專利名稱：二咖啡?？鼘幩嵩谥委熞倚透窝准芭c逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)疾病中的用途及新咖啡?？鼘幩嵫苌锏闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二咖啡酰奎寧酸在治療乙型肝炎及與逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)疾病上的新用途，新的咖啡?？鼘幩嵫苌锛昂Х弱？鼘幩峄蛐碌目Х弱？鼘幩嵫苌锏乃幬锝M合物。
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種嚴(yán)重的世界性傳染疾病。目前全世界約有3.5億人帶有HBV標(biāo)志的感染者。中國是乙型肝炎的高流行區(qū)，其中50-70％的人群受過HBV感染，約8-10％的人是乙型肝病毒表面抗原攜帶者。由于HBV持續(xù)感染會導(dǎo)致肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌等慢性肝臟疾病，故其死亡率很高。近幾十年以來，人們一直在尋找治療和/或預(yù)防乙型肝炎的藥物，并已開發(fā)出一些治療乙型肝炎的藥物，如化學(xué)藥物如阿糖腺苷單磷酸，無環(huán)鳥苷，蘇拉明，喹諾銅類藥物，中國傳統(tǒng)中草藥的有效成份如苦參堿、甘草甜素、豬芩多糖、香菇多糖等，生物制劑如干擾素，白細(xì)胞介素-2，乙肝疫苗等。但這些藥物由于副作用或使用不方便，尤其是停藥后病毒水平反跳等原因，尚不能達到令人滿意的治療程度。另外，與逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)的疾病，如由逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV感染引發(fā)的人免疫缺乏綜合癥(AIDS)，目前仍無十分有效的藥物對其進行治療。因此，研究和開發(fā)停藥后使乙型肝炎病毒水平幾乎沒有反跳的新的治療乙型肝炎藥物及新的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒，如HIV病毒的藥物是十分需要的。
本發(fā)明的目的是提供一類新的抗乙型肝炎藥物及新的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，其具有優(yōu)良的療效且副作用很低，尤其是其停藥后，可使乙型肝炎病毒水平幾乎不發(fā)生反跳。
本發(fā)明人經(jīng)廣泛深入的研究，出人意料地發(fā)現(xiàn)二-咖啡?？鼘幩峒翱Х弱？鼘幩嵫苌飳σ倚透窝撞《炯澳孓D(zhuǎn)錄病毒抗原的表達，病毒DNA的復(fù)制有良好的抑制作用，尤其是在停藥后，可使乙型肝炎病毒水平幾乎不發(fā)生反跳。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明第一個目的涉及式I的二咖啡?？鼘幩嵫苌镌谥委熞倚透窝准芭c逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)疾病中的用途。
其中R1，R2和R3可相同或不同，分別為OH或咖啡?；?，條件是R1為咖啡?；鶗r，R2，R3為OH，或R2為咖啡酰基時，R1，R3為OH，或R3為咖啡?；鶗r，R1，R2為OH。
本發(fā)明第二個目的涉及的是式II新的咖啡?？鼘幩嵫苌?。
其中R1’，R2’和R3’可相同或不同，分別為氫，C1-6烷基，
條件是R1′，R2′，R3′不能同時為氫，R4為堿金屬M，C1-6烷基，M選自堿金屬如Na，K等，R5＝R6且為氫，C1-6烷基，CH3CO。
本發(fā)明再一目的涉及的是含式I化合物的藥物組合物，該藥物組合物對乙型肝炎病毒(HBV)及逆轉(zhuǎn)錄病毒有良好的抑制作用。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加有各種藥用賦形劑，添加劑及載體。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式I或式II化合物或含式I或式II化合物的藥物組合物可用于治療乙型肝炎及與逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)的各種疾病，尤其是用于治療乙型肝炎。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物可按本領(lǐng)域已知方法配成腸道或非腸道給藥的制劑，如片劑，膠囊，粒劑，注射液等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式I或式II化合物，主要來自植物，如菊科植物旋復(fù)花。其中式II化合物可通過半合成法對式I化合物進行適當(dāng)化學(xué)修飾得到。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明優(yōu)選的抗乙肝病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒的化合物為下式1，5-二-O-咖啡酰奎寧酸。
根據(jù)本發(fā)明，1，5-二-O-咖啡?？鼘幩峥蓮木湛浦参镄龔?fù)花中提取得到，其具體提取路線如圖4所示在上述提取路線中，組份IEB5即為1，5-二-O-咖啡?？鼘幩帷?br> 下面將通過1，5-二-O-咖啡酰奎寧酸(今后簡稱為化合物A)在體內(nèi)外抗乙型肝炎病毒的生物作用來進一步闡述本發(fā)明。
在下面生物實驗中主要通過化合物A對HBV DNA聚合酶的抑制作用和對2.2.15細(xì)胞合成、分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用及對HBV DNA復(fù)制的抑制作用研究，對化合物A的體外抗HBV作用進行評價。利用鴨乙型肝炎病毒模型對化合物A進行初步體內(nèi)抗HBV作用評價。
