專利名稱：用作興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)拮抗物和/或鈣通道阻滯劑的聚胺和多肽的制作方法
本申請是中國專利申請?zhí)枮?0103929.2，申請日為1990年4月27日的中國專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及某種被發(fā)現(xiàn)存在于Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中的聚胺和多肽。聚胺及其可藥用的鹽類拮抗影響包括無脊椎動物和脊椎動物在內(nèi)的多種生物體的神經(jīng)細胞的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)。多肽和一種所述聚胺及其可藥用鹽類阻滯包括無脊椎動物和脊椎動物在內(nèi)的多種生物體的神經(jīng)細胞和肌肉細胞中的鈣通道。本發(fā)明也涉及這些聚胺及其鹽類的用途，即除用于拮抗影響例如生物體神經(jīng)系統(tǒng)細胞的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)本身外，還用于治療哺乳動物中興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的介導(dǎo)病及病理狀態(tài)以及防治無脊椎動物病害，還涉及含有所述聚胺及其鹽類的組合物。另外，本發(fā)明涉及所述多肽和一種所述聚胺及其鹽類的用途，即除用于阻滯例如生物體的神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)細胞中鈣通道本身外，還用于治療哺乳動物中鈣通道介導(dǎo)病和病理狀態(tài)，以及防治無脊椎動物病害，還涉及含有所述多肽、聚胺及其鹽類的組合物。
據(jù)報道，Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中含有至少影響鈣流的兩種毒素，Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci.Abstr.121078(1987)。其作者公開了一種在其中稱為AG2的毒素，該毒素分子量低于1000道爾頓，并對大范圍細胞組織中的鈣流呈現(xiàn)出抑制作用。另外，Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci.Abstr.12730(1986)中報道了另一種取自Aglenopsis aperta的毒素，它含有一種分子量約為6000的組分。據(jù)報道該毒素引起傳遞過程的突觸前阻滯，文章提出該毒素對鈣通道的阻滯與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)。
屬興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)拮抗物的化合物有多種用途。其中已發(fā)現(xiàn)興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)拮抗物可臨床應(yīng)用于治療如癲癎發(fā)作、中風(fēng)、腦局部缺血及神經(jīng)退化病如阿爾茨海默氏病和癲癎的病理狀態(tài)以及作為一種精神治療劑，見《在健康和疾病中的興奮性氨基酸》(Excitatory Amino Acids in Health andDisease，D.Lodge，Ed.，John Wiley and SonsLtd.，New York，NY 1988)，其中的知識在此結(jié)合作為參考。此外，這類化合物也用于研究細胞生理學(xué)(如神經(jīng)細胞)以及防治無脊椎動物病害。
鈣拮抗物類化合物具有多種用途。其中已發(fā)現(xiàn)鈣拮抗物用于臨床治療如心絞痛、高血壓、心肌病、室上心律不齊、駝背aesophogeal失馳緩性、早產(chǎn)及雷諾病的病理狀態(tài)。見《鈣拮抗物》(W.G.Nayler，Calcium Antagonists，Academic Press，Harcourt Brace Javanovich Publishers，NewYork，NY1988)，其中的知識在此結(jié)合作為參考。此外，這類化合物也用于細胞生理學(xué)如神經(jīng)細胞研究以及防治無脊椎動物病害。
