素，具體地說是由正在生長的卵泡和睪丸產(chǎn)生。在哺乳動(dòng)物中，它的功能是作為腦垂體的促卵泡激素(＂FSH＂)分泌的抑制性反饋調(diào)節(jié)物。盡管60多年以前，首先提出了抑制素的存在，但只是在最近才完成了其化學(xué)分離。
哺乳動(dòng)物的抑制素是由α-亞基(分子量18,000)和β-亞基(分子量14,000)組成的二聚體蛋白質(zhì)激素。α-亞基對抑制素來說是唯一的，而β-亞基二聚體形成活化素(一種自腦垂體腺中釋放的FSH)。β-亞基以兩種形式(βA和βB)存在，這兩種形式不同但非常相似。因此，根據(jù)相關(guān)的β-亞基，抑制素有抑制素-A或者抑制素-B。當(dāng)α-亞基和β亞基以二硫鍵連接時(shí)，其生物活性是抑制促卵泡激素(＂FSH＂)自腦垂體的分泌。抑制素α-亞基的氨基酸序列在豬、牛、人類、鼠和家養(yǎng)的雞物種中顯示出大約80-90％的相似性。有關(guān)抑制素的分離、產(chǎn)生、測定和生物學(xué)作用可以在Risbridger等的“現(xiàn)代抑制素生物學(xué)”，內(nèi)分泌學(xué)學(xué)報(bào)(Copenh)，122673-682，(1990)；和Rivier，C.等的“抑制素激素家族的研究”綜述，激素研究28104-118(1987)中獲知，其全部內(nèi)容本文一并參考。
在哺乳動(dòng)物和禽類中，F(xiàn)SH對卵泡的生長和發(fā)育具有作用，而促黃體激素(＂LH＂)被認(rèn)為能誘導(dǎo)排卵。幾種腦和生殖腺因子(肽和類固醇激素)相互作用控制促性腺激素的釋放。在這些因子中，促性腺素釋放激素(＂GnRH＂)和抑制素對哺乳動(dòng)物腦垂體FSH的分泌具有相反的控制作用。促性腺素釋放激素是腦十肽，其作用是刺激FSH和LH的分泌；而抑制素是生殖腺蛋白，其明顯的作用是選擇性地抑制哺乳動(dòng)物FSH的分泌。
理解抑制素在禽類排卵內(nèi)分泌控制中的作用需要了解鳥類排卵過程的基礎(chǔ)知識。在家養(yǎng)雌禽功能成熟的卵巢中，正在生長的卵泡以不同大小的組織存在。典型的卵巢包含4至6個(gè)大的，直徑為2-4厘米，充滿卵黃的卵泡(F1至F4，F(xiàn)6)；還有大量較小的，2-10毫米，黃色的卵泡以及眾多的非常小的白卵泡。最大的預(yù)排卵的卵泡(F1)在第二天排卵，第二大的卵泡(F2)在再下一天(大約26小時(shí)后)排卵，等等。對這層組織中卵泡的募集和發(fā)育的控制理解得很少。已經(jīng)證明了腦垂體促性腺激素的介入，然而抑制素在控制鳥類促性腺激素的分泌和控制排卵中的作用還不清楚。
誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物物種的過分排卵的最新策略已經(jīng)發(fā)展成為與中和內(nèi)原抑制素活性有關(guān)的方法。例如，已經(jīng)研究了哺乳動(dòng)物對各種包含抑制素的化合物的活性免疫。在小母牛、綿羊、小母豬和大鼠中抑制素的免疫中和與增加的排卵率有關(guān)。
接種抗原抑制素制劑后，在哺乳動(dòng)物中所發(fā)現(xiàn)的排卵率的增加被認(rèn)為是增加的血漿FSH水平(促進(jìn)卵巢卵泡的發(fā)育)的結(jié)果。研究中使用各種抗原作為疫苗，證明了哺乳動(dòng)物排卵率的增加。在哺乳動(dòng)物中試驗(yàn)的一些抗原包括來源于抑制素α-亞基片段的重組DNA(Wrathall等，抑制素α-亞基的合成肽序列的活性免疫對母羊血漿促性腺激素的濃度、排卵率和生小羊的速率的影響，繁殖生育力雜志，95175-182，1992；和Meyer等，抑制素α-鏈肽的抗血清中和綿羊的抑制素的生物活性并增加排卵率，明尼蘇達(dá)農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站科學(xué)雜志系列，論文編號17，103，1991)；與卵清蛋白結(jié)合的牛抑制素α-亞基的N端序列的合成肽復(fù)制品(Glencross等，小母牛針對抑制素的活性免疫對血漿FSH的濃度、卵巢卵泡的發(fā)育和排卵率的影響，內(nèi)分泌學(xué)雜志，134，11-18，1992)；與人類血清白蛋白結(jié)合的牛抑制素α-亞基的合成肽序列(Morris等，牛抑制素α-亞基的合成肽序列的免疫對小母牛的排卵率和生育雙胞胎率的影響，繁殖生育力雜志97255-261，1993)；自牛卵泡液體部分純化的抑制素(Morris等，用自牛卵泡液體部分純化的抑制素免疫青春期前的具有低和高排卵率基因型的小羊的作用，Theriogenology，Vol.35 No.2，1991)。
在所有研究的周期性哺乳動(dòng)物中，盡管與在排卵周期中FSH水平如何波動(dòng)的數(shù)據(jù)相矛盾，但是不管所使用的抗原或所攻擊的哺乳動(dòng)物的物種，內(nèi)原抑制素的免疫中和持續(xù)促進(jìn)了卵巢卵泡的發(fā)育和排卵率。
如上所述，在鳥類物種中抑制素與生殖功能調(diào)節(jié)的關(guān)系還不清楚。到目前為止，發(fā)表的論文集中在抑制素對家養(yǎng)家禽的生殖功能上。大量的文獻(xiàn)支持這樣的理論，即抑制素在家禽中表現(xiàn)出的生理作用與文獻(xiàn)報(bào)道的在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出的生理作用相當(dāng)在雌禽中，抑制素可能是卵泡募集和/或者發(fā)育的調(diào)節(jié)物。然而，在禽類中抑制素可能是或者不是通過抑制腦垂體FSH的分泌來與排卵率的控制相關(guān)的。例如，雖然發(fā)現(xiàn)低產(chǎn)蛋的雌禽較高產(chǎn)蛋雌禽，在血漿和預(yù)排卵卵泡的粒膜細(xì)胞層中含有更高水平的抑制素，但發(fā)現(xiàn)在血漿FSH水平與產(chǎn)蛋率的相關(guān)性方面沒有差異。Wang等，家養(yǎng)雌禽卵巢中α-抑制素基因表達(dá)和血漿免疫反應(yīng)性抑制素水平的增加與排卵率的降低相關(guān)，普通和比較內(nèi)分泌學(xué)，91，52-58，(1993)。因此，此參考文獻(xiàn)表明在雌禽中，抑制素α-亞基基因表達(dá)和血漿免疫反應(yīng)性抑制素水平與排卵率相關(guān)的變化不能直接通過調(diào)節(jié)血漿FSH的水平來影響排卵率。此外，Johnson，P.A.(雌禽中的抑制素，家禽科學(xué)72955-958，(1993))認(rèn)為使用牛抑制素RIA系統(tǒng)能成功地評價(jià)雌禽血漿的免疫反應(yīng)性抑制素，然而，盡管LH對預(yù)排卵的推動(dòng)，但在整個(gè)排卵周期中沒有檢測到明顯的免疫反應(yīng)性抑制素的峰。因此，抑制素在禽類卵泡產(chǎn)生中的作用仍不清楚。
最近，成功地克隆和測序了雞抑制素的α-亞基。Wang和Johnson，雞卵巢粒膜細(xì)胞抑制素的α-亞基的互補(bǔ)脫氧核糖核酸克隆和序列分析，生殖生物學(xué)，49，1-6，(1993)，其全部內(nèi)容本文一并參考。鳥類抑制素序列與已知的哺乳動(dòng)物抑制素α-亞基序列相比，顯示出86-89％同源性。使用兩個(gè)分離探針(cINA6和cINA12)的Northern亞基分析表明所說的抑制素α-亞基在雞卵巢粒膜細(xì)胞中表達(dá)，而在雞腦、腎、肝臟或者脾組織中不表達(dá)。
因此，禽類中的抑制素生物學(xué)還了解得很少，還沒有試圖或者檢測禽類對抗原抑制素攻擊的反應(yīng)。這樣，由于平胸類市場實(shí)質(zhì)上是由許多駝鳥、食火鳥和rhea的不理想的生產(chǎn)能力所限制，所以需要一種提高這些禽類生產(chǎn)能力的組合物和方法。
此外，需要改進(jìn)所有家禽的生產(chǎn)能力，以便增加所生產(chǎn)的用于消費(fèi)的家禽的數(shù)量，提高這種生產(chǎn)的效率或者是飼料轉(zhuǎn)化率。因此，仍然需要一種提高或改進(jìn)所有家禽(其中包括雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝)生產(chǎn)能力的組合物和方法。
另外，也需要一種改進(jìn)外來鳥(如鸚鵡目)生產(chǎn)能力的組合物和方法。鸚鵡目包括鸚鵡，其是鳥類中的單科目，具有并趾和有力的鉤狀鳥嘴。將鸚鵡定義為鳥家族鸚鵡科(Psittacidae)(是鸚鵡目唯一的科)的任何成員，其特征是短、結(jié)實(shí)有力的鉤狀嘴。
對提高生產(chǎn)能力的組合物與方法的需要不限于鳥類。在許多動(dòng)物中也需要有效的組合物與方法來改進(jìn)其生產(chǎn)能力。例如，在大多數(shù)農(nóng)業(yè)飼養(yǎng)的動(dòng)物(如豬、牛和羊)上一直需要改進(jìn)其生產(chǎn)能力。也一直需要改進(jìn)毛被動(dòng)物(貂、狐貍、水獺、雪貂和浣熊)和用作寵物和實(shí)驗(yàn)研究對象的嚙齒動(dòng)物(如大鼠、小鼠、沙土鼠和倉鼠)的生產(chǎn)能力，對獸皮用于裝飾目的其它動(dòng)物的生產(chǎn)能力提高的需求也在增加。
另外，需要改進(jìn)生產(chǎn)能力的組合物和方法，以便增加許多動(dòng)物(如外來的和瀕危物種)的種群，避免它們的絕種。一直需要改進(jìn)用于競賽、娛樂或者表演(競賽)的動(dòng)物(如馬、狗、貓、動(dòng)物園動(dòng)物和馬戲團(tuán)動(dòng)物)的生產(chǎn)能力。如對治療人類不育需要的增加所表明的那樣，也需要改進(jìn)人類的生產(chǎn)能力。因此，在許多動(dòng)物中還需要改進(jìn)生產(chǎn)能力的組合物和方法。
發(fā)明概述一般來說，本發(fā)明涉及通過向所說的動(dòng)物施用包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的異源蛋白來改進(jìn)這些動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法。本發(fā)明也涉及通過向所說的動(dòng)物施用融合基因產(chǎn)物來改進(jìn)這些動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。向動(dòng)物施用有效量的異源蛋白或者融合基因產(chǎn)物，以便在此動(dòng)物中產(chǎn)生抗此異源蛋白的免疫應(yīng)答。也應(yīng)該理解本發(fā)明的方法促進(jìn)產(chǎn)生抑制素的動(dòng)物的生產(chǎn)能力。優(yōu)選的是，所說的動(dòng)物是禽。更優(yōu)選的是，所說的禽是雞。另一種優(yōu)選的禽是平胸類(如食火鳥、鴕鳥、rhea或者食火雞)。
本發(fā)明還涉及上述的異源蛋白和融合基因產(chǎn)物，以及產(chǎn)生它們的方法。更具體地說，本發(fā)明直接針對于產(chǎn)生異源蛋白的組合物和方法，所說的異源蛋白包含抑制素或其片段和載體蛋白。抑制素蛋白或其片段可以是鳥類抑制素、哺乳動(dòng)物抑制素、魚類抑制素或者爬蟲類抑制素。載體蛋白包括但不限于麥芽糖結(jié)合蛋白、甲狀腺球蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白或者牛血清白蛋白。優(yōu)選的載體蛋白是麥芽糖結(jié)合蛋白。
異源蛋白可以是與所說的載體蛋白結(jié)合的抑制素，也可以是融合到所說的載體蛋白中的抑制素。產(chǎn)生這種融合異源蛋白的方法包括將編碼抑制素或其片段表達(dá)的cDNA插入到含有產(chǎn)生載體蛋白的編碼信息的載體中。在將所說的載體插入到表達(dá)系統(tǒng)后，所說的融合異源蛋白經(jīng)此系統(tǒng)表達(dá)。優(yōu)選的是，所說的異源蛋白包括平胸類抑制素(如駝鳥抑制素、食火鳥抑制素和rhea抑制素)。另一個(gè)優(yōu)選的異源蛋白包括雞抑制素。
本發(fā)明也直接針對于通過施用本發(fā)明的異源蛋白來改進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)能力的方法，所說的異源蛋白包含抑制素蛋白或者其片段和載體蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所說的方法包括向雌性動(dòng)物施用有效量的這種蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所說的方法包括向雄性動(dòng)物施用有效量的這種蛋白質(zhì)。理想的是，在這些動(dòng)物中產(chǎn)生直接抗這些異源蛋白的免疫反應(yīng)。更理想的是，在此動(dòng)物中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)也是直接抗此動(dòng)物產(chǎn)生的抑制素蛋白(內(nèi)原抑制素)的。
本發(fā)明也直接針對于一種融合基因產(chǎn)物，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼所說的載體蛋白表達(dá)的基因。此編碼抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因可以編碼表達(dá)鳥類抑制素、哺乳動(dòng)物抑制素、魚類抑制素或者爬蟲類抑制素。編碼所說的載體蛋白表達(dá)的基因可以編碼表達(dá)其中的麥芽糖結(jié)合蛋白或者牛血清白蛋白。優(yōu)選的編碼載體蛋白表達(dá)的基因編碼麥芽糖結(jié)合蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明也涉及通過向所說的動(dòng)物施用融合基因產(chǎn)物來改進(jìn)這些動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。更具體地說，本發(fā)明還與基因治療方法有關(guān)，即將編碼抑制素或其片段和載體蛋白的DNA序列導(dǎo)入到動(dòng)物中。本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物可以直接施用給所說的動(dòng)物，或者可以經(jīng)載體或含有載體的細(xì)胞(因此此細(xì)胞含有所說的融合基因產(chǎn)物)施用給所說的動(dòng)物。
本發(fā)明的方法提高產(chǎn)生抑制素的雌性動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、爬蟲、魚和鳥)的生產(chǎn)能力。更具體地說，這種方法提高雌性鶉雞目和平胸類的生產(chǎn)能力。更具體地說，這種方法提高雞、火雞、駝鳥、食火鳥和rhea的生產(chǎn)能力。這種方法也提高海龜(包括瀕危的海龜物種)的生產(chǎn)能力。出乎意料的是，本發(fā)明的方法促進(jìn)了動(dòng)物青春期或產(chǎn)蛋的開始。另外，本發(fā)明的方法意外地促進(jìn)了動(dòng)物最大產(chǎn)蛋期的開始。此外，本發(fā)明的方法增加了動(dòng)物產(chǎn)蛋的強(qiáng)度。還有令人驚奇的是，本發(fā)明的方法延長了動(dòng)物的最大產(chǎn)蛋期。另外，本發(fā)明的方法意外地增加了動(dòng)物一生的總產(chǎn)蛋。在鳥類中，本發(fā)明的方法也改進(jìn)鳥的飼料轉(zhuǎn)化率。另外，本發(fā)明的方法意外地減少或消除了不利的產(chǎn)蛋條件對暴露在這種不利的條件下的動(dòng)物產(chǎn)蛋率的影響。這種不利的條件包括提高的溫度、擁擠、營養(yǎng)缺乏和噪音。
令人驚奇的是，本發(fā)明的方法也提高了產(chǎn)生抑制素的雄性動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、爬蟲和鳥)的生產(chǎn)能力。更具體地說，本發(fā)明的方法增加了雄性動(dòng)物的睪丸激素的水平。類似的是，本發(fā)明的方法增加了雄性動(dòng)物青春期或者精子產(chǎn)生的開始。另外，本發(fā)明的方法促進(jìn)了雄性動(dòng)物最大精子產(chǎn)生期的開始。此外，本發(fā)明的方法意外地增加了雄性動(dòng)物精子產(chǎn)生的強(qiáng)度(精子數(shù))。還有，本發(fā)明的方法延長了動(dòng)物的最大精子產(chǎn)生期。另外，本發(fā)明的方法提高了動(dòng)物精子的生存力。另外，本發(fā)明的方法意外地減少或消除了不利的條件對暴露在這種不利的條件下的動(dòng)物精子產(chǎn)生的影響。這種不利的條件包括升高的溫度、過分擁擠、營養(yǎng)缺乏和噪音。另外令人驚奇的是，本發(fā)明的方法增加了性欲，因此增加了雄性鳥類的生殖潛力。
如上所述，使用本發(fā)明的方法能提高任何產(chǎn)生抑制素的動(dòng)物(包括但不限于農(nóng)業(yè)上飼養(yǎng)的大多數(shù)動(dòng)物，如豬、母牛、綿羊、火雞、鵪鶉、鴨、鵝、雞和魚)；毛被動(dòng)物(貂、狐貍、水獺、雪貂、兔和浣熊)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如大鼠、小鼠、沙土鼠和豚鼠)；獸皮可用于裝飾的動(dòng)物(如產(chǎn)于美洲的鱷魚和蛇)；外來的或?yàn)l于絕種的物種；用于競賽、娛樂或表演(競賽)的動(dòng)物(如馬、狗、貓、動(dòng)物園動(dòng)物和馬戲團(tuán)動(dòng)物)；和人類的生產(chǎn)能力。另外，本發(fā)明的方法能夠提高其生產(chǎn)能力的鳥類還包括平胸類、鸚鵡目、piciformes，strigiformes，passeriformes，coraciformes，ralliformes，cuculiformes，columbiformes，galliformes，anseriformes和herodiones。更具體地說，本發(fā)明的方法可以用于提高駝鳥、食火鳥、rhea、雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、無翼鷓鴣鳥(partridge kiwi)、食火雞、鸚鵡(parrot)、鸚鵡(parakeet)、makaw、獵鷹、鷹(eagle)、鷹(hawk)、鴿子、美冠鸚鵡、鳴禽、jay鳥、山鳥類、雀類、囀鳥、金絲雀、巨嘴鳥、八哥或者麻雀的生產(chǎn)能力。
因此，本發(fā)明的目的是提供抑制素組合物，這種組合物能在對動(dòng)物給藥之后誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含抑制素蛋白或者其片段和載體蛋白的異源蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含融合異源蛋白的組合物，所說的異源蛋白包含抑制素或者其片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生融合異源蛋白(包含抑制素蛋白或者其片段和載體蛋白)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供融合基因產(chǎn)物，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過將所說的融合基因產(chǎn)物注射到動(dòng)物中而產(chǎn)生抗本發(fā)明異源蛋白的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在調(diào)節(jié)抑制素水平的基因治療中有用的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高鳥類生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高平胸類生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高雞生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高爬蟲生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高哺乳動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高魚類生產(chǎn)能力的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提高人類生產(chǎn)能力的方法。