材料與方法1.1材料1.1.1病毒，細(xì)胞和動物HBV懸液購自北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所。
2.2.15細(xì)胞株HBV DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(Hep G2)的2.2.15細(xì)胞系，美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，我國北京醫(yī)科大學(xué)傳染科引進，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所滕立提供，自行傳代培養(yǎng)。
鴨乙型肝炎病毒上海麻鴨血清，核酸雜交DHBV DNA陽性(+++)，-70℃保存。
動物1日齡北京鴨，購自北京禽蛋公司養(yǎng)殖場。1.1.2 試劑HBV DNA質(zhì)粒、DHBV DNA質(zhì)粒中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所李壯提供。
α32P-dCTP北京福瑞生物技術(shù)工程公司。
缺口翻譯藥盒Promega公司。
Sephadex G-50，PVP瑞典Pharmacia公司。
SDS德國Merck公司。
硝酸纖維素膜英國Amersham公司。
魚精蛋白，牛血清白蛋白中國科學(xué)院生物物理所DMEM(Dulbecco`s Modified Eagle Medium)干粉美國GIBCO BRL產(chǎn)品。
胎牛血清美國GIBCO BRL產(chǎn)品。
G-418(Geneticin)美國GIBCO BRL產(chǎn)品。
青霉素，鏈霉素，華北制藥廠HEPES香港FARCO公司產(chǎn)品。
四甲基偶氮唑鹽(MTT)Sigma公司產(chǎn)品(400μg/100ml MEM)；HBsAg，HBeAg固相放射免疫測定盒北方免疫試劑研究所產(chǎn)品；脫氧三磷酸腺苷(dATP)、脫氧三磷酸胞苷(dCTP)、脫氧三磷酸鳥苷(dGTP)和脫氧三磷酸胸甙(dTTP)為美國Sigma公司產(chǎn)品。
β-巰基乙醇(β-ME)、NP-40為英國BDH公司產(chǎn)品。
1，4-雙-[2-(5-苯基惡唑)]苯(POPOP)為Baker公司產(chǎn)品。
3H-dTTP英國Amersham公司產(chǎn)品。
十二烷基磺酸鈉(S.D.S)、2，5-二苯惡唑(PPO)西德Merck公司產(chǎn)品。
其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純或分析純試劑，均由本院提供。
2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液及試劑配制檢測DNAp用3H-dTTP底物摻入液配制終濃度貯存液濃度取量Tris.HCl PH 7.6200mmol/L 1mol/L1000μlNH4Cl 200mmol/L 1mol/L1000μlMgCl250mmol/L 1mol/L250μlNP-40 2％ 100％ 100μlβ-ME 0.6％ 100％ 30μldATP 0.3mmol/L 100mmol/L 15μldCTP 0.3mmol/L 100mmol/L 15μldGTP 0.3mmol/L 100mmol/L 15μl3H-dTTP 20μCi/ml 1mCi/ml 100μlD.D.W 加至5000μl在冰浴中配制，即配即用。
閃爍液0.5％PPO和0.015％POPOP的二甲苯溶液。
DMEM培養(yǎng)液含胎牛血清10％，青霉素100μg/ml，鏈霉素100u/ml，用5％NaHCO3調(diào)PH至7.0。
傳代用DM EM培養(yǎng)液加G418380μg/ml，細(xì)胞消化液0.25％胰酶，用Hanks液配制。
MTT染色液用DMEM液配制成，-4℃保存，400μg/ml，每孔100μl。
化合物A溶液化合物A以DMEM培養(yǎng)液配制成100mg/ml和10mg/ml兩種貯存液，以5％NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.2。
實驗用品及儀器培養(yǎng)瓶，丹麥Tunclon TM；培養(yǎng)板，96孔板，24孔板，美國Corning公司產(chǎn)品；
二氧化碳孵箱，美國Shel-Lab產(chǎn)品；γ-計數(shù)器1.2 實驗方法1.2.1 化合物A對HBV DNA聚合酶活性的抑制試驗1.2.1.1 方法以下步驟在冰浴上進行(1)取新配制的摻入液40μl，加到1.5ml的Eppendorf管中，再加配制好的化合物A溶液8μl于管中，最后加超離心制備的HBV DNAp樣品32μl，充分混勻，Eppendorf管中溶液總體積為80μl。酶對照組不加藥而加8μl雙蒸水，陽性對照藥為PFA(磷甲酸)，陰性對照為40μl摻入液加40μl雙蒸水。將管內(nèi)反應(yīng)體系充分混勻。
(2)離心10秒，將裝有反應(yīng)體系的Eppendorf管放置在37℃水浴，慢搖(50轉(zhuǎn)/分)反應(yīng)3小時。
(3)65℃水浴2分鐘，終止反應(yīng)。離心10秒。
(4)取上清70μl點樣于已編號標(biāo)記的Whatman 3號濾紙片園片(2cm)上。
(5)將點好樣的濾紙片用4℃預(yù)冷好的5％三氯乙酸(TCA)(含0.1％焦磷酸)振蕩洗滌10分鐘，共3次。
(6)用4℃預(yù)冷的無水乙醇浸泡10分鐘，自然晾干。
(7)將濾片置于閃爍液中，用液爍儀測定其cpm值。1.2.1.2化合物A作用結(jié)果處理與統(tǒng)計計算化合物A在不同濃度時3H-d TTP摻入HBV DNA的cpm均值與標(biāo)準(zhǔn)誤，與不加化合物A陽性對照組比較進行t檢驗。
計算化合物A在不同濃度時對HBV DNAp活性的抑制率。
公式1