本發(fā)明涉及的聚胺及多肽被發(fā)現(xiàn)存在于Agelenopsisaperta蜘蛛毒液中。本發(fā)明的聚胺以及按照本發(fā)明含有該聚胺的餾分如下餾分A＇(AGEL 452) 餾分A1(AGEL 468) 餾分A2(AGEL 448) 餾分B1(AGEL 505) 餾分B2(AGGL 504)高分辨FAB質(zhì)譜法(FAB MS)測得C27H43N6O3分子量計算值為505.3861。餾分E(AGEL 489) 本發(fā)明的多肽以及按照本發(fā)明含有該多肽的餾分如下餾分G一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-谷-賴-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-異亮-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-異亮-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-精-甘-亮-賴-賴-蘇-半胱-異亮-絲-賴-亮-絲-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-絲-；按照FAB質(zhì)譜法(FAB MS)確定的整個多肽分子量為7267。餾分H2一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-丙-賴-丙-亮-脯-脯-甘-絲-纈-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-酪-甘-賴-色-組-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-苯丙-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-賴-甘-甲硫-甘-組-蘇-半胱-異亮-蘇-賴-亮-組-半胱-脯-天冬酰胺-賴-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-按照離子霧化質(zhì)譜法(Ion-Spray MS)確定的整個多肽分子量為7793。餾分IH2N-天冬-半胱-纈-甘-谷-絲-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-組-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-蘇-半胱-精-酪-苯丙-脯-賴-半胱-異亮-半胱-纈-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH2；FAB MS4158。餾分JH2N-天冬-谷-脯-半胱-異亮-脯-亮-甘-賴-絲-半胱-絲-色-賴-異亮-甘-蘇-脯-酪-半胱-半胱-脯-組-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-蘇-色-半胱-異亮-纈-天冬-酪-絲-精-苯丙-纈-蘇-異亮-半胱-絲-甘-精-賴-酪-CONH2；依照FAB MS確定的整個多肽的分子量為5506。餾分L1一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-異亮-纈-甘-甘-賴-蘇-丙-賴-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-纈-絲-異亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-賴-天冬酰胺-賴-賴-甘-甘-苯丙-天冬-；整個多肽的分子量近似值約為20,000。餾分L2一種按實施例9所述而獲得的多肽。餾分M一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-谷-丙-蘇-谷-丙-丙-賴-纈-亮-絲-天冬酰胺-亮-天冬-谷-蘇-纈-天冬-脯-；整個多肽分子量近似值約為80,000。
本發(fā)明的聚胺及其可藥用鹽類拮抗影響細胞的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)。因此，所述聚胺自身用于拮抗所述神經(jīng)遞質(zhì)。本發(fā)明的聚胺也可用于防治由興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的無脊椎動物病害及治療哺乳動物中由興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的疾病和病理狀態(tài)。所述聚胺也可用作哺乳動物的精神治療劑。
上述聚胺B1與本發(fā)明的多肽阻滯細胞中鈣通道。因此，所述聚胺B1和多肽自身用于阻滯細胞中鈣通道。所述聚胺B1和多肽也用于防治無脊椎動物的細胞中鈣通道功能介導(dǎo)病害及治療哺乳動物的細胞中鈣通道功能介導(dǎo)疾病及病理狀態(tài)。
具有與上述多肽基本相同的氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯效能的多肽也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還涉及含有所述聚胺和多肽的醫(yī)藥組合物以及所述聚胺和多肽的使用方法。
按照本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法通過電刺激的擠榨工序從Agelenopsis aperta蜘蛛中獲取毒液。優(yōu)選使用的方法是其能防止由腹回流或血淋巴造成完整毒液的污染，這種方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的。如此獲得的完整毒物在用于如下所述的純化之前，在約-78℃下以凍結(jié)態(tài)儲存。