在閱讀下列公開的實(shí)施方案和附加的權(quán)利要求的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。
附圖的簡短描述

圖1是SDS-PAGE凝膠，其中的A是駝鳥抗(雞抑制素-麥芽糖結(jié)合蛋白)抗體，B是質(zhì)粒pMALTM-c載體標(biāo)準(zhǔn)品，C是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，D是用于所說的融合異源蛋白制劑中的pMALTM-c載體，E是本發(fā)明的純化的融合雞抑制素-麥芽糖結(jié)合蛋白(異源蛋白)，F(xiàn)是未裝有所說的異源蛋白的純化過程的洗脫液。
圖2具體說明了使用與cINA521編碼的蛋白質(zhì)融合的麥芽糖結(jié)合蛋白后，抑制素α-亞基免疫中和作用對雌禽日產(chǎn)蛋量(＂HDEP＂)的影響。更具體地說，圖2是實(shí)施例8的數(shù)據(jù)的圖表說明。
詳細(xì)描述一般來說，本發(fā)明涉及通過向所說的動(dòng)物施用包含抑制素蛋白或其片段載體蛋白的異源蛋白來改進(jìn)這些動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法。本發(fā)明也涉及通過向所說的動(dòng)物施用融合基因產(chǎn)物來改進(jìn)這些動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。
向動(dòng)物施用有效量的異源蛋白或者融合基因產(chǎn)物，以便在此動(dòng)物中產(chǎn)生抗此異源蛋白的免疫應(yīng)答。也應(yīng)該理解本發(fā)明的方法促進(jìn)產(chǎn)生抑制素的動(dòng)物的生產(chǎn)能力。優(yōu)選的是，所說的動(dòng)物是禽。更優(yōu)選的是，所說的禽是雞。另一種優(yōu)選的禽是火雞。另外優(yōu)選的禽是平胸類(如食火鳥、鴕鳥、rhea或者食火雞)。本發(fā)明還涉及上述的異源蛋白和融合基因產(chǎn)物，以及產(chǎn)生它們的方法。
在下列定義之后，將詳盡地描述本發(fā)明的組合物，之后是本發(fā)明方法的詳細(xì)描述。定義本文所用的術(shù)語＂禽＂或者＂家禽＂定義為鳥(Aves)綱動(dòng)物的成員，其特征是溫血、主要適于飛行的產(chǎn)蛋脊椎動(dòng)物。本文所用的術(shù)語＂平胸類＂定義為一族不能飛行、大部分較大的行走禽類，包括下列幾個(gè)目食火鳥、鴕鳥、無翼鳥和食火雞。本文所用的術(shù)語＂鸚鵡目＂包括鸚鵡，并且是鳥類中的單科目，為并趾和有力的鉤狀鳥嘴。＂鸚鵡＂定義為鳥家族鸚鵡科(是鸚鵡目唯一的科)的任何成員，其特征是短、結(jié)實(shí)有力的鉤狀嘴。本文所用的＂雞＂指用于產(chǎn)蛋的雞(如單冠白來亨雞)和用于消費(fèi)而飼養(yǎng)的雞或者適合烤焙的雞。
本文將術(shù)語＂蛋＂定義為由禽類和爬蟲產(chǎn)生的包裹在多孔含鈣的或皮質(zhì)的殼中的大雌性細(xì)胞。本文所用的＂鳥或者爬蟲的蛋產(chǎn)生＂是產(chǎn)蛋鳥的行為，或者稱為＂產(chǎn)卵＂。術(shù)語＂卵＂定義為雌配子，也稱為蛋。因此，除鳥和爬蟲外，本文所有的所用動(dòng)物的蛋產(chǎn)生定義為卵巢產(chǎn)生和排出卵，或稱為＂排卵＂。這樣，應(yīng)該理解本文所用的術(shù)語＂蛋＂在其由鳥或者爬蟲產(chǎn)生時(shí)，應(yīng)定義為包裹在多孔含鈣或皮質(zhì)殼中的大雌性細(xì)胞；而在其由所有其它動(dòng)物產(chǎn)生時(shí)，定義為卵。
對于鳥類，文本可互換使用術(shù)語＂產(chǎn)蛋的開始＂、＂首次產(chǎn)蛋＂和＂青春期＂，其是指鳥產(chǎn)下第一個(gè)蛋。因此，本文所用的鳥類產(chǎn)蛋或青春期的＂加速開始＂指的是與通常鳥類的首次產(chǎn)蛋日期相比，誘導(dǎo)出更早的首次產(chǎn)蛋日期。類似的是，對于雄鳥可互換使用＂青春期＂和＂精子產(chǎn)生的開始＂。
可互換使用詞組＂提高生產(chǎn)能力＂、＂改進(jìn)生產(chǎn)能力＂和＂增加生產(chǎn)能力＂，其是指在下列一個(gè)或幾個(gè)方面的改進(jìn)加速青春期的開始(雌性的產(chǎn)蛋或者排卵，雄性的精子產(chǎn)生)；加速雌性的最大產(chǎn)蛋或排卵期的開始，或者加速雄性最大精子產(chǎn)生期的開始；增加雌性的產(chǎn)蛋強(qiáng)度或者雄性的精子產(chǎn)生強(qiáng)度；延長雌性的產(chǎn)蛋期或者雄性的精子產(chǎn)生期；增加雌性一生的總產(chǎn)蛋或排卵；提高飼料轉(zhuǎn)化率；提高蛋殼質(zhì)量；提高對不利條件(如升高的溫度、過分擁擠、營養(yǎng)不良和噪音)的抗性；提高雄性精子的存活力；增加雄性睪丸激素的產(chǎn)生；增加精液體積；增加雄性性欲。
詞組＂產(chǎn)蛋強(qiáng)度＂的意思對本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員是已知的，其是指產(chǎn)蛋的頻率。
鳥類＂一生的總產(chǎn)蛋＂定義為在鳥的整個(gè)一生中其產(chǎn)蛋的總數(shù)。本文所用的詞組＂雌禽日產(chǎn)蛋＂或者＂HDEP＂定義為特定的一組雌禽每天產(chǎn)蛋的數(shù)目。
本文所用的詞組＂促進(jìn)最大產(chǎn)蛋期的開始＂或者＂促進(jìn)最大蛋生產(chǎn)期的開始＂指從出生到動(dòng)物以高峰產(chǎn)蛋率或排卵率的50％產(chǎn)蛋或排卵的時(shí)間比正常的從出生到最大產(chǎn)蛋期的時(shí)間短。
本文所用的蛋的＂膽固醇水平降低＂的方法指與同種的鳥孵出的蛋的平均膽固醇含量相比，誘導(dǎo)這種鳥孵出一個(gè)或多個(gè)具有較低的膽固醇含量的蛋的方法。
與術(shù)語禽或者家禽相比，本文所用的術(shù)語＂哺乳動(dòng)物＂定義為哺乳動(dòng)物綱的成員，這是很大的溫血脊椎動(dòng)物綱，此綱動(dòng)物的特征在于乳腺、身體被毛、中耳的三個(gè)骨膜(oscicles)、將胸腔和腹腔分開的肌膈、沒有細(xì)胞核的紅血細(xì)胞、位于尿囊和羊膜中的胚胎發(fā)育。
本文所用的術(shù)語＂爬蟲＂定義為爬行綱Reptilia的任何一員，此綱是陸生的脊椎動(dòng)物綱，其特征是沒有毛、羽毛和乳腺，他們的皮膚上覆蓋著鱗片，有三室心臟，它們的胸膜腔和腹膜腔是相通的。
本文所用的異源蛋白定義為包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的蛋白質(zhì)。應(yīng)該理解在異源蛋白組合物、產(chǎn)生異源蛋白的方法和使用本發(fā)明的異源蛋白的方法中可以互換使用術(shù)語＂抑制素＂和＂抑制素片段＂。
也應(yīng)該理解本文所用的“cINA521”指521個(gè)堿基對序列(SEQ ID NO1)。cINA521編碼鴕鳥的α-抑制素亞基部分，如SEQ ID NO2所示。本文所用的＂MBP-cINA521＂是在將cINA521克隆到重組宿主細(xì)胞并表達(dá)了包含麥芽糖結(jié)合蛋白(＂MBP ＂)和cINA521編碼的抑制素蛋白α-亞基片段的融合異源蛋白后，由重組宿主細(xì)胞表達(dá)的異源蛋白。優(yōu)選的是，使用可以買到的載體pMALTM-c在克隆的cINA521表達(dá)后，在宿主大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生MBP-cINA521。因此，＂cINA521＂指核苷酸序列，而＂MBP-cINA521＂指融合的異源蛋白。
本文所用的融合異源蛋白指融合在一起的兩種不同的蛋白質(zhì)。例如，包含與載體蛋白融合的抑制素蛋白或者其片段的蛋白質(zhì)。所說的融合異源蛋白由包含融合基因產(chǎn)物的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，這種表達(dá)系統(tǒng)包含與編碼載體蛋白表達(dá)的基因融合的編碼抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因。本文所用的＂融合的基因產(chǎn)物＂定義為編碼抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因與編碼載體蛋白表達(dá)的基因融合的產(chǎn)物。
本文所用的結(jié)合的異源蛋白定義為包含與載體蛋白結(jié)合的抑制素蛋白或其片段的蛋白質(zhì)。結(jié)合的異源蛋白經(jīng)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，此化學(xué)反應(yīng)通過共價(jià)鍵將所說的抑制素蛋白與載體蛋白連接起來。
本文所用的動(dòng)物對施用給其的物質(zhì)的免疫反應(yīng)定義為動(dòng)物的細(xì)胞介導(dǎo)的和/或體液反應(yīng)，此反應(yīng)特異地抗所說的物質(zhì)。
本文所用的術(shù)語＂選擇性相互作用＂定義為兩個(gè)物質(zhì)通過共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵、氫鍵、靜電、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或者通過其它的結(jié)合或吸附手段相互結(jié)合。這種結(jié)合的選擇性在于兩個(gè)物質(zhì)以特定的方式、特定的位置或?qū)Ｒ恍缘乇舜讼嗷プ饔谩Ｒ种扑亟M合物一般來說，本發(fā)明涉及在提高動(dòng)物(包括鳥類)生產(chǎn)能力的方法中使用的組合物。所說的組合物由包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的異源蛋白組成。所說的抑制素可以是產(chǎn)生抑制素的任何動(dòng)物物種的抑制素。這些抑制素包括但不限于鳥抑制素、哺乳動(dòng)物抑制素、爬蟲抑制素、兩棲動(dòng)物抑制素或者魚抑制素。更具體地說，哺乳動(dòng)物抑制素包括但不限于牛抑制素、人類抑制素、馬抑制素、貓抑制素、狗抑制素、兔抑制素、綿羊抑制素、貂抑制素、狐貍抑制素、水獺抑制素、雪貂抑制素、浣熊抑制素、驢抑制素、大鼠抑制素、小鼠抑制素、倉鼠抑制素和豬抑制素。鳥抑制素包括但不限于駝鳥抑制素、食火鳥抑制素、rhea抑制素、食火雞抑制素、無翼鳥抑制素、火雞抑制素、鵪鶉抑制素、雞抑制素、鴨抑制素、鵝抑制素和鸚鵡目成員的抑制素。
優(yōu)選的抑制素是鳥(avian)或者鳥(bird)的抑制素。更優(yōu)選的抑制素是平胸類抑制素，如駝鳥、食火鳥或者rhea抑制素。特別優(yōu)選的抑制素是駝鳥抑制素。另一個(gè)優(yōu)選的抑制素是雞抑制素。最優(yōu)選的是本發(fā)明的異源蛋白包括α-亞基抑制素蛋白或其片段和載體蛋白。
所說的抑制素或其片段可以從動(dòng)物體液中分離，由表達(dá)系統(tǒng)中的基因工程細(xì)胞表達(dá)，或者經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)合成產(chǎn)生。更具體地說，抑制素的片段包括但不限于下列組分α-亞基抑制素；β-亞基抑制素；衍生于α-亞基抑制素或者β-亞基抑制素片段的重組DNA；α-亞基抑制素或者β-亞基抑制素片段的合成肽復(fù)制品；α-亞基抑制素或者β-亞基抑制素的N-末端序列的合成肽復(fù)制品；從卵泡液體中部分純化的抑制素的片段；內(nèi)源α-亞基抑制素或者β-亞基抑制素的片段；外源α-亞基抑制素或者β-亞基抑制素的片段。如上所述，最優(yōu)選的抑制素片段是α-亞基抑制素或其片段。就抑制素來說，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)該理解其包含帶有氨基酸取代的抑制素，這種抑制素可以在受體上提供更多的免疫原性或者更多的活性。
異源蛋白中的抑制素與下面所述的載體蛋白或者融合或者結(jié)合。當(dāng)所說的抑制素與載體蛋白質(zhì)融合，這種異源蛋白就是＂融合異源蛋白＂。當(dāng)所說的抑制素與載體蛋白質(zhì)結(jié)合，這種異源蛋白就是＂結(jié)合異源蛋白＂。優(yōu)選的異源蛋白是融合異源蛋白。
異源蛋白中的載體蛋白的同一性不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。在所說的異源蛋白中可以使用本領(lǐng)域任何已知的載體蛋白。用于本發(fā)明的載體蛋白包括，但不限于麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)＂MBP＂；牛血清白蛋白＂BSA＂；匙孔血藍(lán)蛋白＂KLH＂；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲狀腺球蛋白；任何物種的血清白蛋白；任何物種的γ球蛋白；有性生殖細(xì)胞；含有Ia抗原的有性生殖細(xì)胞；和D-和/或L-氨基酸的聚合物。優(yōu)選的載體蛋白是MBP。如果異源蛋白不施用給?；蝰R，另一個(gè)優(yōu)選的載體蛋白是BSA。如果異源蛋白不施用給鳥，另一個(gè)優(yōu)選的載體蛋白是卵清蛋白。最優(yōu)選的載體蛋白是MBP。優(yōu)選的是所說的載體蛋白對將施用的動(dòng)物是免疫原性的。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合異源蛋白的方法。產(chǎn)生結(jié)合蛋白的方法在本領(lǐng)域是公知的。在抗體-實(shí)驗(yàn)手冊(Harlow和David Lane編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988))中充分地描述了蛋白與蛋白的結(jié)合方法，其內(nèi)容本文一并參考。在神經(jīng)內(nèi)分泌的肽方法學(xué)(P.Michael Conn編輯，學(xué)院出版社，紐約，1989，其內(nèi)容本文一并參考)的第38章(605-618頁)和第42章(665-678)，第4節(jié)“抗體的制備”中詳細(xì)描述了另外的產(chǎn)生結(jié)合異源蛋白的方法(包括結(jié)合試劑，如雙醛、碳化二亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺和其它；載體蛋白和免疫過程)。
盡管在本發(fā)明的方法中可以使用結(jié)合蛋白，但融合蛋白是優(yōu)選的。更具體地說，融合的異源蛋白產(chǎn)生同源產(chǎn)物，其中所說的此蛋白的不同部分總是融合在相同的位置，并且融合的蛋白片段的數(shù)量相同。另外，可以一致地，便宜地，大量地產(chǎn)生融合異源蛋白。相反，結(jié)合異源蛋白不象融合蛋白那樣一致。例如，根據(jù)所結(jié)合的蛋白，結(jié)合反應(yīng)可以產(chǎn)生具有一種或幾種結(jié)合的蛋白、在不同的位置發(fā)生結(jié)合的蛋白或者仍沒有結(jié)合的蛋白的混合物。此外，一些結(jié)合可以在空間上阻礙所說的異源蛋白的將使用的用途(例如，在空間上阻礙了此蛋白的免疫原部分)。另外，結(jié)合反應(yīng)條件和試劑可以降解所產(chǎn)生的蛋白。例如，戊二醛通常用于結(jié)合反應(yīng)中，其能改變蛋白的構(gòu)象。并且，與融合蛋白相比，大量產(chǎn)生結(jié)合蛋白更昂貴。
本發(fā)明也針對于融合基因產(chǎn)物，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。此編碼抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因可以編碼表達(dá)鳥類抑制素、哺乳動(dòng)物抑制素、魚類抑制素或者爬蟲類抑制素。編碼所說的載體蛋白表達(dá)的基因可以編碼表達(dá)其中的麥芽糖結(jié)合蛋白或者牛血清白蛋白。優(yōu)選的編碼載體蛋白表達(dá)的基因編碼麥芽糖結(jié)合蛋白的表達(dá)。下文將更充分地描述所說的融合基因產(chǎn)物和產(chǎn)生這種融合基因產(chǎn)物的方法。
簡言之，產(chǎn)生本發(fā)明融合異源蛋白的方法包括下列步驟將融合基因產(chǎn)物插入到質(zhì)粒編碼區(qū)，用所說的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過本領(lǐng)域公知的方法由所說的宿主細(xì)胞表達(dá)融合異源蛋白。更具體地說，產(chǎn)生所說的融合異源蛋白的方法包括將編碼抑制素或其片段表達(dá)的cDNA插入到含有產(chǎn)生載體蛋白的編碼信息的載體中。在將所說的載體插入到表達(dá)系統(tǒng)后，經(jīng)此系統(tǒng)表達(dá)所說的融合異源蛋白。
許多產(chǎn)生融合異源蛋白的方法在本領(lǐng)域是公知的。因此，可以使用本領(lǐng)域任何已知的方法產(chǎn)生本發(fā)明的融合異源蛋白?？梢允褂迷S多商業(yè)上可以買到的載體試劑盒和表達(dá)系統(tǒng)制備本發(fā)明的融合異源蛋白。這種商業(yè)上可以買到的載體試劑盒和表達(dá)系統(tǒng)的例子是新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(Beverly馬薩諸塞)的pMALTM-c。在pMALTM-c系統(tǒng)中能夠發(fā)生所說的融合異源蛋白的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。下文實(shí)施例1和2充分描述了經(jīng)pMALTM-c試劑盒產(chǎn)生本發(fā)明的融合異源蛋白的方法?？梢杂脕懋a(chǎn)生本發(fā)明的融合異源蛋白的載體試劑盒和表達(dá)系統(tǒng)的其它來源包括但不限于Piscataway的Pharmacia生物技術(shù)公司(新澤西)；Palo Alto的Clonetech公司(加利福尼亞)。
本發(fā)明還涉及融合基因產(chǎn)物，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。所說的抑制素基因可以來自于任何產(chǎn)生抑制素的動(dòng)物物種。這種抑制素基因可以是鳥抑制素基因、哺乳動(dòng)物抑制素基因、爬蟲抑制素基因、兩棲動(dòng)物抑制素基因、或者魚類基因。更具體地說，哺乳動(dòng)物抑制素基因包括但不限于牛抑制素基因、人類抑制素基因、馬抑制素基因、貓抑制素基因、狗抑制素基因、綿羊抑制素基因、貂抑制素基因、狐貍抑制素基因、水獺抑制素基因、雪貂抑制素基因、浣熊抑制素基因、大鼠抑制素基因、小鼠抑制素基因、倉鼠抑制素基因、驢抑制素基因和豬抑制素基因。鳥抑制素基因包括，但不限于駝鳥抑制素基因、食火鳥抑制素基因、rhea基因、食火雞抑制素基因、無翼鳥抑制素基因、火雞抑制素基因、鵪鶉抑制素基因、雞抑制素基因、來自鸚鵡目任何成員的抑制素基因、來自獵鷹目任何成員的抑制素基因、來自piciformes任何成員的抑制素基因、來自strigiformes任何成員的抑制素基因、來自coraciformes任何成員的抑制素基因、來自ralliformes任何成員的抑制素基因、來自passeriformes任何成員的抑制素基因、來自cuculiformes任何成員的抑制素基因、來自columbiformes任何成員的抑制素基因、來自galliformes(家養(yǎng)家禽)任何成員的抑制素基因、來自anseriformes(鵝、鴨和其它水生家禽)任何成員的抑制素基因、來自herodiones任何成員的抑制素基因、來自任何一種下列鳥的抑制素基因獵鷹、鷹(eagle)、鷹(hawk)、鴿子、鸚鵡(parakeet)、美冠鸚鵡、makaw、鸚鵡(parrot)、金絲雀、八哥、巨嘴鳥、和棲息鳥(如鳴禽、 鳥、山鳥類、雀類、囀鳥和麻雀)。