抑制率與化合物A濃度轉(zhuǎn)化為兩參數(shù)的logit作圖法作圖若為直線，可以在圖上直接讀出IC50。IC50＝10(截距/斜率)1.2.2 化合物A對2.2.15細(xì)胞合成分泌HBV的抑制作用1.2.2.1 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)2.2.15自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所病毒研究室引進，自行傳代培養(yǎng)。在長滿2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加5ml 0.25％胰酶消化液輕洗，倒出，再加2ml消化液，37℃消化，于細(xì)胞發(fā)生變化前倒出消化液，平放。待細(xì)胞開始脫落時加培養(yǎng)液吹打，1∶3傳代，加150μg/ml G418壓克隆，7天長滿。進行細(xì)胞計數(shù)，配制成105個/ml接種細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，細(xì)胞長成單層后進行實驗。1.2.2.2細(xì)胞毒性試驗化合物A貯存液(100mg/ml)用培養(yǎng)液2倍稀釋10個濃度，每孔20μl于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板至終濃度為8-0.03mg/ml，每濃度6孔，每4天換同濃度藥液，設(shè)無藥物細(xì)胞對照，8天觀察結(jié)果。
傾去培養(yǎng)液，每孔加入MTT培養(yǎng)液(400μg/ml)，每孔100μl，37℃，5％CO2孵育4小時，可見黃黑色甲瓚顆粒，棄去上清，加DMSO 100μl溶解，待甲瓚顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀570nm波長測定OD值。1.2.2.3對HBeAg、HBsAg合成和分泌的抑制試驗1.2.2.3.1 方法2.2.15細(xì)胞以105個/ml接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)48小時，加無毒濃度以下2倍稀釋化合物A溶液，至終濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.6和7.8μg/ml。每濃度3孔，同時設(shè)陽性對照藥和無藥物細(xì)胞對照，37℃5％CO2培養(yǎng)，共12天，每4天更換原濃度藥液培養(yǎng)，將收集的培養(yǎng)液-20℃冰凍保存；將收集的培養(yǎng)液同時測定HBeAg和HBsAg，同時設(shè)細(xì)胞對照和陽性藥物對照。計算細(xì)胞對照及各濃度cpm均值及標(biāo)準(zhǔn)誤、對HBsAg和HBeAg的抑制百分率(％)和半數(shù)抑制濃度(IC50)
HBeAg和HBsAg測定用中國同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品，固相放設(shè)免疫測定盒測定，方法見說明書分別取相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液200μl加入抗HBe(HBs)包被株1粒，室溫過夜，以0.01 M PBS洗液(含0.05％吐溫-20)洗滌6次，瀝干，加200μl125I-抗-HBe(HBs)，室溫過夜，P BS洗滌6次，瀝干。用γ-計數(shù)器測定每孔藥液cpm值。1.2.2.3.2 化合物A作用結(jié)果處理與統(tǒng)計化合物A對HBsAg和HBeAg的抑制百分率(％)計算公式2.1
IC50以cpm值或抑制率與藥物濃度的對數(shù)用四參數(shù)Logistic函數(shù)擬合作圖，曲線形狀若為典型的S型濃度-效應(yīng)曲線，可以得到在不同濃度處理時抗原生成量RIMA測定cpm的最大值(Emax)和最小值(Emin)，最大抑制率、最低抑制率、抑制50％所需濃度(IC50)和斜率(Hill′s系數(shù))。IC50為抑制曲線中最重要的參數(shù)，它代表抑制抗原生成所需的藥物濃度，在曲線斜率相同的條件下，顯然濃度越低表示藥物的抑制活性越高。抑制率與藥物濃度轉(zhuǎn)化為兩參數(shù)的logit作圖法作圖若為直線，可以在圖上直接讀出IC50。IC50＝10(截距/斜率)。1.2.2.4 化合物A對2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA復(fù)制的抑制作用2.2.15細(xì)胞DNA提取24孔板2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)加不同濃度藥液培養(yǎng)12天。傾去培養(yǎng)液，PBS洗三次，加0.1ml消化液(0.1％SDS，0.15MNaCl，0.01MTris，HClPH7.5，0.01M EDTA，2mg/ml Pronase)，37℃反應(yīng)2小時，消化產(chǎn)物以等體積苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，每次處理10分鐘，離心12000rpm，10分鐘。取上清，加1/10體積5MNaCl和2.5倍體積無水乙醇，液氮氣相冷凍30分鐘，12000rpm離心10分鐘沉淀DNA，真空抽干，重溶于TE緩沖液中，作為樣品。
α-32P探針標(biāo)記按Promega缺口轉(zhuǎn)移試劑盒說明書標(biāo)記探針取1μl含HBV DNA質(zhì)粒，加10μl 100mM dNTP(dATP，dGTP，dTTP)，5μl 10×缺口翻譯緩沖液，α32P-dCTP 5μCi，5μl DNA聚合酶/DNA內(nèi)切酶混合物，用雙蒸水補足50μl，置12℃反應(yīng)2小時。加0.5M EDTA 5μl終止反應(yīng)。標(biāo)記物加到用1×TE平衡的Sephadex G-50柱(0.6×12cm)，TE洗脫，從上樣開始計數(shù)，第8滴開始收集，每管8滴，共收集10管，低能輻射儀測定各管放射性強度。合并第一峰液體，-20℃?zhèn)溆谩?br> 細(xì)胞DNA的Southern Blot分析1)凝膠制備制做1％瓊脂糖凝膠，凝固后將膠置于電泳槽中，拔出梳子。