完整毒液組分的純化是采用反相高效液相色譜法(HPLC)在各種制備和半制備柱上完成的，如C-4和C-18Vydac(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Woburn Massachusetts 01801)。用單色波在220-230nm范圍內(nèi)進行峰值檢測。餾分的進一步分析例如可用沃特斯(Waters)990二極管陣列檢測器(MiuiporeCorporation，Waters Chromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts01757)采集的多色UV數(shù)據(jù)來完成。柱上的餾分用已知方法收集，例如通過用ISCO/“FOXY”餾分收集器和ISCO2159峰測儀(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)。將餾分收集在適當(dāng)尺寸的容器中，例如消毒的聚乙烯實驗室器皿。然后該餾分冷凍干燥以去除洗脫液及隨后冷凍干燥去除水完成其濃縮。然后，所得組分餾分的純化物可通過使用具有梯度體系的分析柱的色譜分析來確定，這種梯度體系較用于餾分最終純化的體系更為isocratic。
各種餾分所具有的結(jié)構(gòu)依照已知的分析法確定，如質(zhì)譜測定法和核磁共振法。本發(fā)明的多肽是依照已知方法定序的。例如所研究的多肽中胱氨酸殘基的S-吡啶基乙基化作用可在溶液中進行，隨后進行多肽的氨基酸定序。這-S-吡啶基乙基化作用步驟如下。將約1-10微克的多肽溶解或稀釋到多達50微升的緩沖劑中，該緩沖劑是由一份PH值為8.5含有4mM乙二胺四乙酸(EDTA)的1M的鹽酸三羥甲基氨基甲烷(Tris HCl)和三份8M的鹽酸胍混合配制而成。然后，加入2.5微升10％的2-巰基乙醇水溶液，將該混合物于室溫在氬氣氛下于暗處培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)之后，加入2微升4-乙烯基吡啶(儲存于-20℃氬氣氛下的新鮮試劑)，將混合物于室溫在氬氣氛下于暗處再培養(yǎng)2小時。然后將混合物脫鹽，優(yōu)選采用在一短的反相柱上進行色譜分離。然后按照已知的方法對回收的烷基化多肽定序。
在實施本發(fā)明及采用如上概述的基本步驟時發(fā)現(xiàn)，用于毒液原始分離的合適的分離柱為22毫米×250毫米的C-18Vydac柱，其孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗離該柱體所用流速為15毫升/分，采用線性梯度程序為95％→80％A，5％→20％B〔0→30分鐘〕，然后80％→30％A，20％→70％B〔30→55分鐘〕，其中A為0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液，B為乙腈。餾分是按照上面描述的方法收集的。如此獲得的、標(biāo)以A、B、E、G、H、I、J、K、L和M的餾分被選擇用于進一步的分析和/或純化。另外發(fā)現(xiàn)，完整毒液分離時產(chǎn)生一種特別是在此標(biāo)以A＇的餾分，分離時用C-18Vydac柱(22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ)，所用流速為15毫升/分，采用線性梯度程序為5％→10％B，95％→90％A〔0→30分鐘〕，其中A和B如上所述。不同餾分的洗脫時間將在以下的實施例1和實施例2中給出。
對餾分A、B、G、H、I/J和L還將用不同的分離柱和梯度程序做進一步的純化。每一特定的細分級及其結(jié)果將在以下的實施例3、4、6、7、8和10中給出。
如以下實施例所示，餾分A＇、A1、A2、B1、B2和E含有聚胺化合物。這些化合物以及含有這些化合物的餾分如下所示。餾分A＇(AGEL 452) 餾分A1(AGEL 468) 餾分A2(AGEL 448) 餾分B1(AGEL 505) 餾分B2(AGEL 504)高分辨FAB MS測得C27H48N6O3分子量計算值為505.3861。餾分E(AGEL 489) 如以下實施例所示，餾分G、H2、I、J、L1、L2和M含有多肽。這些多肽及含有該多肽的餾分如下餾分G一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-谷-賴-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-異亮-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-異亮-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-精-甘-亮-賴-賴-蘇-半胱-異亮-絲-賴-異亮-絲-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-絲-；按照FAB質(zhì)譜法所得整個多肽分子量為7267。