優(yōu)選的抑制素基因是鳥抑制素基因。更加優(yōu)選的抑制素基因是平胸類抑制素基因。特別優(yōu)選的抑制素基因是駝鳥抑制素基因。另一個(gè)優(yōu)選的抑制素基因是食火鳥抑制素基因。另外一個(gè)優(yōu)選的抑制素基因是rhea抑制素基因。還有一個(gè)優(yōu)選的抑制素基因是雞抑制素基因。
插入到Bluescript(Stratagene，La Jolla，cA)的EcoR 1位點(diǎn)的雞抑制素α-亞基eDNA克隆(cINA6；Wang和Johnson，雞卵巢粒膜細(xì)胞抑制素的α-亞基的互補(bǔ)脫氧核糖核酸克隆和序列分析，生殖生物學(xué)，49453-458，1993，其全部內(nèi)容本文一并參考)是P.A.Johnson(Cornell大學(xué))贈(zèng)送的。在Southern測定中cINA6克隆特異性地與鴕鳥基因組DNA雜交，表明這兩個(gè)物種之間有明顯的DNA同源性(chouljenko等，作為帶有大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白的雞α-抑制素的表達(dá)和純化，家禽科學(xué)，73(suppl.1)84，1994))。使用PstI消化從cINA6克隆中切除DNA片段(“cINA521”)。cINA521DNA片段包含成熟雞抑制素α-亞基的大部分。盡管從Wang和Johnson報(bào)告的cINA6克隆中切除了cINA521，但所得的序列(SEQ ID NO1)仍不同于Wang和Johnson出版的DNA序列。
通過本領(lǐng)域公知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法獲得了駝鳥抑制素α-亞基序列。更具體地說，以Wang所報(bào)道的序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了下列引物，并用于帶有駝鳥基因組DNA的PCR反應(yīng)中5′-CTCAGCCTGCTGCAGCGCCC-3′；和5′-GTGTCGACCGCGCGACGCCGAC-3′。更具體地說，上述的引物分別相對于雞抑制素α-亞基cDNA克隆，即Wang和Johnson報(bào)道的cINA6的778至798和1348至1326碥基對。用Pst1限制性核酸內(nèi)切酶消化所得的PCR產(chǎn)物，并將其亞克隆到商業(yè)上能夠買到的載體PUC19(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)中。駝鳥Pst1片段抑制素基因的序列與雞α-抑制素相應(yīng)的部分相同。
如上所述，應(yīng)該理解載體蛋白不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。因此，編碼任何載體蛋白表達(dá)的基因都可以用于本發(fā)明中。所說的載體蛋白基因包括但不限于編碼表達(dá)下列蛋白的基因麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)＂MBP＂；牛血清白蛋白＂BSA＂；匙孔血藍(lán)蛋白＂KLH＂；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲狀腺球蛋白；任何物種的血清白蛋白；任何物種的γ球蛋白；有性生殖細(xì)胞；含有Ia抗原的有性生殖細(xì)胞；和D-和/或L-氨基酸的聚合物。優(yōu)選的載體蛋白基因是編碼表達(dá)MBP的基因。如果所得的異源蛋白不施用給?；蝰R，另一個(gè)優(yōu)選的載體蛋白基因是BSA基因。如果所得的異源蛋白不施用給鳥，另一個(gè)優(yōu)選的載體蛋白基因是卵清蛋白基因。最優(yōu)選的載體蛋白基因是編碼表達(dá)MBP的基因或其衍生物。優(yōu)選的載體蛋白基因編碼的蛋白將增加所說的宿主對這種抑制素蛋白免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和時(shí)間。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生融合基因產(chǎn)物的方法，這種方法包括將編碼抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因與編碼載體蛋白表達(dá)的基因融合。簡言之，產(chǎn)生本發(fā)明融合基因的方法包括下列步驟分離所需要的抑制素互補(bǔ)DNA(cDNA)，產(chǎn)生雙鏈抑制素DNA，獲得雙鏈載體蛋白DNA，以這樣一種方式將雙鏈抑制素DNA與雙鏈載體蛋白DNA融合，即融合的DNA能夠表達(dá)包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的融合異源蛋白。
許多分離基因和產(chǎn)生融合基因產(chǎn)物的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如參見Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis的分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，I，II，III卷。因此，可以使用本領(lǐng)域任何已知的方法產(chǎn)生本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物?？梢允褂迷S多商業(yè)上可以買到的載體試劑盒制備本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物。這種商業(yè)上可以買到的載體試劑盒的例子是新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(Beverly馬薩諸塞)的pMALTM-c。下文實(shí)施例1充分描述了由pMALTM-c試劑盒產(chǎn)生本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物的方法?？梢杂脕懋a(chǎn)生本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物的載體試劑盒的其它來源包括但不限于Piscataway的Pharmacia生物技術(shù)公司(新澤西)；Palo Alto的Clonetech公司(加利福尼亞)。
如上所述，插入到Bluescript的EcoR 1位點(diǎn)的雞抑制素α-亞基cDNA克隆(cINA6)是P.A.Johnson(Cornell大學(xué))贈(zèng)送的。使用PstI消化從cINA6克隆中切除DNA片段(＂cINA521＂)。將此片段(cINA521)符合讀框地克隆到帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(＂MBP＂)的質(zhì)粒p-MALTM-c中，在IPTG(異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷)誘導(dǎo)和SDS-PAGE后，檢測到了合適大小的融合蛋白(圖1的E道)。將所得的蛋白綴合物(＂MBP-cINA521＂)用作抗原以免疫抗循環(huán)抑制素水平的青春期前的雌性日本鵪鶉(Coturnix caturnix japonica)，這一點(diǎn)在實(shí)施例8中充分描述了。提高生產(chǎn)能力的方法意外地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物能提高動(dòng)物的生產(chǎn)能力，特別是禽類生產(chǎn)能力。因此，本發(fā)明也直接針對于通過施用本發(fā)明的異源蛋白提高動(dòng)物的生產(chǎn)能力的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括向雌性動(dòng)物施用有效量的這種蛋白質(zhì)，以便提高這種動(dòng)物的生產(chǎn)能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括向雄性動(dòng)物施用有效量的這種蛋白質(zhì)，以便提高這種動(dòng)物的生產(chǎn)能力。優(yōu)選地，在所說的動(dòng)物中發(fā)生直接抗這種蛋白的免疫反應(yīng)。更優(yōu)選地，在此動(dòng)物中發(fā)生的免疫反應(yīng)也直接抗此動(dòng)物產(chǎn)生的抑制素蛋白(內(nèi)源抑制素)。
更具體地說，本發(fā)明的方法包括向動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明異源蛋白(包含抑制素或其片段和載體蛋白)，以便此動(dòng)物的生產(chǎn)能力得到提高。優(yōu)選地，所說的動(dòng)物是鳥。應(yīng)該理解＂處理的＂鳥是指已經(jīng)施用了本發(fā)明的異源蛋白的鳥。
可以使用本發(fā)明的方法來提高任何產(chǎn)生抑制素的雌性鳥物種的生產(chǎn)能力。雌性鳥包括，但不限于平胸類、鸚鵡目、獵鷹目、piciformes、strigiformes、passeriformes、coraciformes、ralliformes、cuculiformes、columbiformes、galliformes(家養(yǎng)家禽)、anseriformes(鵝、鴨和其它水家禽)和herodiones。更具體地說，雌性鳥包括但不限于駝鳥、食火鳥、rhea、無翼鳥、食火雞、火雞、鵪鶉、雞、獵鷹、鷹(eagle)、鷹(hawk)、鴿子、鸚鵡(parakeet)、美冠鸚鵡、makaw、鸚鵡(parrot)、棲息鳥(如鳴禽、
鳥、山鳥類、雀類、囀鳥和麻雀)和鸚鵡目的任何成員。優(yōu)選的鳥是平胸類。更優(yōu)選的鳥是駝鳥。另一個(gè)優(yōu)選的平胸類是食火鳥。還有一個(gè)優(yōu)選的平胸類是rhea。另一個(gè)優(yōu)選的鳥是鸚鵡目的任何成員。另一個(gè)優(yōu)選的鳥是雞。另外，另一個(gè)優(yōu)選的鳥是鵪鶉?？梢允褂帽景l(fā)明的方法來加速瀕危鳥類物種產(chǎn)蛋的開始。這些瀕危物種包括但不限于鷹(eagle)、鷹(hawk)、禿鷹和貓頭鷹。
本發(fā)明的異源蛋白組合物中抑制素和載體蛋白可以隨此組合物所施用的鳥類物種的變化而變化。當(dāng)此組合物施用給鳥類時(shí)，使用鳥類抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白是優(yōu)選的。當(dāng)此組合物施用給平胸類時(shí)，優(yōu)選的抑制素是家養(yǎng)雞或平胸類抑制素。更優(yōu)選的是，當(dāng)此組合物施用給鴕鳥或平胸類時(shí)，優(yōu)選的抑制素是家養(yǎng)雞或鴕鳥抑制素。當(dāng)此組合物施用給雞時(shí)，另一種優(yōu)選的抑制素是家養(yǎng)雞或鴕鳥抑制素。應(yīng)該理解，異源蛋白的抑制素不必是來源于其將要施用的同一物種。例如，施用給駝鳥的異源蛋白可以由雞抑制素和載體蛋白組成。
也應(yīng)該理解所說的組合物還包括佐劑、防腐劑、稀釋劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和其它已知并用于現(xiàn)有技術(shù)疫苗中的組分。本領(lǐng)域任何已知的佐劑系統(tǒng)可用于本發(fā)明的組合物。這些佐劑包括但不限于弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、多相分散的β-1，4連接的乙?；事毒厶?＂Acemannan＂)、Titermax(CytRx公司的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物佐劑)、Chiron公司的改良的脂類佐劑、劍橋生物技術(shù)公司的皂甙衍生物佐劑(用于消滅百日咳桿菌)、革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖(LPS)、大聚合陰離子(如葡聚糖硫酸酯)、無機(jī)凝膠(如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁)。優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)是弗氏不完全佐劑。另一個(gè)優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)是弗氏完全佐劑。
可以通過本領(lǐng)域任何已知的方法將本發(fā)明的異源蛋白組合物施用給鳥類。例如，可以通過皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或者肌肉內(nèi)施用所說的組合物。優(yōu)選地，組合物通過皮下注射?？梢砸砸环N或多種劑量向鳥施用此組合物。優(yōu)選地，向鳥類以多種劑量施用此組合物，這樣在初次免疫后可進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
可以在動(dòng)物由于疾病或年齡停止排卵或者產(chǎn)生精子之前的任何時(shí)間向其施用所說的組合物。向動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物的理想年齡依據(jù)相關(guān)動(dòng)物的物種、動(dòng)物交配季節(jié)(如果有)和施用此組合物的目的而定。
例如，如果施用此組合物是為了加速產(chǎn)蛋或者精子產(chǎn)生，應(yīng)該在鳥產(chǎn)蛋或者青春期之前向其施用本發(fā)明的組合物。如上所述，向動(dòng)物首次施用本發(fā)明的組合物的理想年齡依據(jù)相關(guān)動(dòng)物的物種、動(dòng)物交配季節(jié)(如果有)、鳥的大小和此組合物中各組分(抑制素和載體蛋白)的同一性而定。
另一個(gè)例子，當(dāng)施用此組合物是為了提高正處于繁殖時(shí)期的農(nóng)業(yè)動(dòng)物的生產(chǎn)能力時(shí)，施用此組合物的理想時(shí)間是在繁殖時(shí)期開始之前。相反，向產(chǎn)蛋率和精子產(chǎn)生率受到抑制的成熟動(dòng)物施用此組合物時(shí)，應(yīng)該在這種抑制作用確定之前就施用此組合物。
關(guān)于處于繁殖時(shí)期的動(dòng)物，盡管可以向鳥類(如任何年齡的平胸類)施用本發(fā)明的異源蛋白，但在此鳥的首次繁殖時(shí)期之前的6個(gè)月內(nèi)免疫該鳥是理想的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解一般雌性鳥在首次繁殖時(shí)期開始產(chǎn)蛋。在所說的鳥首次繁殖時(shí)期前大約6個(gè)月對其進(jìn)行免疫，然后在其首次繁殖時(shí)期前以一個(gè)月為間隔進(jìn)行加強(qiáng)免疫是更優(yōu)選的。在所說的鳥首次繁殖時(shí)期前大約6個(gè)月對其進(jìn)行免疫，然后在這6個(gè)月期間以一個(gè)月為間隔進(jìn)行加強(qiáng)免疫是優(yōu)選的。
例如，增加雌性駝鳥蛋的產(chǎn)生的最好結(jié)果是在其首次繁殖時(shí)期前大約6個(gè)月對其進(jìn)行首次免疫，然后在這6個(gè)月期間每隔一個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫。首次免疫的量為大約0.5-4.5mg本發(fā)明的異源蛋白。加強(qiáng)免疫的量為大約0.30-3.0mg本發(fā)明的異源蛋白。優(yōu)選的是，首次免疫的量為大約1.5-3.0mg本發(fā)明的異源蛋白，加強(qiáng)免疫的量為大約0.75-1.5mg本發(fā)明的異源蛋白。在首次免疫中將異源蛋白在弗氏完全佐劑(Sigma化學(xué)公司St.Louis MO)中乳化，在加強(qiáng)免疫中將所說的異源蛋白在弗氏不完全佐劑(Sigma)中乳化也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是，皮下注射所說的異源蛋白組合物。最優(yōu)選的是，在駝鳥上面大腿區(qū)的三個(gè)位置上皮下注射所說的異源蛋白組合物。
向鳥施用的本發(fā)明異源蛋白的量依據(jù)鳥的物種、鳥的年齡和體重而變化，施用此蛋白的時(shí)間與繁殖時(shí)期(如果此鳥有繁殖時(shí)期)、施用此蛋白的次數(shù)有關(guān)。另外，施用計(jì)劃(或處理計(jì)劃)的開始依據(jù)鳥的物種、鳥物種平均青春期年齡、該鳥的家族史(與青春期年齡的家族史有關(guān))、該鳥在一年中何時(shí)孵化、該鳥的營養(yǎng)狀況(高營養(yǎng)的鳥的青春期較營養(yǎng)不足的鳥來得早)、在給藥開始時(shí)鳥的整體健康狀況、鳥的免疫能力、鳥的長期健康史、極端天氣條件的存在(延長的過分嚴(yán)酷的天氣，如雨、高溫或此鳥不適應(yīng)的風(fēng))、居住條件(過分擁擠)和活動(dòng)的缺乏而變化。
由于本發(fā)明的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定多少異源蛋白對引起此鳥對此蛋白的免疫反應(yīng)是必需的。
提高生產(chǎn)能力的方法的另一個(gè)例子如下。向哺乳動(dòng)物施用免疫有效量的結(jié)合異源蛋白組合物，以便此動(dòng)物產(chǎn)生直接抗所說的異源蛋白的免疫反應(yīng)。所說的異源蛋白優(yōu)選包括與麥芽糖結(jié)合蛋白結(jié)合的哺乳動(dòng)物抑制素。另一個(gè)優(yōu)選的結(jié)合異源蛋白包含鳥類或者爬蟲抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白。
例如，下面是對在實(shí)施例8中詳細(xì)討論的本發(fā)明的提高日本鵪鶉生產(chǎn)能力的方法的簡要概述。未進(jìn)行處理的鵪鶉的平均青春期年齡為大約六至八周。下面是體重大約為0.1至0.25磅的日本鵪鶉的處理計(jì)劃在其第25天日齡時(shí)首次(第一次)注射0.75mg本發(fā)明的異源蛋白；在第32，39，46，53，60和90天日齡時(shí)進(jìn)行0.375mg的加強(qiáng)免疫，之后每隔35天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次(即在95，130和165日齡時(shí))。
更具體地說，在25日齡時(shí)，將50只雌性鵪鶉如下隨機(jī)均等地分成兩個(gè)注射組(每組25只)(1)MBP-cINA521的弗氏佐劑溶液(＂MBP-cINA521/FRN＂)，或者(2)弗氏佐劑(佐劑對照；＂FRN＂)。對抗抑制素免疫的鳥(1組)每只注射大約0.75mg MBP-cINA521(溶解在合適的對照載體中)。對第2組進(jìn)行相同載體體積(0.2ml)的注射。所有的注射都是使用配有25號針頭的結(jié)核菌素注射器在皮下進(jìn)行的。如上所述，對每只鳥皮下進(jìn)行大約0.375mg MBP-cINA521的加強(qiáng)抑制素免疫或者注射合適的對照，并觀察總共20周。