2)上樣樣品加1/10體積的加樣緩沖液，混勻，加至各梳孔中，同時加HindIII DNA作對照。
3)電泳樣品孔一端接陰極，50mA電泳過夜4)檢查加溴化乙錠染色30分鐘，紫外燈下檢查，切除不需要部分。
5)預(yù)處理將膠放入0.25M HCl中10分鐘，水沖洗三遍。
6)變性將膠放入變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中1小時，不間斷的輕輕搖動，以水漂洗。
7)中和將膠放入中和液(1MTris.HCl PH7.6，1.5MNaCl)中1小時，不斷振徭，更換中和液，繼續(xù)中和15分鐘。
8)轉(zhuǎn)膜在轉(zhuǎn)移槽中加入10×SSC。在小架子上鋪兩層潤濕的濾紙，兩端浸在10×SSC中，濾紙上再放一層與膠大小相同的濾紙，趕走氣泡，四周用塑料條蓋上，以免“短路”。將膠翻轉(zhuǎn)過來放在濾紙上，趕氣泡，將大小相同的硝酸纖維素膜仔細(xì)放在膠上，趕走氣泡，再放大小相同的濾紙若干層，最后放吸水紙，壓上玻璃板及重物，適時更換吸水紙，轉(zhuǎn)移過。夜。丟棄吸水紙、濾紙，小心取下硝酸纖維素膜，夾在干燥濾紙中，做好標(biāo)記，室溫涼干，放冰箱中備用。
9)預(yù)雜交將膠置于雜交袋中加入預(yù)雜交液(3×SSC-0.1％SDS10ml)65℃，30分鐘。換10×Denhardt液-0.1％SDS 10ml，10mg/ml變性載體DNA 200ml，65℃過夜。
10)雜交去掉預(yù)雜交液，換雜交液(50％甲酰胺，25％Denhardt液0.1％SDS)，20％2×SSC，5％D.D.H2O，100μl變性DNA，200μl變性探針，1％焦磷酸)，42℃，48小時。
11)洗膜用3×SSC-0.1％SDS分別在室溫，42和65℃各洗滌10分鐘。
12)夾片曝光夾片，-70℃曝光，D72顯影7分鐘，定影10分鐘，水洗膠片。1.2.3化合物A在鴨體內(nèi)的抗HBV作用1.2.3.1鴨乙型肝炎病毒感染孵出24小時內(nèi)的北京鴨，由足靜脈注射上海麻鴨DHBV DNA陽性血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分離血清，-70℃保存等檢。1.2.3.2藥物治療試驗第一批DHBV感染雛鴨7天后，隨機分為5組，每組7只。三組化合物A給藥組劑量分別為50、12.5和5mg/kg體重，陽性藥物為無環(huán)鳥苷(ACV)50mg/kg口服，bid×14。設(shè)病毒對照組以生理鹽水代替藥物。在感染后7天用藥前(T0)、用藥第7天(T7)、第14天(T14)和停藥后第5天(P5)自鴨足靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。
第二批DHBV感染雛鴨7天后，隨機分4組，每組5只。二組化合物A給藥組劑量分別為50和12.5mg/kg體重，陽性藥物為無環(huán)鳥苷(ACV)50mg/kg口服，bid×10。設(shè)病毒對照組以生理鹽水代替藥物。在感染后7天用藥前(T0)、用藥第5天(T5)、第10天(T10)和停藥后第3天(P3)自鴨足靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。
DHBV DNA檢測方法DHBV DNA探針標(biāo)記按Promega缺口翻譯藥盒說明書用α32P-dCTP標(biāo)記探針方法同HBV DNA探針標(biāo)記。
斑點雜交檢測鴨血請中DHBV DNA1)膜處理用蒸餾水和10×SSC浸泡硝酸纖維素膜各30分鐘，置室溫涼干。
1)點膜取40μl上述待檢血清，每批各組樣品同時點膜，室溫涼干。
2)變性將硝酸纖維素膜分別浸于下列變性液中變性變性液I，0.5MNaOH 10分鐘。
中和液II，1MTris.HCl PH7.6，0.6MNaCl，10分鐘中和液III，0.5MTris.HCl PH7.6，1.5MNaCl，10分鐘。室溫涼干。
3)置80℃烤箱中2小時。
4)預(yù)雜交將膠置于雜交袋中加入預(yù)雜交液(3×SSC-0.1％SDS10ml)65℃，30分鐘。換10×Denhardt液-0.1％SDS 10ml，10mg/ml變性載體DNA 200ml，65℃過夜。
5)雜交去掉預(yù)雜交液，換雜交液(50％甲酰胺，25％Denhardt液0.1％SDS)，20％2×SSC，5％D.D.H2O，100μl變性DNA，200μl變性探針，1％焦磷酸)，42℃，48小時。
6)洗膜用3×SSC-0.1％SDS分別在室溫，42℃和65℃各洗滌10分鐘。
7)夾片曝光夾片，-70℃曝光，D72顯影7分鐘，定影10分鐘，水洗膠片。
8)用DG3022型酶標(biāo)檢測儀測定光密度值(OD)(λ＝490nm)和Primax掃描儀測定總灰度。
計算每組鴨不同時間血清DHBV DNA OD490(總灰度)均數(shù)并將每組鴨用藥后各時間及停藥后血清OD490(總灰度)與給藥前T0比較，進行t檢驗。
將各組不同時間DHBV DNA抑制率分別與對照組相同時間的同一指標(biāo)比較，進行t檢驗。
計算每組鴨用藥后DHBV DNA抑制率公式2.2