餾分H2一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-丙-賴-丙-亮-脯-脯-甘-絲-纈-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-酪-甘-賴-色-組-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-苯丙-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-賴-甘-甲硫-賴-組-蘇-半胱-異亮-蘇-賴-亮-組-半胱-脯-天冬酰胺-賴-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-；按照離子霧化質(zhì)譜法測得整個多肽分子量為7793。餾分IH2N-天冬-半胱-纈-甘-谷-絲-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-組-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-蘇-半胱-精-酪-苯丙-脯-賴-半胱-異亮-半胱-纈-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH2；FAB MS4159。餾分JH2N-天冬-谷-脯-半胱-異亮-脯-亮-甘-賴-絲-半胱-絲-色-賴-異亮-甘-蘇-脯-色-半胱-半胱-脯-組-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-蘇-色-半胱-異亮-纈-天冬-酪-絲-精-苯丙-纈-蘇-異亮-半胱-絲-甘-精-賴-酪-CONH2；FAB MS5506。餾分L1一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-異亮-纈-甘-甘-賴-蘇-丙-賴-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-纈-絲-異亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-賴-天冬酰胺-賴-賴-甘-甘-苯丙-天冬-；整個多肽的分子量近似值為20,000。餾分L2一種如按實施例9所述獲得的多肽。餾分M一種氨基末端氨基酸序列含有H2N-谷-丙-蘇-谷-丙-丙-賴-纈-亮-絲-天冬酰胺-亮-天冬-谷-蘇-纈-天冬-脯-；整個多肽的分子量近似值為80,000。
在此將有關(guān)取自Agelenopsis aperta毒液的餾分中的化合物的作用予以公開，該化合物目前也可通過除分離/純化外其他的方法由完整毒液中獲取。所有這些方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，餾分A＇、A1、A2、B1、B2和E中含有的聚胺可直接用合成制得。餾分G、H2、I、J、L1、L2和M中含有多肽及其所述的整個氨基酸序列可按照熟知的方法通過體外蛋白質(zhì)合成法來合成制得。例如，這類多肽可用一種ABI 430A固相肽合成器(Applied Biosystems，Inc.，850 LincolnCenter Drive Foster City，California 94404)采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)Merrifield化學(xué)或其他固相化學(xué)加以合成。該多肽也可通過該多肽或其部分的編碼序列的無性繁殖的DNA重組體技術(shù)制得。對于哪些僅知其部分氨基酸序列的多肽也可進行無性繁殖，例如，使用能利用已知的氨基酸序列信息的混和探測器的方法。DNA重組體技術(shù)與體外蛋白質(zhì)合成法的結(jié)合也可用來制造本發(fā)明的多肽。
本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已熟知，某些氨基酸取代物可用多肽制造而不影響或基本不影響所述多肽的功能。這種確定的取代物在一種多肽到另一種多肽中是可以變化的。對可容許的取代物的確定可依照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法進行。因此，具有基本相同的氨基酸序列和具有基本相同的鈣通道阻滯效能的所有多肽均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
制造本發(fā)明中其通式為 (其中R為H或OH)的某些聚胺的合成流程如以下反應(yīng)流程A到D所示。
反應(yīng)流程A
反應(yīng)流程B
反應(yīng)流程C
反應(yīng)流程D
反應(yīng)流程E
反應(yīng)流程G
反應(yīng)流程G(續(xù))
反應(yīng)流程H