從41日齡(認(rèn)為是產(chǎn)蛋周期的第一天)開始，連續(xù)20周記錄雌鳥的日產(chǎn)蛋量(＂HDEP＂)和死亡率(＂MORT＂)。此外，對每一個(gè)處理組計(jì)算第一次產(chǎn)蛋的平均年齡(＂FIRST＂)和此鳥產(chǎn)蛋達(dá)到50％的年齡(＂FIFTY＂)。實(shí)施例8詳細(xì)討論了這些，并對HDEP，MORT，F(xiàn)IRST和FIFTY數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析。
抑制素的免疫中和明顯地加速了雌鵪鶉的青春期。如表2所示，抑制素處理的雌鳥第一次產(chǎn)蛋的平均年齡降低(P＜.0088)接近6天。同樣，如表3所示，抑制素處理的雌鳥50％(FIFTY)產(chǎn)蛋年齡顯著降低(12天；P＜.01)。
如圖2所示，抑制素處理對產(chǎn)蛋強(qiáng)度的正面影響也存在，在活動(dòng)周期的開始和結(jié)束最明顯。例如，和FRN對照比較，觀察到MBP-cINA521/FRN處理的雌鳥在第1周(16.5vs 2.6％)，第2周(50.0vs 28.6％)，第4周(96.6vs79.7％)HDEP率平均值明顯地增加，在第15周(98.8vs 86.9％)，第16周(96.9vs 86.3％)，第18周(85.7vs 66.1％)，第20周(96.8％vs 73.8％)又觀察到明顯的增加(P＜.05)。在整個(gè)產(chǎn)蛋的20周，抑制素處理的雌鳥的總HDEP率為83.5％，對照為75.4％(P＜.14)。
除加速青春期、延長產(chǎn)蛋期和提高總產(chǎn)蛋強(qiáng)度外，抑制素處理降低達(dá)到高峰產(chǎn)蛋所需的時(shí)間約3周。參考圖2，比較MBP-cINA521/FRN(其在第4周時(shí)HDEP為96.6％)和FRN(其第7周時(shí)HDEP為96.6％)。盡管未在統(tǒng)計(jì)學(xué)上評價(jià)HDEP峰值的差異，但雌鳥達(dá)到50％HDEP水平(FIFTY)時(shí)平均年齡的差異反應(yīng)了不同的峰值。
因?yàn)橹挥?只鳥死亡(3個(gè)對照，5個(gè)處理)，所以死亡率不是此研究中的因素。16％的死亡率對于已達(dá)到180日齡的鵪鶉來說是在預(yù)料之中的。
研究了這種處理對大多數(shù)定時(shí)生物反應(yīng)的開始、程度和延續(xù)時(shí)間的影響。本文所列出的數(shù)據(jù)大部分是日本鵪鶉整個(gè)產(chǎn)蛋期(即青春期或產(chǎn)蛋期后的20周)的數(shù)據(jù)。因此，下面有關(guān)抑制素免疫中和作用對此物種產(chǎn)蛋的開始、程度和持續(xù)時(shí)間的影響是得到證實(shí)的。
這些數(shù)據(jù)支持這樣一個(gè)結(jié)論，即抑制素免疫中和的組青春期的開始得到了加速。在FIRST和FIFTY兩個(gè)變量中所見到的明顯處理差異和在最初幾周的HDEP數(shù)據(jù)中所見到的差異都證明了這一點(diǎn)。
與抑制素處理的鳥的產(chǎn)蛋期的延長相關(guān)聯(lián)的青春期的加速導(dǎo)致標(biāo)記的總HDEP的增加(8.1％)。例如，以單個(gè)雌鳥為基礎(chǔ)，抑制素處理實(shí)質(zhì)上是在雌鳥具有生育能力(即能夠產(chǎn)蛋)的產(chǎn)蛋期間的每一天，每日獲得大約0.081個(gè)蛋。這就是說，在檢驗(yàn)的20周期間，由所飼養(yǎng)的每一個(gè)雌鳥可以多獲得11個(gè)蛋(0.081個(gè)蛋/母雞×140天的產(chǎn)蛋期＝每個(gè)雌鳥每個(gè)產(chǎn)蛋期為11.34個(gè)蛋)。
在雞和火雞中發(fā)現(xiàn)的與在Coturnix中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相類似的結(jié)果與家禽工業(yè)具有重要的戰(zhàn)略關(guān)系。應(yīng)該注意針對產(chǎn)蛋強(qiáng)度選擇日本鵪鶉，并且認(rèn)為Coturnix的產(chǎn)蛋潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于商業(yè)上飼養(yǎng)的只是為了提供食用蛋的雌性雞(單冠白來亨雞)的產(chǎn)蛋潛力。因此，在選擇的用來進(jìn)行肉生產(chǎn)(如所飼養(yǎng)的用于消費(fèi)其肉的適于烤焙的雞種雞)而不是用來進(jìn)行蛋生產(chǎn)的雞中，經(jīng)抑制素接種而導(dǎo)致的產(chǎn)蛋強(qiáng)度的增加可能更大。
因此，上述數(shù)據(jù)表明由于本發(fā)明的抑制素組合物加速了日本鵪鶉青春期的開始，增加了產(chǎn)蛋強(qiáng)度，加速了最大產(chǎn)蛋期開始，所以提高了其生產(chǎn)能力。因?yàn)閷τ陔u的繁殖系統(tǒng)，日本鵪鶉是可以接收的動(dòng)物模型，所以上述數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的方法也將加速雞產(chǎn)蛋的開始。因此，本發(fā)明的方法將導(dǎo)致產(chǎn)蛋者在較低的飼養(yǎng)成本下能夠產(chǎn)生更多的蛋。
上述數(shù)據(jù)也顯示因?yàn)楸景l(fā)明的抑制素組合物能使提高的溫度對日本鵪鶉產(chǎn)蛋率的不利影響降至最小，所以其能提高其生產(chǎn)能力。更具體地說，在實(shí)施例8所描述的研究的第18周，這種鵪鶉暴露在提高的溫度下，沒有發(fā)生不利影響。如圖2所示，第1組鳥(用MBP-cINA521/FRN處理)的產(chǎn)蛋率下降大約5％。相反，第2組鳥(對照FRN)的產(chǎn)蛋率下降大約26％。因此，本發(fā)明的提高生產(chǎn)能力的方法能改善不利的產(chǎn)蛋條件對產(chǎn)蛋率的副作用。因?yàn)椋仪萁?jīng)常在開放的無控制環(huán)境中飼養(yǎng)，所以本發(fā)明的這一方面是具有重要意義的。這樣，種禽經(jīng)常暴露在不利的條件(如高溫和其它它們不能適應(yīng)的極端天氣條件)下，就降低了家禽工業(yè)的產(chǎn)蛋率。
下面是對在實(shí)施例9中討論的本發(fā)明的提高鴕鳥生產(chǎn)能力的方法的簡要概述。未進(jìn)行處理的鴕鳥的平均青春期年齡為大約28至32個(gè)月。下面是體重大約為150至300磅的鴕鳥的處理計(jì)劃在其26月齡時(shí)首次(第一次)注射5.0mg本發(fā)明的異源蛋白；在第27，28，30，32，34，和36月齡時(shí)進(jìn)行2.5mg的加強(qiáng)免疫。
下面是對在實(shí)施例10中討論的本發(fā)明的提高食火鳥生產(chǎn)能力的方法的簡要概述。未進(jìn)行處理的食火鳥的平均青春期年齡為大約20個(gè)月。下面是體重大約為50至90磅的食火鳥的處理計(jì)劃在其18月齡時(shí)首次(第一次)注射3.0mg本發(fā)明的異源蛋白；在第19，20，22，24，26和30月齡時(shí)進(jìn)行1.5mg的加強(qiáng)免疫。
下面是對在實(shí)施例11中討論的本發(fā)明的提高雞生產(chǎn)能力的方法的簡要概述。未進(jìn)行處理的雞的平均青春期年齡為大約20周。下面是體重大約為2.0至3.5磅的雞的處理計(jì)劃在其15周齡時(shí)首次(第一次)注射1.5mg本發(fā)明的異源蛋白；在第17，20，24，30，40和50周齡時(shí)進(jìn)行0.75mg的加強(qiáng)免疫。
下面是對在實(shí)施例12中詳細(xì)討論的本發(fā)明的提高火雞生產(chǎn)能力的方法的簡要概述。未進(jìn)行處理的火雞的平均青春期年齡為大約30周。下面是體重大約為9.0至12磅的火雞的處理計(jì)劃在其28周齡時(shí)首次(第一次)注射2.0mg本發(fā)明的異源蛋白；在第29，30，34，38，46和54月齡時(shí)進(jìn)行1.0mg的加強(qiáng)免疫。
下面是對在實(shí)施例13中討論的本發(fā)明的提高鸚鵡生產(chǎn)能力的方法的簡要概述。未進(jìn)行處理的鸚鵡的平均青春期年齡為大約30個(gè)月。下面是體重大約為0.5至1.25磅的鸚鵡的處理計(jì)劃在其28月齡時(shí)首次(第一次)注射0.75mg本發(fā)明的異源蛋白；在第29，30，32，34，36和38月齡時(shí)進(jìn)行0.375mg的加強(qiáng)免疫。
如上所述，本發(fā)明的方法通過加速其所施用的動(dòng)物的青春期的開始提高了其生產(chǎn)能力。有關(guān)產(chǎn)蛋開始的術(shù)語＂加速＂指處理過的鳥產(chǎn)蛋開始較未處理的鳥產(chǎn)蛋通常開始的時(shí)間早至少大約3％。優(yōu)選的是產(chǎn)蛋早開始至少大約5％，更優(yōu)選的是產(chǎn)蛋早開始至少大約7％。甚至更優(yōu)選的是產(chǎn)蛋早開始至少大約10％，最優(yōu)選的是產(chǎn)蛋較未處理的鳥產(chǎn)蛋開始的時(shí)間早至少大約13％。
另外，如上所述，本發(fā)明的方法通過增加動(dòng)物蛋產(chǎn)生或精子產(chǎn)生的強(qiáng)度提高了其生產(chǎn)能力。有關(guān)蛋產(chǎn)生的術(shù)語＂增加＂指與未處理的鳥蛋產(chǎn)生量相比，處理過的鳥的產(chǎn)蛋量增加至少大約3％。優(yōu)選的是產(chǎn)蛋量增加至少大約7％，更優(yōu)選的是產(chǎn)蛋量增加至少大約12％。
此外，如上所述，本發(fā)明的方法通過加速最大產(chǎn)蛋期的開始提高了其生產(chǎn)能力。有關(guān)最大產(chǎn)蛋期開始的術(shù)語＂加速＂指處理過的鳥最大產(chǎn)蛋期開始較未處理的鳥產(chǎn)蛋通常開始的時(shí)間早至少大約3％。優(yōu)選的是最大產(chǎn)蛋期早開始至少大約5％，更優(yōu)選的是早開始至少大約7％。甚至更優(yōu)選的是早開始至少大約10％，最優(yōu)選的是較未處理的鳥通常最大產(chǎn)蛋期開始的時(shí)間早至少大約13％。
令人驚奇的是，本發(fā)明的組合物也可以用來增加鳥類一生的總產(chǎn)蛋量。有關(guān)一生總產(chǎn)蛋量的術(shù)語＂增加＂指處理過的鳥一生總產(chǎn)蛋量較未處理的鳥的一生總產(chǎn)蛋量增加至少大約3％。優(yōu)選的是一生總產(chǎn)蛋量增加至少大約7％，更優(yōu)選的是一生總產(chǎn)蛋量增加至少大約12％。最優(yōu)選的是一生總產(chǎn)蛋量增加至少大約13％。
出乎意料的是，本發(fā)明的組合物也可以用來減少或消除雌鳥換羽的需要，如通過提供第二次產(chǎn)蛋周期延長產(chǎn)蛋期。更具體地說，如果連續(xù)地向雌鳥施用上述的組合物(如上述方法公開的那樣)，與未用本發(fā)明的組合物處理的鳥相比，這些鳥的產(chǎn)蛋率將保持足夠高以致于其不需要換羽來提高其產(chǎn)蛋率。當(dāng)雌鳥(如母雞(單冠白來亨雞，食用蛋生產(chǎn)者))的產(chǎn)蛋量下降以致于維持雌鳥產(chǎn)蛋的經(jīng)濟(jì)成本超過了其產(chǎn)生的蛋的經(jīng)濟(jì)收益，此時(shí)本領(lǐng)域一般使雌鳥換羽。給母雞＂換羽＂，即讓雌鳥經(jīng)歷大約4-14天的禁食期，直到其開始換羽(如失去羽毛)。在換羽期間，這些鳥停止產(chǎn)蛋。在這些鳥恢復(fù)到正常的飼養(yǎng)水平后一段時(shí)期，開始產(chǎn)蛋。從禁食到下一個(gè)產(chǎn)蛋周期，整個(gè)換羽期大約為兩個(gè)月。實(shí)際上，鳥的產(chǎn)蛋率得到恢復(fù)。然而，在雞換羽后，其在下一個(gè)周期的產(chǎn)蛋率與在第一個(gè)(換羽前)產(chǎn)蛋周期的產(chǎn)蛋率不同。M.North和D.Bell.商用雞的生產(chǎn)手冊，第4版，第19章，紐約的Van Norstrand Reinhold出版。
例如，雞在大約20周時(shí)開始產(chǎn)蛋，經(jīng)濟(jì)效益明顯的產(chǎn)蛋期為大約40至50周。在產(chǎn)蛋高峰，雞每10天產(chǎn)8-9個(gè)蛋。然而，在產(chǎn)蛋大約50周后，產(chǎn)蛋率降至產(chǎn)蛋高峰的大約60％。此時(shí)，飼養(yǎng)雞的成本高于其所產(chǎn)蛋的價(jià)值。通常的作法是此時(shí)使雞換羽，以便雞重新產(chǎn)蛋時(shí)，產(chǎn)蛋率增加。在這些鳥中雞和鵪鶉的＂產(chǎn)蛋期的延長＂，即延長產(chǎn)蛋期大約1-4周。
因此，由于與沒有用本發(fā)明的組合物處理的鳥相比，此組合物能保持更高水平的產(chǎn)蛋率，所以其能減少或消除使鳥換羽的要求。減少或不需要換羽是一種大大的節(jié)約。更具體地說，在鳥換羽期間或之前，這些鳥不能生產(chǎn)出它的飼養(yǎng)成本直到其換羽完成，然后在飼喂開始后的一段時(shí)間其也不能生產(chǎn)出其飼養(yǎng)的成本。因此將產(chǎn)蛋率保持在增加的水平能消除或減少鳥這些不生產(chǎn)的時(shí)期，從而降低生產(chǎn)者成本，增加生產(chǎn)者的利潤。因?yàn)槿缟纤鰮Q羽后的產(chǎn)蛋率不等于第一個(gè)產(chǎn)蛋周期的產(chǎn)蛋率，所以將產(chǎn)蛋率保持在增加的水平還能增加蛋生產(chǎn)者的利潤。
簡言之，通過施用有效量的本發(fā)明的異源蛋白誘導(dǎo)鳥發(fā)生免疫反應(yīng)來增加鳥的產(chǎn)蛋率，因此不再需要使鳥換羽，并且之后再施用異源蛋白(加強(qiáng)免疫)，以便保持更高水平的產(chǎn)蛋率。
因此，本發(fā)明的方法提高產(chǎn)生抑制素的雌性動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、爬蟲和鳥(如平胸類))的生產(chǎn)能力。更具體地說，此方法提高雌性平胸類(如駝鳥、食火鳥和rhea)和雞的生產(chǎn)能力。出乎意料的是，本發(fā)明的方法促進(jìn)了動(dòng)物青春期或者首次產(chǎn)蛋的開始。另外，本發(fā)明的方法加速了動(dòng)物最大產(chǎn)蛋期的開始。此外，本發(fā)明的方法增加了動(dòng)物的產(chǎn)蛋數(shù)量。并且，本發(fā)明的方法延長了動(dòng)物的最大產(chǎn)蛋期。還有，此方法增加了動(dòng)物一生的總產(chǎn)蛋。對于鳥類，本發(fā)明的方法也改進(jìn)了鳥的飼料轉(zhuǎn)化率。另外，本發(fā)明的方法出乎意料地減少或者消除了不利的產(chǎn)蛋的條件對暴露在這種條件下的動(dòng)物的產(chǎn)蛋率的影響。這些不利條件包括升高的溫度、過分擁擠、營養(yǎng)缺乏和噪音。
盡管不想被下列內(nèi)容限制，但理論上本發(fā)明提高生產(chǎn)能力的方法在沒有為蛋的多產(chǎn)而進(jìn)行過遺傳選擇的物種中能提供更高的產(chǎn)蛋量。對于某些鳥類這是特別正確的。例如，自19世紀(jì)20年代晚期，對蛋雞的最大生產(chǎn)能力進(jìn)行了遺傳選擇(例如參見，Jull，M.A，1932，家禽育種，John Wiley和Sons)。鑒于雞的生活周期短，從大約1928年到現(xiàn)在進(jìn)行了此性狀的大量選擇。相反，平胸類和鸚鵡、大多數(shù)其它外來鳥和在較少程度上的肉雞(適于烤焙的雞)沒有進(jìn)行過蛋的多產(chǎn)的遺傳選擇。另外，瀕危的鳥也沒有進(jìn)行過蛋的多產(chǎn)的遺傳選擇。因此，蛋雞已是遺傳上優(yōu)良的產(chǎn)蛋者，與遺傳上產(chǎn)蛋差至中等的鳥相比，其以本發(fā)明的方法處理所見到的增加的量是有限的。因此，用本發(fā)明的方法處理遺傳上沒有對蛋的多產(chǎn)性進(jìn)行過選擇的鳥(如平胸類、鸚鵡目、其它外來的鳥、瀕危鳥類、火雞和肉雞)，其生產(chǎn)能力增加的量更大。
以本發(fā)明的異源蛋白免疫動(dòng)物能誘導(dǎo)該動(dòng)物產(chǎn)生選擇性地抗此異源蛋白的抗體。優(yōu)選地，免疫也誘導(dǎo)此動(dòng)物產(chǎn)生選擇性地抗內(nèi)源抑制素的抗體。鳥產(chǎn)生的這種抗體能減少青春期或者產(chǎn)蛋的開始。動(dòng)物產(chǎn)生的這種抗體也增加動(dòng)物的產(chǎn)蛋能力或者精子的產(chǎn)生能力，因?yàn)樗f的抗體中和了動(dòng)物血液中的抑制素的生物活性。
盡管不想被下列理論限制，但認(rèn)為抑制素的α-亞基與FSH受體結(jié)合，因此競爭性地抑制了FSH與這種受體位點(diǎn)的結(jié)合。降低可以結(jié)合受體位點(diǎn)的抑制素的水平，由于FSH受體位點(diǎn)競爭的降低，所以增加了動(dòng)物中FSH的生物作用。一般認(rèn)為這些抗體通過與循環(huán)抑制素相互作用而中和這些抑制素，因此在空間上(stearically)干擾了相互作用的抑制素結(jié)合到FSH受體位點(diǎn)上。
出乎意料地，本發(fā)明的方法也改進(jìn)了產(chǎn)生抑制素的雄性動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、爬蟲和鳥)的生產(chǎn)能力。更具體地說，本發(fā)明的方法增加雄性動(dòng)物的睪丸激素水平。類似的是，本發(fā)明的方法增加雄性動(dòng)物青春期或者精子產(chǎn)生的開始。另外，本發(fā)明的方法促進(jìn)了雄性動(dòng)物最大精子產(chǎn)生期的開始。此外，本發(fā)明的方法增加了雄性動(dòng)物精子產(chǎn)生的強(qiáng)度(精子數(shù))。還有，本發(fā)明的方法延長了動(dòng)物的最大精子產(chǎn)生期。另外，本發(fā)明的方法增加了雄性動(dòng)物的精液體積。并且，本發(fā)明的方法提高了動(dòng)物精子的存活力。另外，本發(fā)明的方法意外地減少或消除了不利的條件對暴露在這種不利的條件下的動(dòng)物精子產(chǎn)生的影響。這種不利的條件包括升高的溫度、過分擁擠、營養(yǎng)缺乏和噪音。令人驚奇的是，本發(fā)明的方法增加了性欲，因此增加了雄性鳥類的生殖潛力。
本發(fā)明的另一個(gè)未預(yù)料到的和驚人的方面是與未處理的鳥產(chǎn)的蛋相比，本發(fā)明的組合物也產(chǎn)生更多的膽固醇含量較低的蛋。更具體地說，如果以上述的方法將上述的組合物施用給雌鳥，與未用本發(fā)明的組合物處理過的鳥相比，其在較長一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生膽固醇含量較低的蛋。因此，本發(fā)明的組合物增加或者產(chǎn)生更大量的低膽固醇蛋。
術(shù)語＂增加＂或者＂更大量的＂指與未處理的鳥產(chǎn)生的低膽固醇蛋的數(shù)量相比處理過的鳥產(chǎn)生的低膽固醇蛋的數(shù)量增加至少大約2％。優(yōu)選地，所產(chǎn)生的低膽固醇蛋的數(shù)量增加至少大約5％，更優(yōu)選的是增加至少大約10％。＂處理的＂鳥應(yīng)該理解為已經(jīng)施用了本發(fā)明的異源蛋白的鳥。術(shù)語＂更低的膽固醇＂或者＂低的膽固醇＂指蛋的膽固醇含量比此種鳥一生中所產(chǎn)的蛋的平均膽固醇含量低至少大約10％。優(yōu)選的是低膽固醇蛋的膽固醇含量比此平均值低至少大約20％。更優(yōu)選的是低膽固醇蛋的膽固醇含量比此平均值低至少大約30％。