二.結(jié)果2.1化合物A對HBV DNA聚合酶活性的抑制作用表1.化合物A和PFA對HBV DNAp活性的體外抑制作用[HBV DNA3H-dTTP摻入值(cpm)和抑制率(％)，表內(nèi)數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)差±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝2，病毒陽性對照為11093±992.6，不加酶陰性對照cpm值為146.4±12.8]藥物 濃度(μg/ml) 110 1001000化合物Acpm值 9856.1±200.97990.4±78.5 3522.0±50.6**1982.7±158.6**抑制率(％) 11.17±1.93 30.81±0.75 68.39±0.49 82.31±1.52PFAcpm值 10266.8±76.65495.0±218.4**3064.9±67.4**2377.1±329.0**抑制率(％) -5.23±15.31 44.39±2.27 69.65±0.70 76.81±3.42重復(fù)實驗結(jié)果顯示化合物A具有較強的抑制HBV DNAp活性的作用，具有典型的量效關(guān)系，各批實驗IC50變化很小，為14.3-30.6μg/ml?；衔顰和PFA在以兩參數(shù)logit作圖法所得抑制曲線中IC50接近，化合物A斜率較PFA小，說明化合物A在低濃度時作用強，而在高濃度時PFA作用較強。2.2化合物A在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中的抗乙型肝炎病毒作用2.2.1 化合物A對2.2.15細(xì)胞增殖的影響2.2.15細(xì)胞以105個/ml接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.2ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)48小時，加2倍稀釋化合物A溶液10個濃度，化合物A在8、4、2mg/ml劑量組第4天起，2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液開始有輕微顏色變化，8mg/ml劑量組第8天時顏色變綠。在顯微鏡下觀察化合物A在8、4、2mg/ml劑量組第4天起形態(tài)有較輕微的變化，0.5mg/ml以下劑量組2.2.15細(xì)胞形態(tài)正常。MTT染色后，各劑量組OD值與正常細(xì)胞對照基本相同(結(jié)果見表2)
表2不同濃度化合物A對轉(zhuǎn)染HBV DNA肝癌細(xì)胞株HepG22.2.15細(xì)胞的影響，培養(yǎng)8天后細(xì)胞用MTT染色，在570nm波長條件下測定O.D.值。劑 量8.00 4.00 2.00 1.00 0.50 0.25 0.13 0.06 0.03 0.015 0(mg/ml)一批均數(shù) 2.76 2.19 2.23 2.03 2.03 1.96 1.96 1.95 1.89 2.09 1.99SD0.12 0.09 0.09 0.07 0.06 0.05 0.05 0.07 0.08 0.04二批均數(shù) 2.17 2.21 2.05 1.86 1.86 1.83 1.66 1.90 1.45 1.78 1.89SD0.19 0.19 0.15 0.14 0.12 0.12 0.09 0.13 0.23 0.13 0.092.2.2 化合物A在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對HBeAg和HBsAg表達的作用2.2.15細(xì)胞以105個/ml接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加無毒濃度以下2倍稀釋化合物A溶液，將加藥后第4，8和12天收集的培養(yǎng)液同時以RIMA法測定HBeAg和HBsAg的量。用γ-計數(shù)器測定每孔藥液cpm值。兩批重復(fù)實驗結(jié)果見表3、4表3.化合物A在2.2.15培養(yǎng)中對HBeAg和HBsAg合成和分泌的抑制作用(表內(nèi)數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝3，陰性血清對照為171.1±13.86)(第一批實驗)濃度 時間 HBeAg HBsAg(μg/ml) (天)cpm值 抑制率(％) cpm值 抑制率4 5062.4±204.7831.5±36.608 6731.8±571.8# 866.3±66.212 7499.4±167.7## 773.4±11.84 4830.7±269.7 4.84±5.61 786.6±36.1 6.47±5.197.81 8 6600.7±544.9 2.03±8.43 728.7±43.6 18.85±5.9812 6421.7±716.7 14.9±9.91 800.5±67.0 -4.25±10.54 4187.7±230.4*18.25±4.79652.2±50.2*25.78±7.2215.638 5912.3±1001 12.67±1.56671.0±20.0*26.75±2.74
12 5544.8±763.6 27.02±10.6774.9±53.7 -0.23±8.434 3270.1±84.3**37.37±1.76530.2±66.5*43.33±9.5631.25 8 4373.7±241.9*36.47±3.74640.7±24.5*30.89±3.3612 5090.9±268.9**33.29±3.72674.2±55.1 15.57±8.654 3014.7±64.5**42.70±1.35466.2±27.9**52.53±4.0162.5 8 3789.0±134.0**45.36±2.07550.9±14.1**43.19±1.9312 3782.8±379.5**51.38±5.25509.0±39.9**41.49±6.264 2667.7±67.0**49.93±1.40435.4±16.6**56.97±2.381258 3136.4±471.4**55.60±7.29479.5±20.1**52.98±3.3012 3314.8±255.9**57.85±3.54432.8±21.7**53.44±3.404 2200.9±194.5**9.66±4.05 393.4±32.2**63.01±4.632508 2341.5±359.4**67.90±5.56454.1±27.4**56.45±3.7612 2558.8±281.8**68.30±3.90389.9±27.5**60.18±4.324 4720.5±354.9 7.14±7.39706.5±23.7*17.98±3.41ACV8 6101.9±949.2 9.74±14.7769.3±85.1 13.29±11.712 6527.5±2081 13.44±28.8749.8±12.8 3.71±2.01*和**與同一培養(yǎng)時間不加藥細(xì)胞對照比較p＜0.05或0.01#和##不加藥正常細(xì)胞培養(yǎng)不同時間比較p＜0.05或0.01表4.