按照反應(yīng)流程A，式X的聚胺中間化合物是通過由二氨基丁烷起始的一系列反應(yīng)步驟制備而成。制備按照反應(yīng)流程A式X的中間化合物適宜的反應(yīng)條件在實施例11的A到I部分中給出。反應(yīng)流程B說明了一種制備式XIII的中間化合物的方法。制備按照反應(yīng)流程B的中間化合物適宜的反應(yīng)條件在實施例11的J到L部分中給出。式XXI的中間化合物的制備方法示于反應(yīng)流程C。制備按照反應(yīng)流程C式XXI的化合物適宜的反應(yīng)條件在實施例12的A到F部分中給出。制備本發(fā)明的式XVI和XXV的聚胺化合物的方法示于反應(yīng)流程D。偶合式X和XIII或X和XXI的兩個中間化合物以及隨后制備式XVI和XXV化合物適宜的反應(yīng)條件在實施例11的M到O部分以及實施例12的G到I部分中給出。
反應(yīng)流程E和F分別表明了中間化合物XXVIII和XXXI的制備方法。制備按照反應(yīng)流程E的中間化合物適宜的反應(yīng)條件在實施例13的A到C部分中給出。制備按照反應(yīng)流程F的中間化合物適宜的反應(yīng)條件在實施例14的A到C部分中給出。制備本發(fā)明的式XXXVI和XXXVII聚胺化合物的方法示于反應(yīng)流程G。偶合式X和XXVIII或X和XXXI兩種中間化合物以及隨后制備式XXXVI和XXXVII化合物適宜的反應(yīng)條件分別在實施例13的D到F部分以及實施例14的D到F部分中給出。
反應(yīng)流程H表明了本發(fā)明的式XLI聚胺化合物的制備方法。制備式XXXVIII中間化合物，將其偶合到式XXII中間化合物以及隨后制備本發(fā)明的式XLI的聚胺化合物適宜的反應(yīng)條件示于例15中。
本發(fā)明的聚胺對影響細胞的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)有可逆的拮抗作用。所述細胞諸如包括無脊椎動物和脊椎動物的多種生物體的神經(jīng)系統(tǒng)細胞。用于全文的脊椎動物概念包括哺乳動物。用于全文的無脊椎動物概念含意包括如昆蟲、外寄生物和內(nèi)寄生物等。如上所述，餾分B1的聚胺也對存在于多種細胞中的鈣通道有可逆的阻滯作用。所述細胞諸如無脊椎動物和脊椎動物系統(tǒng)中包括心血管在內(nèi)的神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)中的細胞。
本發(fā)明的聚胺拮抗興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的能力是依照以下步驟通過其阻滯幼鼠小腦中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導(dǎo)的環(huán)鳥苷酸(cGMP)值升高的能力表現(xiàn)出來的。將十只8-14天的Wistar鼠的小腦快速切下并于4℃下放置在PH值為7.4的克雷伯氏/碳酸氫鹽緩沖劑中，然后用McIIwain組織切碎機(The Nickle Laboratory Engineering Co.，Gomshall，Surrey，England)將其切成0.5毫米×0.5毫米的切片。將所得的小腦切片轉(zhuǎn)放于37℃的100毫升的與95∶5的O2/CO2相持續(xù)平衡的克雷伯氏/碳酸氫鹽緩沖劑中。小腦切片以90分鐘。三次更換緩沖劑的方式培養(yǎng)。然后去除緩沖劑。將該組織離心分離(1分鐘，3200r.p.m)并將其再懸浮于20毫升克雷伯氏/碳酸氫鹽緩沖劑中。而后，取出250微升等分試樣(約2毫克)并放入1.5毫升的微驅(qū)逐管(microfuge)中。向這些試管中加入10微升待研究的化合物配制液，接著再加入10微升的2.5mM的NMDA溶液使反應(yīng)開始。最終的NMDA濃度為100μM。控制不使NMDA增加。這些試管在37℃的搖動水浴中培養(yǎng)1分鐘，然后加入750微升的50mM氯化三羥甲基氨基甲烷(Tris-Cl)，5mM EDTA溶液以終止反應(yīng)。將試管立即置于沸騰水浴中五分鐘。然后，將每一試管中的組分用置于第三能級的探測聲波定位器聲波定位15秒鐘。取出10微升該組分，用Lowry，Anal.Biochem.100∶201-220(1979)中報道的方法確定蛋白質(zhì)。隨后將這些試管做離心分離(5分鐘，10,000xg)，去除100微升的上層清液，然后采用New England Nuclear(Boston，Massachusetts)按照廠商提供的環(huán)鳥苷酸放射免疫分析法(cGMP RIA assay)測定環(huán)鳥苷酸值。數(shù)據(jù)以每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生微微摩爾的環(huán)鳥苷酸表示。
本發(fā)明的多肽不可逆地阻滯存在于多種細胞中的鈣通道。所述細胞諸如無脊椎動物和脊椎動物的神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)中的細胞。