已知在雞中，在雌鳥(母雞)達(dá)到青春期后首先產(chǎn)出的五至六個(gè)蛋較其后來產(chǎn)的蛋的膽固醇含量低。本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)雌鳥在更長的一段時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生膽固醇含量較低的蛋。因?yàn)榕c血液中的高膽固醇水平相聯(lián)系的健康狀況的原因，仍然需要低膽固醇含量的蛋產(chǎn)品。因此本發(fā)明的組合物向蛋的生產(chǎn)者提供了很好的蛋雞。使用所說的融合基因產(chǎn)物的基因治療本發(fā)明也涉及通過向所說的動(dòng)物施用融合基因產(chǎn)物來改進(jìn)這些動(dòng)物生產(chǎn)能力的方法，所說的融合基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因?？梢詫⒈景l(fā)明的融合基因產(chǎn)物直接施用給所說的動(dòng)物，或者可以以載體或者包含載體(其中具有融合基因產(chǎn)物)的細(xì)胞施用本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物。
體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中(N.Yang，生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)綜述12(4)335-356(1992)，其內(nèi)容本文一并參考)描述了為了基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達(dá)，將DNA轉(zhuǎn)移或者送遞到細(xì)胞中的各種方法(也被稱為基因治療)。為了在來自體內(nèi)或者體內(nèi)的療法中使用DNA序列，基因治療包括將DNA序列加入到體細(xì)胞或者胚系細(xì)胞中?；蛑委煹墓δ苁谴婊颍黾诱；蛘叻钦５幕蚬δ?。
基因治療的策略包括治療策略，如鑒定缺陷基因，然后加入功能基因以便替代缺陷基因的功能或者稍微增加此基因的功能；或者預(yù)防策略，如加入所說的產(chǎn)物蛋白的基因。預(yù)防策略的例子為將編碼抑制素或其片段和載體蛋白的融合基因產(chǎn)物置于動(dòng)物中，由于所說的免疫反應(yīng)繼發(fā)性地降低動(dòng)物的抑制素水平。
任何轉(zhuǎn)移本發(fā)明的融合的基因產(chǎn)物的方案都作為本發(fā)明的一部分考慮了。啟動(dòng)子序列(而不是其它任何正常發(fā)現(xiàn)的與抑制素特異相關(guān)的啟動(dòng)子序列)或其它將降低抑制素蛋白生產(chǎn)的序列的轉(zhuǎn)染也都被預(yù)見為基因治療的方法。在馬薩諸塞的劍橋轉(zhuǎn)核療法公司中有這一技術(shù)的例子，其是使用同源重組插入在細(xì)胞中證明是紅細(xì)胞生成素基因的“基因開關(guān)”。參見基因工程報(bào)導(dǎo)，1994年4月15日。
用于基因治療的轉(zhuǎn)基因方法包括三大類物理方法(如電穿孔、直接基因轉(zhuǎn)移和粒子轟擊)、化學(xué)方法(以類脂為基礎(chǔ)的載體或者其它非病毒載體)和生物學(xué)方法(病毒衍生的載體和受體攝取)。例如，可以使用包含涂上一層DNA的脂質(zhì)體的非病毒載體?？梢詫⑦@種脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物直接靜脈內(nèi)注射到動(dòng)物體內(nèi)。一般認(rèn)為脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物是在將所說的DNA送遞到巨噬細(xì)胞和星形細(xì)胞的肝臟中完成的。這些細(xì)胞壽命長，這樣可以使送遞的DNA長期表達(dá)。另外，可以直接將載體或者“裸露”的DNA基因注射到所需要的器官、組織或者腫瘤，以便完成治療DNA的目標(biāo)送遞。
也可以以送遞位點(diǎn)描述基因治療的方法?；镜乃瓦f基因的方法包括來自體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和體外基因轉(zhuǎn)移。在來自體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移中，從所說的動(dòng)物獲得細(xì)胞并將其在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)。用所說的DNA轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量，然后重新植入到該動(dòng)物中。在體外基因轉(zhuǎn)移中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是生長在培養(yǎng)物中的細(xì)胞，如組織培養(yǎng)細(xì)胞，不是特定動(dòng)物的特定細(xì)胞。轉(zhuǎn)染這些“實(shí)驗(yàn)細(xì)胞”，選擇并擴(kuò)增這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以便用于植入到動(dòng)物體內(nèi)或者其它用途。
體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移涉及到將所說的DNA導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞(當(dāng)細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)時(shí))中。其方法包括使用病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，即使用非感染病毒將所說的基因送遞到動(dòng)物中，或者將裸露的DNA注射到動(dòng)物的某一部位中，并由部分表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白的細(xì)胞攝取這些DNA。另外，可以使用本文描述的其它方法(如使用“基因槍”)用于體外插入抑制素DNA或者抑制素調(diào)節(jié)序列。
基因治療的化學(xué)方法包括以類脂為基礎(chǔ)的化合物(未必是脂質(zhì)體)使所說的DNA通過細(xì)胞膜。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑或細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑，以類脂為基礎(chǔ)的與帶負(fù)電的DNA結(jié)合的正離子形成能穿過細(xì)胞膜的復(fù)合物，并在細(xì)胞的內(nèi)側(cè)提供DNA。另一個(gè)化學(xué)方法使用以受體為基礎(chǔ)的胞吞，其涉及將特異的配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合、將其包膜并運(yùn)過細(xì)胞膜。所說的配體與所說的DNA結(jié)合，并將整個(gè)復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。將所說的配體基因復(fù)合物注射到血液中，然后具有所說的受體的靶細(xì)胞特異性地與配體結(jié)合，并將這種配體-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到這種細(xì)胞中。
許多基因治療方法使用病毒載體把基因插入到細(xì)胞中。例如，已經(jīng)在來自體內(nèi)的方法中使用了改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以便將基因?qū)氲酵鈬湍[瘤浸潤淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、表皮細(xì)胞、肌細(xì)胞或者其它體細(xì)胞中。然后將這些改變的細(xì)胞引入到動(dòng)物體內(nèi)，以便由插入的DNA提供所說的基因產(chǎn)物。
病毒載體也用來經(jīng)體內(nèi)方案將基因插入到細(xì)胞中。為了指導(dǎo)外來基因的組織特異性表達(dá)，可以使用已知對組織特異性的順式作用調(diào)節(jié)元件或啟動(dòng)子。另外，可以通過將DNA或病毒載體原位送遞到體內(nèi)特異性構(gòu)造的位點(diǎn)上來實(shí)現(xiàn)。例如，通過體外在選擇的動(dòng)脈壁位點(diǎn)上植入轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞來體內(nèi)完成基因到血管的轉(zhuǎn)移。此病毒能夠感染也表達(dá)此基因產(chǎn)物的周圍細(xì)胞。例如可以通過導(dǎo)管將病毒載體直接送遞到體內(nèi)的位點(diǎn)，這樣使只有特定的位點(diǎn)由此病毒感染，并提供長期的位點(diǎn)特異性的基因表達(dá)。通過將改變的病毒注射到血管并到達(dá)器官，也已經(jīng)在乳房組織和肝組織中實(shí)現(xiàn)了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。
已用于基因治療方案的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、其它RNA病毒(如脊髓灰質(zhì)炎病毒或者新培斯病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、SV 40、牛痘和其它DNA病毒。復(fù)制缺陷鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最廣泛使用的基因轉(zhuǎn)移載體。鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒是由復(fù)合有核心蛋白和聚合酶(pol)的單鏈RNA組成，其由蛋白核心(gag)包住并由確定宿主范圍的糖蛋白包膜(env)包圍。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)包括gag，pol和env基因，附帶有5′和3′的長末端重復(fù)序列(LTR)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的使用是基于這樣的事實(shí)，即如果在包裝細(xì)胞系中跨膜(in trans)提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白，包含5′和3′LTRs和包裝信號的基本載體足以使載體包裝、感染并整合到靶細(xì)胞中。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因轉(zhuǎn)移的根本好處包括有效的感染和在大多數(shù)細(xì)胞類型中的基因表達(dá)、精確的單拷貝載體在靶細(xì)胞染色體DNA上的整合和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組操作的容易性。
腺病毒是由復(fù)合有核心蛋白并由病毒衣殼蛋白包圍的線性雙鏈的DNA組成。分子病毒學(xué)的進(jìn)展使得能夠利用這些有機(jī)體的生物學(xué)以便創(chuàng)造能夠?qū)⑿禄蛐蛄畜w內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞中的載體。以腺病毒為基礎(chǔ)的載體將以高水平表達(dá)基因產(chǎn)物肽。腺病毒載體甚至以低滴度的病毒也具有高效的感染性。此外，這些病毒作為非細(xì)胞的病毒顆粒是完全感染的，這樣不必注射生產(chǎn)者細(xì)胞系。腺病毒載體的另一個(gè)潛在優(yōu)點(diǎn)是能夠體內(nèi)完成異源基因的長期表達(dá)。
DNA送遞的機(jī)械方法包括融合類脂泡(如脂質(zhì)體或者用于膜融合的其它泡)、結(jié)合陽離子類脂的DNA類脂顆粒(如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑)、多聚賴氨酸介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、DNA直接注射(如將DNA微注射到胚性或者體細(xì)胞中)、由空氣作用送遞的涂上一層DNA的顆粒(如用于“基因槍”的金顆粒)和無機(jī)的化學(xué)方法(如磷酸鈣轉(zhuǎn)染)。另一種配體介導(dǎo)的基因治療方法涉及將所說的DNA與特異的配體復(fù)合以形成配體-DNA綴合物，將所說的DNA導(dǎo)入到特定的細(xì)胞或者組織中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將質(zhì)粒DNA注射到肌肉細(xì)胞中能產(chǎn)生很高比例的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，這些細(xì)胞并能完成標(biāo)記基因的表達(dá)。所說的質(zhì)粒DNA可以或不整合到這些細(xì)胞的基因組上。非整合的轉(zhuǎn)染DNA將使最終分化的非增殖性的組織更長時(shí)間地轉(zhuǎn)染和表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白，而不擔(dān)心細(xì)胞或線粒體基因組發(fā)生突變性的插入、缺失或者改變。將治療基因長期(但未必永久)轉(zhuǎn)移到特異性的細(xì)胞中可以使遺傳疾病得到治療或者用于預(yù)防用途?？梢远ㄆ诘刂匦伦⑸渌f的DNA以便保證在受體細(xì)胞的基因組中的基因產(chǎn)物沒有發(fā)生突變。非整合的外源DNAs允許在一個(gè)細(xì)胞中可以存在幾種不同的外源DNA構(gòu)建體，這樣所有的構(gòu)建體都表達(dá)不同的基因產(chǎn)物。
顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法首先用于轉(zhuǎn)化植物組織中。使用粒子轟擊裝置或＂基因槍＂，可以產(chǎn)生將涂上一層DNA的高密度顆粒(如金或者鎢)加速到很高速度的動(dòng)力，這種速度使之穿透靶器官、組織或者細(xì)胞。粒子轟擊可以用于體外系統(tǒng)或者與來自體內(nèi)或者體內(nèi)技術(shù)一起使用以將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞、組織或者器官中。
基因轉(zhuǎn)移的電穿孔方法使用電流以便使細(xì)胞或組織對電穿孔介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移敏感。使用帶有給定場強(qiáng)的短時(shí)電脈沖增加膜的滲透性，這樣DNA分子可以滲透到所說的細(xì)胞。這一技術(shù)可以用于體外系統(tǒng)或者與來自體內(nèi)或者體內(nèi)技術(shù)一起使用以將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞、組織或者器官中。
可以使用體內(nèi)載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將外源DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。通常將載體-DNA復(fù)合物導(dǎo)入到體液或血液，然后特異性地定點(diǎn)導(dǎo)入到體內(nèi)的靶器官或者組織中?？梢允褂弥|(zhì)體和聚陽離子(如多聚賴氨酸、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑和細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)?？梢援a(chǎn)生細(xì)胞特異性或者器官特異性的脂質(zhì)體，這樣脂質(zhì)體攜帶的外源DNA將由靶細(xì)胞攝取。針對某些細(xì)胞的特異性受體的免疫脂質(zhì)體的注射可以用作將所說的DNA插入到含有所說的受體的細(xì)胞中的常規(guī)方法。另一種使用的載體系統(tǒng)是用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的將DNA攜帶到肝細(xì)胞中的脫唾液酸糖蛋白/多聚賴氨酸綴合物系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)染的DNA也可以與其它各種載體復(fù)合，這樣將所說的DNA運(yùn)送到受體細(xì)胞中，然后定居在細(xì)胞質(zhì)或者核質(zhì)中。DNA可以在特異的工程泡復(fù)合物中與載體細(xì)胞核蛋白結(jié)合，并直接運(yùn)送到細(xì)胞核中。
通過施用與抑制素基因、或者與抑制素基因相關(guān)的控制區(qū)、或者它的相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄區(qū)相結(jié)合的化合物以改變轉(zhuǎn)錄或翻譯的速率可以實(shí)現(xiàn)抑制素的基因調(diào)節(jié)。另外，可以向動(dòng)物施用由編碼抑制素或其片段和載體蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以便體內(nèi)提供本發(fā)明的異源蛋白的來源。例如，可以用包含編碼抑制素或其片段和載體蛋白的本發(fā)明融合基因產(chǎn)物的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語＂載體＂是包含或與特異性核酸序列相關(guān)的載體，其功能是將特異性的核酸序列轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。載體的例子包括質(zhì)粒和感染性的微生物，如病毒或非病毒載體(如配體-DNA綴合物、脂質(zhì)體、類脂-DNA復(fù)合物)。將包含本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物的重組DNA分子可操作性地連接到表達(dá)控制序列上以形成能夠表達(dá)本發(fā)明的異源蛋白的表達(dá)載體。所說的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以是來自于動(dòng)物正常組織的細(xì)胞和動(dòng)物患病組織的細(xì)胞，或者可以是非動(dòng)物細(xì)胞。
例如，用能夠表達(dá)本發(fā)明異源蛋白的載體轉(zhuǎn)染從動(dòng)物獲得的細(xì)胞，并將其重新導(dǎo)入到所說的動(dòng)物中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞然后產(chǎn)生本發(fā)明的異源蛋白，這樣就誘導(dǎo)了抗所說的抑制素的免疫反應(yīng)。也可以通過非載體或者本領(lǐng)域已知的物理或者化學(xué)方法(如電穿孔、離子穿孔(ionoporation))或者通過＂基因槍＂轉(zhuǎn)染細(xì)胞。另外，可以在沒有載體輔助的情況下，直接將本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物注射到動(dòng)物中。尤其是，本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物可以注射到皮膚、肌肉或者血液中。
將抑制素或其片段轉(zhuǎn)染到動(dòng)物中的基因治療方案可以是經(jīng)融合的基因產(chǎn)物整合到所說的細(xì)胞的基因組(即小染色體)中，或者在這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或核質(zhì)中作為獨(dú)立復(fù)制或非復(fù)制的DNA構(gòu)建體。異源蛋白的表達(dá)能持續(xù)較長一段時(shí)間，或者可以定期重新注射本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物以便在這些細(xì)胞、組織或器官、或確定的血液中保持需要水平的異源蛋白。