化合物A在2.2.15培養(yǎng)中對HBeAg和HBsAg合成和分泌的抑制作用(表內(nèi)數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝3，陰性血清對照為265.85±16.36)(第二實驗)濃度 時間HBe AgHBs Ag(μg/m)(天)cpm值 抑制率(％) cpm值 抑制率(％)45205.2±136.2 1211.6±39.10 88231.8±172.9## 1163.2±41.8128499.4±167.7## 759.0±15.644764.0±212.08.94±4.29 1032.6±10.8**17.21±1.037.8187400.7±163.3*10.43±2.05 979.3±42.3*18.54±4.26127188.3±197.5**15.93±2.40 617.0±27.2**24.17±4.63
44264.0±192.1*19.06±3.89941.1±27.2**26.00±2.6215.63 85707.0±567.8**31.70±7.1 888.9±16.3**27.65±1.64126211.5±183.3**27.80±2.23574.6±18.8**31.37±3.2043503.4±328.9**34.47±6.66824.2±29.7**37.24±2.8631.25 84906.8±196.4**41.75±2.47808.5±18.9**35.75±1.90125991.2±291.9**30.47±3.55546.5±8.7**36.15±1.4843181.4±181.7**40.99±3.68717.5±12.2**47.48±1.1762.5 84631.7±196.8**45.21±2.47699.7±20.2**46.72±2.03124603.5±66.76**47.33±0.81464.2±7.50**50.14±1.2842867.7±53.8**47.35±1.09618.5±25.4**57.00±2.4412584052.1±150.6**52.49±1.89617.7±20.6**54.99±2.08124014.8±82.8**54.48±1.01416.1±14.7**58.32±2.5142034.2±100.3**64.23±2.03563.5±23.1**62.29±2.2225083081.5±181.7**64.67±2.28480.8±46.5**68.79±4.68123025.4±74.0**66.50±0.90367.5±6.70**66.60±1.1543910.9±57.6**26.22±1.17710.1±65.7**48.20±6.31ACV86101.9±96.17**26.75±1.21870.1±51.1**29.54±5.15128194.1±111.5 3.71±1.36 622.5±58.8 23.22±2.01*和**與同一培養(yǎng)時間不加藥細(xì)胞對照比較p＜0.05或0.01#和##不加藥正常細(xì)胞培養(yǎng)不同時間比較p＜0.05或0.012.2.2.1 化合物A在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對HBeAg合成和分泌的抑制作用自表3、4結(jié)果看出2.2.15細(xì)胞株在不同濃度的化合物A處理條件下培養(yǎng)4、8和12天后，對培養(yǎng)液HBeAg生成量的抑制作用與濃度的對數(shù)成正比。抑制程度并不隨藥物作用時間延長而變化，第4、8和12天時的IC50相近。
表5. 2.2.15細(xì)胞株在不同濃度的化合物A處理條件下培養(yǎng)4、8和12天后，對培養(yǎng)液HBeAg生成量的影響。
Logit模型擬合量效曲線數(shù)據(jù)，。培養(yǎng)時間截矩A) 斜率(B) IC50R P4天-1 -2.05±0.271.41±0.1728.4 0.98 0.003784天-2 -1.68±0.171.02±0.1044.4 0.98 0.000548天-1 -2.45±0.271.55±0.1838.1 0.98 0.003068天-2 -2.70±1.042.02±0.6021.7 0.86 0.0283412天-1-1.41±0.080.88±0.0540.0 0.99 0.000512天-2-1.27±0.080.67±0.0578.6 0.99 0.000152.2.2.2 化合物A在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對HBsAg合成和分泌的作用從表3、4可以看出2.2.15細(xì)胞株在不同濃度的化合物A處理條件下培養(yǎng)4、8和12天后，對培養(yǎng)液HBeAg生成量的抑制作用與濃度的對數(shù)成正比。第4和8天時的IC50相近，第12天時一批試驗IC50增大。
表6. 2.2.15細(xì)胞株在不同濃度的化合物A處理條件下培養(yǎng)4、8和12天后，對培養(yǎng)液乙肝病毒表面抗原(HBsAg生成量的影響。
Logit模型擬合量效曲線數(shù)據(jù)。