可以經(jīng)本領(lǐng)域任何已知的方法向鳥類施用本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物。例如，可以經(jīng)皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、血管內(nèi)或肌肉內(nèi)施用所說的組合物。優(yōu)選地，經(jīng)皮下注射所說的組合物。另一種理想的施用方法是在理想的治療位點(diǎn)附近進(jìn)行血管內(nèi)輸注?？梢砸砸环N或幾種劑量向鳥類施用此組合物。優(yōu)選地，以幾種劑量向鳥類施用此組合物，這樣在首次免疫后可進(jìn)行加強(qiáng)免疫。施用融合基因產(chǎn)物的優(yōu)選量為每千克體重50-300微克。優(yōu)選地，以載體的方式(如緩沖液或者弗氏佐劑)施用所說的融合基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的提高鳥類生產(chǎn)能力的方法將大大促進(jìn)平胸類(如駝鳥和食火鳥)的群體生長，因此滿足了市場需要，這是因?yàn)楸景l(fā)明的方法將提高這些鳥的不理想的產(chǎn)蛋率。本發(fā)明的方法也將滿足不斷增長的對家禽(如家養(yǎng)雞)和它們的蛋的需要。
使用本發(fā)明的方法提高生產(chǎn)能力不只限于提高鳥類的生產(chǎn)能力。可以在許多動(dòng)物中使用本發(fā)明的提高生產(chǎn)能力的方法。如上所述，本發(fā)明的方法可以用于提高任何產(chǎn)生抑制素的動(dòng)物的生產(chǎn)能力，這些動(dòng)物包括但不限于農(nóng)業(yè)上飼養(yǎng)的大多數(shù)動(dòng)物(如豬、母牛、綿羊、火雞、鵪鶉、鴨、鵝、海龜、魚和雞)；被毛動(dòng)物(如貂、狐貍、水獺、雪貂、兔和浣熊)；實(shí)驗(yàn)用的嚙齒動(dòng)物(如小鼠、大鼠、倉鼠，豚鼠和沙土鼠)；皮用于裝飾目的的動(dòng)物(如產(chǎn)于美洲的鱷魚和蛇)；外來的或者瀕危物種；用于競賽、娛樂和表演(競賽)的動(dòng)物(如馬、狗、貓和動(dòng)物園動(dòng)物)；馬戲團(tuán)動(dòng)物和人類。本發(fā)明的方法能提高其生產(chǎn)能力的其它鳥類包括平胸類、鸚鵡目、獵鷹目、piciformes、strigiformes、passeriformes、coraciformes、ralliformes、cuculiformes、columbiformes、galliformes、anseriformes和herodiones。更具體地說，本發(fā)明的方法可以用于提高下列動(dòng)物的生產(chǎn)能力駝鳥、食火鳥、rhea、無翼鳥、食火雞、鸚鵡(parrot)、鸚鵡(parakeet)、makaw、獵鷹、鷹(eagle)、鷹(hawk)、鴿子、美冠鸚鵡、鳴禽、
鳥、山鳥類、雀類、囀鳥、金絲雀、巨嘴鳥、八哥或者麻雀。本發(fā)明的定性或定量方法本發(fā)明的另一個(gè)方面是產(chǎn)生抗本發(fā)明的異源蛋白的抗體。一般來說，產(chǎn)生抗本發(fā)明的異源蛋白的抗體的方法包括下列步驟向動(dòng)物施用有效量的包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的本發(fā)明的異源蛋白，這樣在此動(dòng)物中可以發(fā)生抗這種異源蛋白的免疫反應(yīng)；從此動(dòng)物中獲得血液樣品；然后從血液樣品的血清中分離抗抑制素的任何抗體。優(yōu)選的是，通過使血清經(jīng)過含有有效量的所說的載體蛋白的柱以便從血清中分離抗體來從所說的血液樣品的血清中分離所說的抗體。另外，此柱包含本發(fā)明的異源蛋白。在另一種技術(shù)中，首先使所說的血清通過含有所說的載體蛋白的柱，然后再通過含有本發(fā)明的異源蛋白的柱來分離所說的抗體。用于產(chǎn)生和純化抗本發(fā)明的異源蛋白的抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。
應(yīng)該理解根據(jù)所需要的抗體類型，可以向任何動(dòng)物施用本發(fā)明的異源蛋白。并且，也應(yīng)該理解所說的抑制素可以是外源或內(nèi)源的。因此，本發(fā)明的異源蛋白中的抑制素類型和施用此組合物的動(dòng)物物種由所需要的抗體類型確定。例如，包含雞抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白的異源蛋白可以施用給鴕鳥，以便產(chǎn)生駝鳥抗雞抑制素抗體。另外，包含駝鳥抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白的異源蛋白可以施用給鴕鳥以便產(chǎn)生駝鳥抗駝鳥抑制素抗體。
本發(fā)明也直接針對于快速，簡單，可靠，廉價(jià)地確定動(dòng)物是否是激素預(yù)處理的高水平或低水平的產(chǎn)蛋者的方法。更具體地說，本發(fā)明也涉及確定動(dòng)物產(chǎn)生的抑制素的量的方法，因此能夠確定動(dòng)物的產(chǎn)蛋能力。簡言之，確定動(dòng)物血液中抑制素量的方法包括下列步驟抽取動(dòng)物的血液樣品；在允許抗體選擇性地與存在于所說的樣品中的任何抑制素相互作用的條件下，使血液樣品與特異性地抗動(dòng)物內(nèi)源抑制素的抗抑制素抗體相接觸；從相互作用的抗體中除去任何沒有發(fā)生相互作用的抗體；確定發(fā)生相互作用的抗體的量。
本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將理解可以用于上述方法的免疫測定技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。因此，本領(lǐng)域已知的任何免疫測定技術(shù)、標(biāo)記和可視化方法都可以用于上述的方法中，這些方法包括ELISA和放射免疫測定(RIA)。優(yōu)選的免疫測定是ELISA(＂酶聯(lián)免疫吸附測定＂)。優(yōu)選的標(biāo)記是辣根過氧化物酶。另一個(gè)優(yōu)選的標(biāo)記是彩色膠乳小珠。彩色膠乳小珠可以是可視化所需要的任何顏色。優(yōu)選地，膠乳小珠是黃、紅、藍(lán)或者綠色。彩色膠乳小珠可以是空的或?qū)嵭牡?，但?yōu)選的是空的以使其重量最小。膠乳小珠的大小根據(jù)其將用于的免疫測定而變化。本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定可見的但不在空間上干擾免疫測定反應(yīng)的最大珠的大小。優(yōu)選地，膠乳小珠的直徑小于0.5μ，最優(yōu)選的是其直徑小于0.2μ。
例如，可以使用夾層ELISA技術(shù)確定鳥血液中的循環(huán)抑制素濃度。首先，將直接針對部分抑制素或其片段的抗抑制素抗體與微量滴定板的孔結(jié)合。洗滌和封阻平板后，然后加入一定量的從待測的鳥獲得的血漿。使樣品中的任何抑制素(如果存在)選擇性地與固定化的抗抑制素抗體相互作用后，將所說的樣品從平板孔中洗出。接下來，向孔中加入標(biāo)記的抗抑制素抗體，這些抗體直接抗不同部分的抑制素或其片段，而不是孔中固定的抗體?？梢杂帽绢I(lǐng)域任何已知的標(biāo)記標(biāo)記抗體，如辣根過氧化物酶。在使標(biāo)記的抗抑制素抗體選擇性地與任何固定的抑制素相互作用后，通過洗滌除去任何沒有相互作用的標(biāo)記的抗抑制素抗體。通過使用在ELISA的標(biāo)記中所用的合適的可視化方法以定量在孔中固定的標(biāo)記的抗抑制素抗體，來確定存在于血漿樣品中的抑制素的量。在相鄰的平板孔中，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的陽性和陰性對照。
應(yīng)該理解任何產(chǎn)生抑制素的動(dòng)物的繁殖潛力都可以通過上述的方法確定。本發(fā)明的方法可以用于確定任何產(chǎn)生抑制素的物種的雌性動(dòng)物產(chǎn)生的抑制素的量。其中所說的動(dòng)物可以是鳥、哺乳動(dòng)物、魚或者爬蟲。更具體地，哺乳動(dòng)物包括但不限于牛、人類、馬、貓、狗、綿羊、貂、狐貍、水獺、雪貂、浣熊和豬。鳥包括但不限于駝鳥、食火鳥和雞。優(yōu)選的動(dòng)物是鳥。更優(yōu)選的動(dòng)物是平胸類。尤其優(yōu)選的動(dòng)物是駝鳥。另一種優(yōu)選的動(dòng)物是食火鳥。還有另一種優(yōu)選的動(dòng)物是雞。
抑制素水平高的動(dòng)物具有較低的繁殖潛力，并依據(jù)相關(guān)的物種和它們是否為農(nóng)業(yè)目的飼養(yǎng)，可以將這種產(chǎn)蛋較低的動(dòng)物屠宰，而不用于繁殖目的。相反，那些抑制素量較低的農(nóng)用飼養(yǎng)動(dòng)物則是較高水平的蛋生產(chǎn)者，一般用于繁殖目的而不將其屠宰。
動(dòng)物的抑制素水平隨其年齡、物種和與繁殖期(如果有)有關(guān)的一年中的某個(gè)時(shí)間而變化。因此，動(dòng)物的產(chǎn)蛋潛力的確定與這些因素有關(guān)，并且比較同一物種動(dòng)物、大約相同年齡、在一年的同一時(shí)間(如果該動(dòng)物有繁殖期)的平均抑制素水平，動(dòng)物抑制素水平的測量是最有價(jià)值的。
由于鳥產(chǎn)生的抑制素的量隨上述因素變化，下表中列出了不同年齡鳥的抑制素的相對量。表1是依據(jù)平胸類(如食火鳥和鴕鳥)是差或良好的蛋生產(chǎn)者及平胸類的年齡，平胸類抑制素生產(chǎn)的變異。
表1年齡(月) 抑制素水平繁殖潛力6-12 ＞5 差6-12 2-5 中等6-120-1.5 好24+ ＞7 差24+ 3-7中等24+0-2.5好在上表中，抑制素水平與雌性平胸類的標(biāo)準(zhǔn)庫值1相關(guān)，每個(gè)繁殖期產(chǎn)蛋為平均50-60個(gè)，其繁殖潛力好；沒有產(chǎn)蛋功能的雌性平胸類的庫值為7，每個(gè)繁殖期產(chǎn)蛋不到5個(gè)，其繁殖潛力差。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是產(chǎn)生抗另一種動(dòng)物的一類抗體(如IgG)的動(dòng)物抗體的方法。簡言之，在動(dòng)物中產(chǎn)生抗另一種動(dòng)物的IgG的抗體的方法包括下列步驟向第二種動(dòng)物施用有效量的第一種動(dòng)物的抗體(如通過上述的方法產(chǎn)生的抗體)，這樣在第二種動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生抗第一種動(dòng)物抗體的免疫反應(yīng)；從第二種動(dòng)物體內(nèi)抽取血液樣品；如上所述從血液樣品的血清中分離第二種動(dòng)物的抗體。優(yōu)選的是，第二種動(dòng)物不同于第一種動(dòng)物。
本發(fā)明也直接針對快速、簡單、可靠和廉價(jià)地確定動(dòng)物是否對抑制素組合物的攻擊發(fā)生免疫反應(yīng)的方法。如上所述此方法使用了第二種動(dòng)物的抗第一種動(dòng)物的一類抗體的抗體。簡言之，此方法包括使本發(fā)明的抑制素或者異源蛋白與固相結(jié)合；使固定的抑制素與待測的動(dòng)物的血液樣品接觸。在使所說的抑制素選擇性地與樣品中的任何抗抑制素抗體相互作用的條件下，使此樣品與固定的抑制素接觸。從樣品中除去沒有相互作用的抗體并洗滌后，加入一定量的第二種動(dòng)物的標(biāo)記的抗體(其抗第一種動(dòng)物的一類抗體)?？勾藙?dòng)物抗體的標(biāo)記的抗體將選擇性地與結(jié)合到固定的抑制素上的抗體相互作用。除去沒有發(fā)生相互作用的標(biāo)記抗體后，通過使這些標(biāo)記物可視化來確定相互作用的標(biāo)記抗體的存在或量。這樣，此方法檢測了抗此動(dòng)物抑制素的抗體的存在，因此確定了此動(dòng)物對施用包含抑制素的組合物是否發(fā)生免疫反應(yīng)。
應(yīng)該理解確定動(dòng)物對施用包含抑制素的組合物是否發(fā)生免疫反應(yīng)的方法可以在任何物種的雌性動(dòng)物身上進(jìn)行。其中所說的動(dòng)物可以是鳥、哺乳動(dòng)物、魚或者爬蟲。更具體地，哺乳動(dòng)物包括但不限于牛、人類、馬、貓、狗、綿羊、貂、狐貍、水獺、雪貂、浣熊和豬。鳥包括但不限于駝鳥、食火鳥、rhea和雞。優(yōu)選的動(dòng)物是鳥。更優(yōu)選的動(dòng)物是平胸類。尤其優(yōu)選的動(dòng)物是駝鳥。另一種優(yōu)選的動(dòng)物食火鳥。還有另一種優(yōu)選的動(dòng)物是rhea。
本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員應(yīng)該理解用于上述方法的免疫測定技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。因此，本領(lǐng)域已知的任何免疫測定技術(shù)、標(biāo)記和可視化方法都可以用于上述的方法中。優(yōu)選的免疫測定是ELISA。優(yōu)選的標(biāo)記是辣根過氧化物酶。另一個(gè)優(yōu)選的標(biāo)記是彩色膠乳小珠。彩色膠乳小珠可以是可視化所需要的任何顏色。優(yōu)選地，膠乳小珠是黃、紅、藍(lán)或者綠色。彩色膠乳小珠可以是空的或?qū)嵭牡模珒?yōu)選的是空的以使其重量最小。膠乳小珠的大小根據(jù)其將用于的免疫測定而變化。本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定可見的但不在空間上干擾免疫測定反應(yīng)的最大珠的大小。優(yōu)選地，膠乳小珠的直徑小于0.5μ，最優(yōu)選的是其直徑小于0.2μ。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是直接針對于上述測定動(dòng)物是否對施用包含抑制素的組合物發(fā)生免疫反應(yīng)的方法，其中所說的方法做了如下修改。簡言之，此方法包括從動(dòng)物中獲得血液樣品；使其與標(biāo)記的動(dòng)物抑制素或其片段接觸。在標(biāo)記的動(dòng)物抑制素選擇性地與所說的樣品中的任何抗抑制素抗體相互作用的條件下，將樣品與所說的動(dòng)物抑制素接觸。在從樣品中除去沒有發(fā)生相互作用的標(biāo)記抑制素后，通過可視化標(biāo)記物來確定相互作用的標(biāo)記抑制素的存在或量。用于此方法的抑制素選自但不限于下列物質(zhì)本發(fā)明的融合異源抑制素蛋白；內(nèi)源抑制素或其片段；和外源抑制素或其片段。優(yōu)選地，標(biāo)記的抑制素是內(nèi)源抑制素。
通過下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)施例不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。相反，應(yīng)該十分清楚可以采取各種其它的實(shí)施方案、改良方案和等同方案，在閱讀完本說明書后本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚這些方案沒有背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和/或附屬的權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例1產(chǎn)生包含編碼表達(dá)雞抑制素基因和編碼表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白基因的融合基因產(chǎn)物下面是用于產(chǎn)生融合基因產(chǎn)物(該融合基因產(chǎn)物包含編碼表達(dá)α-亞基雞抑制素片段(SEQ ID NO2)的基因(cINA521)和編碼表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白的基因)的方法。本發(fā)明的融合基因產(chǎn)物制自pMALTM-C載體試劑盒(得自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，馬薩諸塞)。
pMALTM載體提供用于產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)由在讀框中克隆的基因表達(dá)。把克隆的基因插入雄性基因的下游，所述雄性基因編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(“MBP”)并導(dǎo)致MBP融合蛋白(“MBP-cINA521”)的表達(dá)。該方法利用MBP對麥芽糖的親和性產(chǎn)生了克隆序列高水平的表達(dá)以及用于融合蛋白MBP-cINA521的一步純化。
下面是把抑制素基因cINA521連接進(jìn)pMALTM-C載體的方法1.用限制性核酸內(nèi)切酶Pstl消化在20μl中的0.5μg pMALTM-c質(zhì)粒DNA。
2.用相同的酶Pstl消化5μg包含雞抑制素基因的cINA6質(zhì)粒DNA。
3.通過在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行4μl的pMALTM反應(yīng)和4μl的cINA6反應(yīng)檢查完全消化。然后運(yùn)行制備型瓊脂糖凝膠并通過prep-A-基因純化試劑盒純化Pstl cINA521片段。
4.把0.05單位的小牛腸堿性磷酸酶(NEB#290)添加至載體DNA消化。在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。
5.把相等體積的1∶1酚/三氯甲烷混合物添加至載體限制性消化物并混合，在離心后，除去含水(頂端)相并放置在新鮮的試管中。僅以三氯甲烷重復(fù)。
6.把10μg糖原或tRNA作為載體添加至載體消化物中，添加1/10體積的3M醋酸鈉并混合，然后添加兩體積的乙醇。在-20℃下培養(yǎng)30分鐘。
7.微離心15分鐘。倒出上清液，用70％乙醇沖洗沉淀，然后進(jìn)行干燥。
8.把每種樣品重新懸浮在20μl水中。
9.混合0.2μg載體消化物與0.5μg插入消化物；添加水至18μl，然后添加2μl10×連接酶緩沖液；0.5μl NEB T4連接酶(#202；～200單位)；在16℃下培養(yǎng)2小時(shí)至過夜。
10.在65℃下加熱5分鐘；在冰上冷卻。
11.把5μl的連接混合物與100μl感受態(tài)DH5α(或任何lacZα-補(bǔ)體菌株)混合并在冰上培養(yǎng)15-30分鐘。加熱至42℃并保持2分鐘。
12.添加1ml LB并在37℃下培養(yǎng)60分鐘。涂布在包含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。在37℃下培養(yǎng)過夜。以無菌牙簽在LB amp主平板上和包含80μg/ml Xgal和0.1mM IPTG的LB amp平板上挑選菌落。在37℃下培養(yǎng)8至16小時(shí)。在Xgal平板上給Lac表型評分，并從主平板回收“白”克隆。
13.以下列方法的一種或兩種篩選插入物的存在A.制備微制劑DNA。用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化以確定插入物的存在和方向。
B.i)在LB amp肉湯中培養(yǎng)5ml培養(yǎng)物至大約2×108/ml。
ii)取1ml樣品。微離心2分鐘，棄去上清液并把細(xì)胞重新懸浮在50μl蛋白質(zhì)凝膠SDS-PAGE樣品緩沖液中。
iii)把IPTG添加至余下的培養(yǎng)物中至0.3mM，例如15μl 0.1M的母液。在良好的通氣下于37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。
iv)取0.5ml樣品。微離心2分鐘，棄去上清液并把細(xì)胞重新懸浮在100μl SDS-PAGE樣品緩沖液中。
v)煮沸樣品5分鐘。在10％SDS-PAGE凝膠上與一組蛋白質(zhì)MW標(biāo)準(zhǔn)品和提供的在SDS-PAGE樣品緩沖液中的MBP一起電泳15μl的每種樣品。以考馬斯亮藍(lán)染色凝膠。在對應(yīng)于融合蛋白分子量的位置容易見到誘導(dǎo)帶。僅MBP的分子量是42,000道爾頓。
實(shí)施例2產(chǎn)生包含雞抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合異源蛋白“MBP-cINA521”下面是產(chǎn)生包含雞抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合異源蛋白“MBP-cINA521”的方法。實(shí)施例1的融合基因產(chǎn)物表達(dá)融合的異源麥芽糖結(jié)合蛋白-抑制素蛋白“MBP-cINA521”，如下1.向80ml濃肉湯+葡萄糖和氨芐青霉素(見下面的培養(yǎng)基和溶液)接種0.8ml包含實(shí)施例1的融合質(zhì)粒的過夜培養(yǎng)的細(xì)胞。
2.在37℃及良好的通氣下培養(yǎng)至2×108個(gè)細(xì)胞/ml(A600～0.5)。取1ml樣品并微離心2分鐘(非誘導(dǎo)細(xì)胞)，棄去上清液并把細(xì)胞重新懸浮在50μlSDS-PAGE樣品緩沖液中。渦流并置于冰上。
3.向余下的培養(yǎng)物添加IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至0.3mM的最終濃度，例如在H2O中的0.24ml 0.1M母液(參見培養(yǎng)基和溶液)。在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。取0.5ml樣品并微離心2分鐘(誘導(dǎo)細(xì)胞)，棄去上清液并把細(xì)胞重新懸浮在100μl SDS-PAGE樣品緩沖液中。渦流至重新懸浮細(xì)胞并置于冰上。
4.把培養(yǎng)物分成兩個(gè)等分試樣。通過在4000×g下離心10分鐘收獲細(xì)胞。棄去上清液并把1份沉淀(樣品A)重新懸浮在5ml裂解緩沖液中(參見培養(yǎng)基和溶液)。再把另1份沉淀(樣品B)重新懸浮在10ml 30mM Tris-Cl、20％蔗糖、pH8.0(每0.1g細(xì)胞濕重8ml)中。
5.在干冰-乙醇浴中凍結(jié)樣品(或在-28℃下過夜)。在冷水中解凍(20℃比70℃更有效，但是花費(fèi)的時(shí)間較長)。
6.聲處理并通過使用Bradford測定或在A260下核酸的釋放測定蛋白質(zhì)的釋放監(jiān)測細(xì)胞破裂，直到其達(dá)到最大值。添加0.6ml 5M NaCl。
7.在9,000×g下離心20分鐘。倒出上清液(粗提取物1)并在冰上保存。在5ml裂解緩沖液中重新懸浮沉淀。這是不溶性物質(zhì)的懸浮液(粗提取物2)。
如上產(chǎn)生的異源融合麥芽糖結(jié)合蛋白-抑制素蛋白質(zhì)“MBP-cINA521”的柱純化如下1.在250ml的過濾培養(yǎng)瓶中于50ml柱緩沖液中(參見培養(yǎng)基和溶液)膨脹直鏈淀粉樹脂(1.5g)30分鐘。用吸氣器除去氣體。倒入2.5×10cm柱中。以3柱體積的相同緩沖液+0.25％Tween20洗滌柱。
所需的樹脂的量取決于所產(chǎn)生的融合蛋白的量。樹脂結(jié)合大約3mg/ml的床體積，因此大約15ml的柱體積對于多達(dá)45mg融合蛋白/升培養(yǎng)物的產(chǎn)量是足夠的。以硅烷化的玻璃絨塞住的50ml注射器可用于替代2.5cm柱。柱高度與直徑的比應(yīng)小于或等于4。
2.用柱緩沖液+0.25％Tween20稀釋粗提取物1∶5。以[10×(柱直徑cm)2]ml/小時(shí)裝載稀釋的粗提取物。對于2.5cm柱這是大約1ml/分鐘。
粗提取物的稀釋的目標(biāo)是將蛋白質(zhì)濃度降低至大約2.5mg/ml。如果粗提取物的濃度較低，不要過度稀釋。一項(xiàng)單憑經(jīng)驗(yàn)的好方法是1g濕重細(xì)胞產(chǎn)生大約120mg蛋白質(zhì)。
3.用2柱體積柱緩沖液+0.25％Tween20洗滌。
4.用無Tween20的3柱體積柱緩沖液洗滌。
5.用柱緩沖液+10mM麥芽糖+0.1％SDS(可有可無的10mMβ-巰基乙醇、1mM EGTA)洗脫融合蛋白“MBP-cINA521”。收集10-20份3ml的級分。通過例如，Bradford測定或A260°測定級分中的蛋白質(zhì)；包含融合蛋白的級分具有容易檢測的蛋白質(zhì)。在柱的空體積后很快洗脫出融合蛋白。培養(yǎng)基和溶液*濃培養(yǎng)基+葡萄糖和氨芐青霉素＝每升10g胰蛋白胨、5g酵母膏、5g NaCl、2g葡萄糖。高壓滅菌添加無菌氨芐青霉素至100μg/ml。
*0.1M IPTG母液＝1.41g IPTG(異丙基-β-o-硫代半乳糖苷)；加H2O至50ml。過濾并滅菌。
*0.5M磷酸鈉緩沖液，pH7.2(母液)＝(A)69.0g NaH2PO4H2O添加至1升H2O中。
(B)70.9g Na2HPO4添加至1升H2O中。
把117ml(A)與383ml(B)混合。這種母液的pH應(yīng)該為～7.2。以柱緩沖液稀釋至10mM，pH應(yīng)是7.0。裂解緩沖液每升 最終濃度20ml 0.5M Na2HPO410mM磷酸鹽1.75g NaCl30mM NaCl10ml 25％Tween 20 0.25％Tween j200.7mlβ-巰基乙醇 10mM β-ME(“β-ME”)(可有可無)20ml 0.5M EDTA(pH 8) 10mM EDTA10ml 1M EGTA(pH 7)10mM EGTA以HCl或NaOH將pH調(diào)整至7.0柱緩沖液每升 最終濃度20ml 0.5M磷酸鈉pH 7.2 10mM磷酸鹽29.2g NaCl0.5M NaCl1ml1M疊氮化鈉 1mM疊氮化物0.7mM β-ME(可有可無) 10mMβ-ME1ml 1M EGTA(pH 7.0) 1mM EGTA(可有可無)如果必要，調(diào)整至pH7.0低鹽柱緩沖液每升最終濃度20ml 0.5M磷酸鈉pH 7.2 10mM磷酸鹽1.75g NaCl 30mM NaCl1ml1M疊氮化鈉 1mM疊氮化物0.7mMβ-巰基乙醇(可有可無) 10mMβ-ME1ml 1M EGTA(pH 7) 1mM EGTA(可有可無)如果必要，調(diào)整至pH 7.0融合的雞抑制素-MBP異源蛋白“MBP-cINA521”通過柱之后的純度在圖1柱“E”中說明。標(biāo)號為“F”的柱是當(dāng)沒有異源蛋白裝載在柱上時(shí)從柱中的洗脫液(陰性對照)。標(biāo)號為“B”的柱代表質(zhì)粒pMALTM-C載體標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)號為“C”的柱是分子量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)號為“D”的柱是實(shí)際的pMALTM-C載體(該載體在插入如實(shí)施例2所述的抑制素基因前用于制備融合的雞-抑制素-MBP異源蛋白“MBP-cINA521”。上述蛋白質(zhì)在SDS-PAGE樣品緩沖液中于SDS-PAGE凝膠上電泳，以考馬斯亮藍(lán)染色。
實(shí)施例3免疫抗抑制素的駝鳥下面是用于免疫抗抑制素的駝鳥的方法。在鴕鳥第一個(gè)繁殖季節(jié)之前大約六個(gè)月對駝鳥進(jìn)行初次免疫，然后以一個(gè)月的間隔對鴕鳥加強(qiáng)免疫六個(gè)月。因此，優(yōu)選的是當(dāng)鴕鳥在大約18至24月齡之間時(shí)對其施用初次免疫。初次免疫包含大約1.5至3.0mg之間的融合異源蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含通過實(shí)施例1和2的方法產(chǎn)生的雞抑制素(α亞基片段)和麥芽糖結(jié)合蛋白。加強(qiáng)免疫包含大約0.75至1.5mg之間的融合異源蛋白。在初次免疫中，融合異源蛋白在弗氏完全佐劑(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)中乳化，在加強(qiáng)免疫中，融合異源蛋白在弗氏不完全佐劑(Sigma)中乳化。在三個(gè)位點(diǎn)沿駝鳥的上腿區(qū)皮下注射融合異源蛋白組合物。
實(shí)施例4產(chǎn)生選擇性地抗抑制素的駝鳥抗體下列是產(chǎn)生駝鳥抗體(“駝鳥抗雞抑制素抗體”)的方法，該抗體選擇性地抗包含雞抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白的本發(fā)明的異源蛋白。更具體地說，駝鳥抗體是IgG抗體。所利用的異源蛋白是通過實(shí)施例1和實(shí)施例2中所述的方法產(chǎn)生的包含雞抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白。為了產(chǎn)生該抗體，按照實(shí)施例3描述的方法以雞抑制素-MBP異源蛋白免疫駝鳥。施用給駝鳥的量必須足以引發(fā)駝鳥抗異源蛋白的免疫反應(yīng)。從駝鳥中抽取大約5ml血液，然后從其余部分的血液樣品中分離抗抑制素的抗體。在本領(lǐng)域中已知的任何分離方法都可用于分離抗體。優(yōu)選地，使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA技術(shù)結(jié)合親和與HPLC柱。
實(shí)施例5產(chǎn)生選擇性地抗鴕鳥抗體的山羊抗體下列是產(chǎn)生選擇性地抗一組駝鳥抗體(包括在實(shí)施例4中產(chǎn)生的抗體，更具體地說是IgG駝鳥抗體)的山羊抗體的方法。按這種方法，山羊以0.5至3.0mg的駝鳥IgG免疫，這樣，免疫反應(yīng)發(fā)生于抗駝鳥IgG的山羊之中。駝鳥IgG從得自不同駝鳥的血清庫獲得。血液從山羊獲得。然后，利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從樣品中分離山羊抗駝鳥IgG。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法純化血清庫，該方法包括利用50％硫酸銨沉淀，隨后使用蛋白質(zhì)瓊脂糖凝膠柱分級分離。優(yōu)選地，IgG沉淀如下進(jìn)行。將包含IgG的12ml血清用50mM-Tris(pH8.0)以1∶1稀釋。其次，隨攪拌緩慢添加24ml的飽和硫酸銨(均在4℃下)，攪拌混合物大約2小時(shí)。在10,000rpm下離心混合物10分鐘以收集沉淀。把沉淀重新懸浮在50mM-Tris鹽水中(至12ml)，于4℃下相對于2L 50mM-Tris透析過夜，最終體積是20ml。
優(yōu)選地，隨后利用蛋白質(zhì)-A瓊脂糖凝膠柱的分級分離如下。柱包含蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠CL-4B(Pharmacia生物技術(shù)公司，Piscataway，NJ)。柱裝載大約5ml的硫酸銨/血清沉淀。使樣品結(jié)合蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠大約30分鐘。其次，柱用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)洗滌，吸收的IgG以0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脫。最后，通過添加幾滴1M Tris-HCl(pH9)中和洗脫的級分。在施用于山羊之前，純化的駝鳥IgG的質(zhì)量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后通過視覺測試。
利用的免疫方法和佐劑對本發(fā)明不是關(guān)鍵性的，這樣，可以利用本領(lǐng)域已知的任何方法，可以使用本領(lǐng)域已知的任何佐劑系統(tǒng)。優(yōu)選地，把純化的駝鳥IgG皮下注射進(jìn)山羊。以四周的間隔利用弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)注射也是優(yōu)選的。優(yōu)選地，純化的IgG與弗氏完全佐劑或Hunter′sTitermax(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，密蘇里)施用。在三至四次注射后，山羊產(chǎn)生了令人滿意的免疫反應(yīng)。
其次，從山羊中抽取5-10ml的血液，從血液樣品分離抗駝鳥IgG的山羊抗體。任何本領(lǐng)域已知的方法都可用于從血液樣品分離山羊抗體。從樣品分離山羊抗體優(yōu)選的方法是使血液樣品通過駝鳥IgG柱。然后通過用甘氨酸緩沖液-pH 8.0洗滌柱從柱收集山羊抗體。
實(shí)施例6在用融合異源蛋白接種鴕鳥后監(jiān)控其免疫反應(yīng)下面是用融合異源蛋白(由通過實(shí)施例1和2的方法產(chǎn)生的雞抑制素和麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)組成)接種鴕鳥后監(jiān)控其免疫反應(yīng)的方法，其中所說的免疫反應(yīng)通過利用在實(shí)施例5中產(chǎn)生的山羊抗體監(jiān)測。為了確定駝鳥是否與融合的抑制素-MBP異源蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，首先把異源蛋白結(jié)合到固相上。其次，從用異源蛋白免疫的鴕鳥中抽取5-10ml血液并從血液中分離血清。在下述條件下使固化的異源蛋白與血清接觸，在所說的條件下異源蛋白選擇性地與在血清中的任何抗抑制素抗體相互作用。在洗滌后，添加在實(shí)施例5中產(chǎn)生的、以HRP標(biāo)記的山羊抗體。然后標(biāo)記的山羊抗體與結(jié)合到固定化的異源蛋白上的駝鳥抗體選擇性地相互作用。在除去未發(fā)生相互作用的標(biāo)記的抗體后，通過標(biāo)記的可視化確定相互作用的HRP標(biāo)記的山羊抗體的存在或數(shù)量。優(yōu)選地，標(biāo)記通過添加硝基藍(lán)四唑鎓(“NBT”)(HRP的底物)來可視化。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解用于上述方法的免疫測定技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。因此，任何免疫測定技術(shù)、標(biāo)記和可視化方法都可以用于上述方法。優(yōu)選的免疫測定是ELISA，優(yōu)選的標(biāo)記是辣根過氧化物酶。另一個(gè)優(yōu)選的標(biāo)記是彩色的膠乳小珠。
實(shí)施例7測定駝鳥的生殖潛力下面是通過定量測定駝鳥血液中抑制素的量測定駝鳥生殖潛力的方法。在駝鳥血液中循環(huán)的抑制素濃度可以利用放射免疫測定(RIA)或標(biāo)準(zhǔn)的夾層ELISA技術(shù)測定。首先，把在實(shí)施例4中產(chǎn)生的抗抑制素抗體結(jié)合到微滴定板的孔上。在洗滌并封閉平板后，然后把從鴕鳥獲得的一定量的血漿或血清添加到微滴定板的孔中。在使樣品中的任何抑制素(如果存在)與固定化的抗抑制素抗體選擇性地相互作用后，從平板的孔中洗去樣品。其次，把不同的抗抑制素抗體(而非在實(shí)施例4中產(chǎn)生的抗體，其與辣根過氧化物酶綴合)添加至孔中。HRP綴合的抗抑制素抗體不同于固定化的抗抑制素抗體，其中它們選擇性地抗抑制素的不同部分。在使標(biāo)記的抗抑制素抗體與任何固定化的抑制素選擇性地相互作用之后，通過洗滌除去任何未相互作用的標(biāo)記的抗抑制素抗體。存在于血漿樣品中的抑制素的量通過把NBT添加至孔中并在孔中可視化固定化的標(biāo)記的抗抑制素抗體量測定。標(biāo)準(zhǔn)的陽性和陰性對照在相鄰的平板孔中同時(shí)進(jìn)行。許多免疫測定技術(shù)、標(biāo)記和可視化方法在本領(lǐng)域是已知的。因此，任何免疫測定方法、標(biāo)記和可視化技術(shù)都可以用于本發(fā)明。
實(shí)施例8在鵪鶉中提高蛋產(chǎn)量如上所述，插入到Bluescript的EcoR 1位點(diǎn)中的雞抑制素α-亞基cDNA克隆(cINA6)為P.A.Johnson(Cornell大學(xué))所贈(zèng)。利用PstI消化從cINA6克隆切除DNA片段(“cINA521”)。cINA521DNA片段包括大多數(shù)成熟雞抑制素α-亞基。把該片段(cINA521)符合讀框地克隆進(jìn)具有麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(“MBP”)的載體p-MALTM-C中，適當(dāng)大小的融合蛋白(泳道E；圖1)在IPTG(異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷)誘導(dǎo)和SDS-PAGE后檢測。形成的蛋白質(zhì)綴合物(“MBP-cINA521”)用作抗原以免疫抗循環(huán)抑制素水平的青春期前的雌性日本鵪鶉，描述如下。
把孵化的鵪鶉在改進(jìn)的用于鵪鶉的2S-D Petersime型孵卵器電池中孵化。初始的孵化溫度是大約37.8℃，每周下降大約2.8℃直到達(dá)到室溫。在生長期間(即直到大約6周齡)，開始給鵪鶉定量配給食物(28％CP，2,800Kcal ME/kg 飼料)，提供足量的水。使用持續(xù)暗淡的光(221x)，14小時(shí)光(280至3001x)10小時(shí)黑暗。在25日齡時(shí)，把50只鵪鶉隨機(jī)分成兩個(gè)相等的注射組(每組25只鳥)如下(1)在弗氏佐劑中的MBP-cINA521(＂MBP-cINA521/FRN″)，或(2)弗氏(佐劑對照；“FRN”)。在適當(dāng)?shù)膶φ蛰d體中，使之免疫而抗抑制素的鳥(第1組)每只鳥大約施用0.75mgMBP-cINA521。把相當(dāng)?shù)淖鳛槊浇榈淖⑸潴w積(0.2ml)的FRN施用于第2組。所有注射利用帶有25號針頭的結(jié)核菌素注射器皮下注射。在初始注射后，在關(guān)進(jìn)產(chǎn)蛋籠(單個(gè))前，固定鵪鶉的翅膀以通過處理鑒別它們。每周每只鳥皮下施用大約0.375mg MBP-cINA521的加強(qiáng)抑制素免疫，或適當(dāng)?shù)膶φ彰庖叽碳?，連續(xù)五周(即在32，39，46，53和60日齡時(shí))，其后每35天進(jìn)行三次附加的免疫刺激(即在95，130和165日齡時(shí))。鵪鶉飼養(yǎng)定量配給食物(21％CP，2,750Kcal ME/kg飼料)，提供足量的水。
在41日齡時(shí)開始(所考慮的產(chǎn)蛋周期的第一天)，記錄每日雌鵪鶉日蛋產(chǎn)量(“HDEP”)和死亡率(“MORT”)測定，連續(xù)20周。此外，計(jì)算每一處理組的首次產(chǎn)蛋(“FIRST”)的平均日齡和雌鵪鶉達(dá)到50％產(chǎn)蛋量(“FIFTY”)的日齡或如上所述的最大產(chǎn)蛋量。
對雌鵪鶉日蛋產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，其中使用具有處理裂區(qū)排列的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。主要區(qū)由兩個(gè)注射處理組成(MBP-cINA521/FRN，或FRN)，20個(gè)7天的產(chǎn)蛋期，每一個(gè)包括split。