截矩(A)斜率(B) IC50RP4天-1 -2.18±0.231.64±0.15 21.30.9870.001664天-2 -1.30±0.019 0.895±0.01128.30.9990.000018天-1 -1.34±0.145**0.889±0.08432.20.9920.00018天-2 -2.70±1.004*2.02±0.60 21.70.9820.0004612天-1-4.35±0.353**2.59±0.21 47.80.9930.0065312天-2-1.03±0.041**0.464±0.023165 0.9950.00004*、**和***與藥物作用4天時比較時，P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001。2.2.3 化合物A在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA復(fù)制的抑制作用(Southern Blot分析)對正常2.2.15細(xì)胞及經(jīng)不同濃度化合物A處理的2.2.15細(xì)胞進行DNA提取，凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜雜交。放射自顯影結(jié)果可見正常細(xì)胞對照有約3.7kb的游離的HBV DNA帶，化合物A在62.5和125μg/ml時DNA帶的量明顯降低，250μg/ml時降低最為明顯。可見化合物A能抑制HBV DNA的復(fù)制，抑制作用隨劑量增加而增強。


圖1表示化合物A于不同濃度下在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA酶抑制作用(southern Blot分析)2.3 化合物A口服治療對DHBV感染雛鴨血清DHBV DNA量的抑制作用口服不同劑量化合物A對感染鴨肝病毒(DHBV)雛鴨血清DHBV DNA量的影響(試驗一)DHBV感染雛鴨7天后，開始口服給藥，分別在感染后7天用藥前(T0)、用藥第7天(T7)、第14天(T14)和停藥后第5天(P5)自鴨足靜脈取血，分離血清，32P-dCTP標(biāo)記探針，斑點雜交檢測DHBV DNA，放射自顯影圖象所得顯影圖象見圖2。
口服不同劑量化合物A對感染鴨肝病毒(DHBV)雛鴨血清DHBVDNA量的影響(試驗二)DHBV感染雛鴨7天后，口服給藥，在感染后7天用藥前(T0)、用藥第5天(T5)、第10天(T10)和停藥后第3天(P3)自鴨足靜脈取血，分離血清，32P-dCTP標(biāo)記探針，斑點雜交檢測DHBV DNA，放射自顯影圖象所得顯影圖象見圖3。
化合物A北京鴨最大耐受量＞4g/kg。
圖2和圖3是感染雛鴨治療前、治療后第7和14天和停藥后5天取鴨血清，用32P-dCTP斑點雜交后的放射自顯影圖象。表7顯示各處理組同一檢查時間7只鴨血清斑點，酶標(biāo)儀檢測斑點黑度、光密度的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和各組DHBV DNA量隨治療的變化。其主要結(jié)果是治療前各組病毒DNA量無統(tǒng)計差別；治療后鹽水對照光密度值有些波動但無統(tǒng)計意義。阿昔洛韋組治療后7和14天黑度明顯減低，但停藥后平均值高于治療前。化合物A組的療效依賴于治療持續(xù)的時間和服藥劑量，連續(xù)治療14天的療效優(yōu)于治療7天，停藥后療效減弱。 5mg組無明顯降低病毒DNA的作用，50mg劑量組療效最好，抑制作用出現(xiàn)較早，檢測到的病毒水平較低，而且在停藥后仍保持在與治療前對照明顯低的水平(p＜0.05)。表7.口服不同劑量化合物A對感染鴨肝病毒(DHBV)雛鴨血清病毒DNA量的影響(試驗一)斑點雜交法檢測，酶標(biāo)儀測定斑點總吸光度(O.D./斑點，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝7)對照 阿昔洛韋 化合物A 化合物A化合物A50mg/kg 5mg/kg 12.5mg/kg 50mg/kg治療前 0.17±0.160.15±0.05 0.16±0.050.21±0.06 0.15±0.06活療后7天 0.13±0.040.03±0.04**0.16±0.050.13±0.06*0.06±0.04**治療后14天 0.19±0.130.03±0.04**0.15±0.050.06±0.06**0.03±0.06**停藥后5天 0.22±0.130.24±0.16 0.16±0.040.17±0.08 0.05±0.07**和**與治療前比較時P＜0.05和P＜0.01。
為了驗證結(jié)果的可靠性進行了第二次重復(fù)試驗，DHBV感染雛鴨7天后，口服給藥，在感染后7天治療前(T0)、用藥第5天(T5)、第10天(T10)和停藥后第3天(P3)自鴨足靜脈取血，分離血清用斑點雜交檢測DHBVDNA。圖3是放射自顯影圖，表8是用圖象分析法得到的結(jié)果。本次試驗中ACV組治療后10天病毒DNA有減低趨勢(P＞0.05)，化合物A的12.5mg組未顯示明顯療效，但是50mg組顯示與第一次試驗類似特點的療效。表8.口服不同劑量化合物A對感染鴨肝病毒(DHBV)雛鴨血清病毒DNA量的影響(試驗二)斑點雜交法圖象分析法測定斑點總灰度(KGrayness/斑點，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝4或5)對照 阿昔洛韋化合物A 化合物A50mg/kg 12.5mg/kg50mg/kg治療前 4.0±1.54.0±1.42.6±0.4 9.1±3.2治療后5天 3.6±1.15.1±0.82.1±0.8 4.0±2.3*活療后10天3.6±1.02.4±1.62.4±0.4 1.5±0.3**停藥后3天 4.3±1.46.4±0.82.4±0.4 3.8±1.4**和**與治療前比較時P＜0.05和P＜0.01。三、討論與結(jié)論在HBV DNA復(fù)制過程中，至少有3種病毒特異性酶活性是必須的1)依賴RNA的DNAp，2)依賴DNA的DNAp，3)RNase H(為降解前基因組RNA而合成正股DNA的酶)。一般認(rèn)為，這三種酶活性為同一蛋白分子所具有，與DNA P區(qū)基因編碼有關(guān)。HBV DNAp是HBV DNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵酶，一旦DNAp被抑制，HBV DNA的復(fù)制就會中斷，HBV的生長增殖就會停止。因此能抑制HBV DNAp活性的藥物即具有抗病毒作用。對HBV DNAp活性抑制作用的測定，是進行藥物篩選和療效判斷的重要指標(biāo)。