在雌鵪鶉中，抑制素免疫中和明顯地加速了青春期。在抑制素處理的雌鵪鶉中，F(xiàn)IRST產(chǎn)蛋平均日齡降低(P＜.0088)近六天(表2)。在抑制素處理的雌鵪鶉中，達(dá)到FIFTY產(chǎn)蛋量的日齡也顯著地減少(12天P＜.01)(表3)。
抑制素處理對雌鵪鶉的日蛋產(chǎn)量(HDEP)的促進(jìn)效果也存在，在產(chǎn)蛋周期的開始和結(jié)束最顯著(圖2)。例如，當(dāng)與PRN對照相比時(shí)，在利用MBP-cINA521/FRN處理的雌鵪鶉中觀察到了顯著大(P＜.05)的平均HDEP率，第1周為(16.5對2.6％)，第2周為(50.0對28.6％)，第4周為(96.6對79.7％)，在第15周時(shí)又為(98.8對86.9％)，第16周為(96.9對86.3％)，第18周為(85.7對66.1％)，第20周為(96.8％對73.8％)。抑制素-處理的雌鵪鶉的總HDEP率(包括所有20周的產(chǎn)蛋)是83.5％，相比之下，對照組為75.4％。
除加速青春期、延長產(chǎn)蛋期并提高全面的產(chǎn)蛋強(qiáng)度之外，抑制素處理降低了達(dá)到產(chǎn)蛋高峰所需要的時(shí)間(大約3周)(圖2；比較第4周時(shí)MBP-cINA521/FRN＝96.6％HDEP對第7周時(shí)FRN＝96.6％HDEP)。雖然高峰HDEP值的區(qū)別沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)，處理在平均日齡(此時(shí)雌鵪鶉達(dá)到50％HDEP水平(FIFTY))的差異反映了高峰能力。
在本研究中，死亡率不是一個(gè)因素，因?yàn)閮H有八只鳥死亡(三只對照，五只處理)。對于達(dá)到180日齡的鵪鶉來說這樣的MORT(16％)在預(yù)期的限度之內(nèi)。
表2在日本鵪鶉的第一產(chǎn)蛋量中，抑制素免疫中和對平均(±SE)日齡的效果處理 第一產(chǎn)蛋日齡(天)FRN156.15＝1.82aMBP-cINA521/FRN250.38＝1.08b1＝弗氏佐劑對照。
2＝MBP-cINA521/FRN＝在弗氏佐劑中的麥芽糖結(jié)合蛋白-雞α515-抑制素融合蛋白。
a，b(P＜.0088)。
表3在日本鵪鶉的50％產(chǎn)蛋量中，抑制素免疫中和對平均(±SE)日齡的效果處理50％產(chǎn)蛋日齡(天)FRN173.04＝3.78aMBP-cINA521/FRN261.00＝2.70b1＝弗氏佐劑對照。
2＝MBP-cINA521/FRN＝在弗氏佐劑中的麥芽糖結(jié)合蛋白-雞α515-抑制素融合蛋白。
a，b(P＜.01)。
無殼與薄殼蛋的發(fā)生率在對照鳥(而非抑制素免疫的鳥)中發(fā)生的頻率更大，特別是在產(chǎn)蛋周期的后期。這表明更大數(shù)量的缺陷蛋(即不適于消費(fèi)或在消費(fèi)前蛋很有可能破碎，或不能作為孵化蛋)與對照處理相關(guān)。
實(shí)施例9提高駝鳥的產(chǎn)蛋能力蛋白質(zhì)綴合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母駝鳥使之抗循環(huán)抑制素水平，由此在處理的駝鳥中加速產(chǎn)蛋開始。按照實(shí)施例8中所描述的方法進(jìn)行，例外如下用于未處理駝鳥的青春期的平均年齡在大約28至32個(gè)月之間。下面是處理具有大約150至300磅的近似體重范圍的駝鳥的處理進(jìn)度表在其第26個(gè)月的年齡初次(第一次)注射5.0mg本發(fā)明的異源蛋白；在第27、28、30、32、34、36月的年齡時(shí)注射2.5mg加強(qiáng)免疫。
實(shí)施例10提高食火鳥的產(chǎn)蛋能力蛋白質(zhì)綴合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母食火鳥使之抗循環(huán)抑制素水平，由此在處理的食火鳥中加速產(chǎn)蛋開始。按照實(shí)施例8中所描述的方法進(jìn)行，例外如下用于未處理食火鳥的青春期的平均年齡是大約20個(gè)月。下面是處理具有大約50至90磅的近似體重范圍的食火鳥的處理進(jìn)度表在其第18個(gè)月的年齡初次(第一次)注射3.0mg本發(fā)明的異源蛋白；在第19、20、22、24、26、30月的年齡時(shí)注射2.5mg加強(qiáng)免疫。
實(shí)施例10提高雞的產(chǎn)蛋能力蛋白質(zhì)綴合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母雞使之抗循環(huán)抑制素水平，由此在處理的雞中加速產(chǎn)蛋開始。按照實(shí)施例8中所描述的方法進(jìn)行，例外如下用于未處理雞的青春期的平均年齡是大約20周。下面是處理具有大約2.0至3.5磅的近似體重范圍的雞的處理進(jìn)度表在其第15周的年齡初次(第一次)注射1.5mg本發(fā)明的異源蛋白；在第17、20、24、30、40與50周齡時(shí)注射0.75mg加強(qiáng)免疫。
實(shí)施例11提高火雞的產(chǎn)蛋能力蛋白質(zhì)綴合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母火雞使之抗循環(huán)抑制素水平，由此在處理的火雞中加速產(chǎn)蛋開始。按照實(shí)施例8中所描述的方法進(jìn)行，例外如下用于未處理火雞的青春期的平均年齡是大約30周。下面是處理具有大約9.0至12磅的近似體重范圍的火雞的處理進(jìn)度表在其第28周的年齡初次(第一次)注射2.0mg本發(fā)明的異源蛋白；在第29、30、34、38、46與54周齡時(shí)注射1.0mg加強(qiáng)免疫。
實(shí)施例13提高鸚鵡的產(chǎn)蛋能力蛋白質(zhì)綴合物(MBP-cINA521)用作抗原免疫青春期前的母鸚鵡使之抗循環(huán)抑制素水平，由此在處理的鸚鵡中加速產(chǎn)蛋開始。按照實(shí)施例8中所描述的方法進(jìn)行，例外如下用于未處理鸚鵡的青春期的平均年齡是大約30周。下面是處理具有大約0.5至1.25磅的近似體重范圍的鸚鵡的處理進(jìn)度表在其第28月的年齡初次(第一次)注射0.75mg本發(fā)明的異源蛋白；在第29、30、32、34、36與38月齡時(shí)注射0.375mg加強(qiáng)免疫。
當(dāng)然，應(yīng)該理解前面僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，在不背離所附的權(quán)利要求中提出的精神和范圍時(shí)，本文可以做出無數(shù)的改進(jìn)或變化。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司(B)街道Jones和Askew，Peachtree街道191，Ste.3700(C)城市亞特蘭大(D)州佐治亞(E)國家美利堅(jiān)合眾國(F)郵編代碼(ZIP)30303(G)電話(404)818-3700(H)傳真(404)818-3799(A)姓名路易斯安那州立大學(xué)A&M管理董事會(B)街道Jones和Askew，Peachtree街道191，Ste.3700(C)城市亞特蘭大(D)州佐治亞(E)國家美利堅(jiān)合眾國(F)郵編代碼(ZIP)30303(G)電話(404)818-3700(H)傳真(404)818-3799(ii)發(fā)明名稱抑制素組合物和提高生產(chǎn)能力的方法(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，版本號#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度521個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)結(jié)構(gòu)否(iv)反義鏈沒有(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..303(xi)序列描述SEQ ID NO1CTG CAG CGC CCA TCG GAG GAC GTG GCC GCC CAC ACC AAC TGC CGC CGG48 LeuGln Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg5 10 15GCG TCC CTC AAC ATC TCT TTC GAG GAG CTG GGC TGG GAC AAT TGG ATC95 AlaSer Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile2025 30GTG CAC CCC AGC AGC TTC GTT TTC CAC TAC TGC CAC GGG AAC TGT GCC 144 ValHis Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala3540 45GAA GGC CAC GGG CTG AGC CAC CGG CTG GGG GTG CAG CTG TGC TGC GCC 192 GluGly His Gly Leu Ser His Arg Leu Gly Val Gln Leu Cys Cys Ala5055 60GCG CTG CCC GGC ACC ATG CGC TCA CTG CGT GTC CGC ACC ACC TCT GAT 240 AlaLeu Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp6570 75 80GGT GGC TAC TCC TTC AAG TAC GAG ACG GTG CCC AAC ATC CTG GCG CAG 288 GlyGly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Ile Leu Ala Gln85 90 95GAC TGC ACC TGT GTC TAGCAGCTGG CATGCACGGC CAGACCCGCG TGGATCTCCC 343 AspCys Thr Cys Val 100CGTTGCCTCT GGACTGCCCC AGTGCCAGAT GATGAGCCCA TCCCAGGGAT GGAGGAGTCA 403CTCACACGGG CACTGCGCAG CCCGGAGCAG GGAGAGGGAC CCAGGTGGAA GTTTTGGTGG 463TGCCACCCTC CCTTTGACTG CCAGGGTTTC ATGGTTTCAG GTTGCGTGGG TGCTGCAG 521(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度101個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Leu Gln Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg5 10 15Ala Ser Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile20 25 30Val His Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala 3540 45Glu Gly His Gly Leu Ser His Arg Leu Gly Val Gln Leu Cys Cys Ala 5055 60Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp 6570 75 80Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Ile Leu Ala Gln85 90 95Asp Cys Thr Cys Val100
權(quán)利要求
1.一種提高鳥類生產(chǎn)能力的方法，這種方法包括向鳥類施用一種有效量的包含α-亞基鳥類抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的異源蛋白來提高鳥類生產(chǎn)能力。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的鳥選自由平胸類(ratite)、鸚鵡目(psitaciforme)、獵鷹目(falconiforme)、piciformes、strigiformes、passeriformes、coraciformes、falliformes、cuculiformes、columbiformes、galliformes、anseriformes和herodiones組成的組。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說的平胸類是駝鳥、食火鳥、rhea、無翼鳥、食火雞。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所說的鳥是雞、火雞、鸚鵡(parrot)、鸚鵡(parakeet)、makaw、獵鷹、鷹(eagle)、鵪鶉、鷹(hawk)、鴿子、美冠鸚鵡(cockatoo)、鳴禽、
鳥、山鳥類、雀類、囀鳥、鵝、鴨、金絲雀、八哥、巨嘴鳥或者是麻雀。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所說的抑制素蛋白具有或者包含實(shí)質(zhì)上與SEQ ID NO1相同的序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說的載體蛋白是麥芽糖結(jié)合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、血清白蛋白、γ-球蛋白、有性生殖細(xì)胞、含有Ia抗原的有性生殖細(xì)胞或者氨基酸的聚合物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所說的鳥是雌性鳥。
8.權(quán)利要求l的方法，其中所說的鳥是雄性鳥。
9.一種融合的異源蛋白，這種蛋白包含融合到載體蛋白上的α-亞基抑制素蛋白或者其片段。
10.權(quán)利要求9的融合的異源蛋白，其中所說的抑制素蛋白具有或者包含實(shí)質(zhì)上與SEQ ID NO2相同的序列。
11.權(quán)利要求9的融合的異源蛋白，其中所說的載體蛋白是麥芽糖結(jié)合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、γ-球蛋白、甲狀腺球蛋白、有性生殖細(xì)胞、含有Ia抗原的有性生殖細(xì)胞或者氨基酸的聚合物。
12.一種產(chǎn)生融合的異源蛋白的方法，這種方法包括下列步驟(a)提供編碼α-亞基抑制素或其片段的雙鏈cDNA；(b)提供具有產(chǎn)生載體蛋白的編碼信息的載體；(c)將所說的抑制素cDNA連接到此載體上；(d)將連接的載體插入到一種表達(dá)系統(tǒng)中；(e)表達(dá)包含抑制素蛋白或其片段和此載體蛋白的融合異源蛋白。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說的抑制素cDNA具有或者包含實(shí)質(zhì)上與SEQ ID NO1相同的序列。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所說的表達(dá)的融合異源蛋白中的抑制素蛋白或其片段具有或者包含實(shí)質(zhì)上與SEQ ID NO2相同的序列。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所說的載體蛋白是麥芽糖結(jié)合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔戚血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、血清白蛋白、γ-球蛋白、有性生殖細(xì)胞、含有Ia抗原的有性生殖細(xì)胞或者氨基酸的聚合物。
16.一種融合的基因產(chǎn)物，這種基因產(chǎn)物包含融合到編碼載體蛋白表達(dá)的基因中的編碼α-亞基鳥類抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因。
17.權(quán)利要求16的融合基因產(chǎn)物，其中所說的編碼α-亞基鳥類抑制素蛋白表達(dá)的基因編碼具有或包含實(shí)質(zhì)上與SEQ ID NO2相同之序列的蛋白的表達(dá)。
18.權(quán)利要求16的融合基因產(chǎn)物，其中所說的編碼α-亞基鳥類抑制素蛋白表達(dá)的基因?qū)嵸|(zhì)上與SEQ ID NO1的序列相同。
19.權(quán)利要求16的融合基因產(chǎn)物，其中所說的編碼載體蛋白表達(dá)的基因編碼麥芽糖結(jié)合蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、γ-球蛋白、有性生殖細(xì)胞、含有Ia抗原的有性生殖細(xì)胞或者氨基酸的聚合物。
20.一種組合物，這種組合物包含含有載體的細(xì)胞，其中所說的載體包含編碼抑制素或其片段和載體蛋白的DNA序列，并且其中所說的載體當(dāng)其存在于此細(xì)胞中時(shí)，能夠表達(dá)融合到此載體蛋白上的抑制素或其片段。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所說的編碼抑制素或其片段的DNA序列是SEQ ID NO1。
22.一種包含載體的組合物，其中所說的載體包含編碼抑制素或其片段和載體蛋白的DNA序列，并且其中所說的載體當(dāng)其存在于此細(xì)胞中時(shí)，能夠表達(dá)融合到此載體蛋白上的抑制素或其片段。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所說的編碼抑制素或其片段的DNA序列是SEQ ID NO1。
24.一種提高鳥類生產(chǎn)能力的方法，這種方法包括向鳥類施用一種有效量的融合基因產(chǎn)物來提高鳥類生產(chǎn)能力，這種基因產(chǎn)物包含編碼α-亞基鳥類抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。
25.一種方法，這種方法包括植入到包含載體的動(dòng)物細(xì)胞中，其中所說的載體包含編碼抑制素或其片段和載體蛋白的DNA序列，并且其中所說的載體當(dāng)其存在于此細(xì)胞中時(shí)，能夠表達(dá)融合到此載體蛋白上的抑制素或其片段。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所說的編碼抑制素或其片段的DNA序列是SEQ ID NO1。
全文摘要
一般來說,本發(fā)明涉及通過向鳥類施用一種包含抑制素蛋白或其片段和載體蛋白的異源蛋白來提高鳥類生產(chǎn)能力的方法。本發(fā)明也涉及通過向鳥類施用一種融合基因產(chǎn)物來提高鳥類生產(chǎn)能力的方法,這種基因產(chǎn)物包含編碼α－亞基鳥類抑制素蛋白或其片段表達(dá)的基因和編碼載體蛋白表達(dá)的基因。向動(dòng)物施用有效量的所說的異源蛋白或融合基因產(chǎn)物,以便在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生抗此異源蛋白的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還涉及上述的異源蛋白和融合基因產(chǎn)物以及產(chǎn)生這些產(chǎn)物的方法。
文檔編號A61K39/00GK1192692SQ96195839
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者W·C·菲爾萊提, K·科索拉司, D·G·塞特里 申請人:農(nóng)業(yè)技術(shù)公司, 路易斯安那州立大學(xué)及農(nóng)業(yè)和機(jī)械學(xué)院, 管理委員會