化合物A各劑量組2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，MTT染色后，各劑量組OD值與正常細(xì)胞對照基本相同，甚至高濃度(8和4mg/ml)時略有升高。在顯微鏡下觀察化合物A在8、4、2mg/ml劑量組2.2.15細(xì)胞形態(tài)有較輕的變化，可能與藥物在血清及各種金屬離子于37℃長時間作用下生成的有色物質(zhì)有關(guān)。1mg/ml以下劑量組2.2.15細(xì)胞形態(tài)正常。
2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBeAg的量較高，而HBsAg的量則較低。藥物作用4、8和12天后，對HBeAg和HBsAg的生成量都有顯著的抑制作用，作用隨化合物A濃度增強，但是劑量增大至一定量后(IC50)抑制作用呈飽和趨勢，表現(xiàn)為典型的S形抑制曲線。培養(yǎng)時間越長，不加藥時培養(yǎng)液中生成HBeAg抗原量越多，而HBsAg則有相反的趨勢，但抑制程度并不隨藥物作用時間延長而增強或降低，IC50穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，說明化合物A的抑制作用比較穩(wěn)定?；衔顰對2.2.15細(xì)胞DNA復(fù)制也有抑制作用。
感染DHBV北京雛鴨于感染后7天進行治療，給藥14天，其主要結(jié)果是治療前各組病毒DNA量無統(tǒng)計差別；治療后鹽水對照組血清DHBV DNA水平有波動，但無統(tǒng)計意義。阿昔洛韋組治療后7和14天DNA水平明顯減低，但停藥后平均值高于治療前?；衔顰組的療效依賴于治療持續(xù)的時間和服藥劑量，連續(xù)治療14天的療效優(yōu)于治療7天，停藥后療效減弱。5mg組無明顯降低病毒DNA的作用，50mg劑量組療效最好，抑制作用出現(xiàn)較早，檢測到的病毒水平較低，而且在停藥后仍保持在與治療前對照明顯低的水平(p＜0.05)。重復(fù)實驗得到類似的結(jié)果，ACV(50mg/kg)治療5天未見明顯的抑制作用，第10天的作用也相對較小，同時化合物A的作用也較第一次實驗偏低。
用體外HBV DNAp活性抑制實驗篩選分離得到的化合物A，在2.2.15細(xì)胞和DHBV感染鴨模型中都顯示明顯的抗HBV作用，進一步證明了初篩方法的可行性和可靠性，同時說明化合物A具有抑制DNA聚合酶活性，從而抑制DNA復(fù)制的作用途徑。
結(jié)論化合物A具有較強的抑制HBV DNAp的作用，IC50為14.3-30.6μg/ml，具有典型的S型濃度-效應(yīng)曲線，化合物A在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBV復(fù)制及抗原生成有較強抑制作用。對培養(yǎng)液中HBeAg和HBsAg的合成和分泌有典型的量效關(guān)系的抑制作用，兩批重復(fù)實驗IC50分別為21～78μg/ml和21～165μg/ml，Southern雜交表明對HBV DNA的生成有抑制作用。1.0μg./ml濃度的化合物A對2.2.15細(xì)胞的增殖無明顯不良影響。
化合物A在DHBV感染北京鴨體內(nèi)模型也有抗病毒作用，北京鴨感染DHBV第7天開始口服給藥，化合物A給藥后第7和14天對血清DHBV有依賴于劑量的抑制作用，50mg/kg/天劑量組作用最強，停藥5天后血清DHBV DNA仍維持在較低水平，明顯低于NS和ACV組。初步試驗表明化合物A口服最大耐受量大于4g/kg。
權(quán)利要求
1.下式的二-咖啡?？鼘幩嵫苌镌谥苽溆糜谥委熞倚透窝准芭c逆轉(zhuǎn)錄病毒感染有關(guān)疾病的藥物中的用途，
其中R1，R2和R3可相同或不同，分別為OH或咖啡?；瑮l件是R1為咖啡?；鶗r，R2，R3為OH，或R2為咖啡?；鶗r，R1，R3為OH，或R3為咖啡?；鶗r，R1，R2為OH。
2.下式的咖啡?？鼘幩嵫苌铮?br> 其中R1’，R2’和R3’可相同或不同，分別為氫，C1-6烷基，
條件是R1’，R2’，R3’不能同時為氫，R4為堿金屬M，C1-6烷基，M選自堿金屬如Na，K等，R5＝R6且為氫，C1-6烷基，CH3CO。
3.一種用于治療乙型肝炎及與逆轉(zhuǎn)錄病毒感染有關(guān)疾病的藥物組合物，其包括作為活性成份的權(quán)利要求1的二-咖啡酰奎寧酸衍生物或權(quán)利要求2所要求的咖啡?？鼘幩嵫苌铮八幱觅x形劑或載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中二-咖啡?？鼘幩釣?，5-二-O-咖啡?？鼘幩?。
5.權(quán)利要求2的咖啡?？鼘幩嵫苌镌谥委熞倚透窝准芭c逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)疾病中的用途。
6.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述藥物組合物可被配成片劑，膠囊，注射液或劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及二咖啡?？鼘幩嵩谥委熞倚透窝准芭c逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)疾病上的新用途,新的咖啡?？鼘幩嵫苌锛昂Х弱？鼘幩峄蛐碌目Х弱？鼘幩嵫苌锏乃幬锝M合物。
文檔編號A61P31/18GK1175411SQ9611169
公開日1998年3月11日 申請日期1996年8月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月29日
發(fā)明者董俊興, 湯仲明, 米志寶, 王秉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所