餾分B1的聚胺以及餾分G、H1、H2、I、J、K、L1、L2和M中的多肽對鈣通道的阻滯能力可通過以下步驟顯示出來。將解離的幼鼠新皮層神經(jīng)元懸浮于PH值為7.4含有2mM CaCl2和1％牛血清白蛋白(BSA)的克雷伯氏碳酸氫鹽緩沖劑中。將神經(jīng)元離心分離沉淀并再懸浮于附加含有1μM fura2/AM(Sigma Chem.Co.，P.O.BOX 14508，St.Louis，Missouri 63178)的與前相同的緩沖劑中。將這些細胞于37℃培養(yǎng)15分鐘，洗滌，而后在不含fura2/AM的相同緩沖劑中再培養(yǎng)15分鐘。再將這些細胞于含有1.5mMCaCl2的上述緩沖劑中洗滌并作為濃縮細胞懸浮液在室溫下平衡5-10分鐘。向一小石英杯中加入1.2毫升預(yù)熱的(37℃)，含有1.5mM CaCl2和10mM葡萄糖而不含BSA的緩沖劑，然后加入0.3毫升上述制備的濃縮細胞懸浮液。小杯放置在一具有磁攪拌器的熱態(tài)夾持器內(nèi)(37℃)，并用一熒光分光光度計(如Perkin Elmer 650-40型，Perkin Elmer，Wilton，Connecticut 06897)測量其熒光。熒光信號允許穩(wěn)定約1分鐘。然后將1-4微升以適當(dāng)濃度存在于克雷伯氏碳酸氫鹽緩沖劑中的待研究的化合物的儲液加到小杯中。熒光信號的校準(zhǔn)和fura-2漏失量的校正用確定的Nemeth，et al.，J.Biol.Chem.2625188(1987)中報道的方法進行。在每個試驗完成時，通過加入依諾霉素(ionomycin)確定最大熒光值(Fmax)，并且通過接著向螯合鈣中添加5毫摩爾乙二醇雙乙胺醚-N，N′-四乙酸(EGTA)以確定最小熒光值(Fmin)。使用上述步驟，由加入標(biāo)題化合物時熒光值的減小，顯示出使用標(biāo)題化合物所發(fā)生的鈣通道阻滯。
具有與餾分G、H1、I、J、L1、L2和M基本相同的氨基酸序列的多肽也在本發(fā)明的范圍之中，它們具有和上述多肽基本相同的鈣通道阻滯作用。
本發(fā)明的聚胺對拮抗興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)本身是有效的。因此，該聚胺也用于控制無脊椎動物病害，以及用于治療哺乳動物中以興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的疾病和病理狀態(tài)。例如癲癎發(fā)作，中風(fēng)，大腦局部缺血，神經(jīng)退化性紊亂如阿爾茨海默氏病和癲癎。上述聚胺也用作哺乳動物的精神治療劑。此外，該聚胺在研究包括但不限于神經(jīng)系統(tǒng)細胞的細胞生理學(xué)中是有用的。
本發(fā)明餾分B1的聚胺和多肽本身在細胞中有效的作為鈣通道阻滯劑。因此，這些化合物也用于控制無脊椎動物病害，以及治療由哺乳動物細胞中鈣通道功能所介導(dǎo)的疾病和病理狀態(tài)，例如心絞痛、高血壓病、心肌病、上心室上律不齊、駝背失馳緩病(aesophogealachalasia)、早產(chǎn)和雷諾病。此外，這些化合物在研究包括但不限于神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)細胞的細胞生理學(xué)中是有用的。
本發(fā)明的聚胺和多肽的可藥用鹽類也在本發(fā)明的范圍之中。這些鹽采用該專業(yè)普通技術(shù)人員所熟知的方法制成。例如，聚胺的酸式添加鹽和多肽的堿式鹽可按照一般的方法制備。
在將本發(fā)明的聚胺或多肽施用于哺乳動物時，它可以單獨使用，或與可藥用載體或稀釋劑結(jié)合，以按照標(biāo)準(zhǔn)藥品慣例的藥品組合物形式使用。該聚胺和多肽可以口服或不經(jīng)腸道施用，對于多肽優(yōu)選非經(jīng)腸道的用藥方法。非經(jīng)腸道的用藥包括靜脈、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和局部用藥。
對于本發(fā)明聚胺或多肽的口服用藥，化合物可以如片劑或膠囊形式服用，或作為水溶液或懸浮液服用。在口服片劑的情況下，通常添加載體，一般使用的載體包括乳糖和糧食淀粉，并添加潤滑劑如硬酯酸鎂。對于口服膠囊形式，有效的稀釋物是乳糖和干燥的糧食淀粉。當(dāng)需要以含水懸浮液用于口服時，將有效成分與乳化劑和懸浮劑相結(jié)合。如果需要，可以加入某些甜化劑和/或加味劑。
對于肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈用藥，通常制備有效成分的無菌溶液，并且溶液的PH值應(yīng)適于調(diào)整和緩沖。對于靜脈用藥，應(yīng)控制溶劑的總濃度以提供配制品的等滲性。
當(dāng)本發(fā)明的聚胺或多肽或它們的鹽用于人體治療時，日劑量一般由開藥方的醫(yī)生確定。此外，劑量按照各個病人的年令、體重和反應(yīng)，以及病人癥狀的嚴重性和所施用的具體化合物的效力而不同。
當(dāng)本發(fā)明的聚胺或多肽或它們的鹽用于控制無脊椎動物病害時，上述化合物被直接施用于所述的無脊椎動物或提供到所述無脊椎動物的環(huán)境中。例如，本發(fā)明的一種化合物可作為溶液噴灑到上述無脊椎動物身上，為控制上述無脊椎動物病害所需化合物的量根據(jù)該無脊椎動物及環(huán)境條件而變化，并且由施用該化合物的人確定。
當(dāng)本發(fā)明的聚胺或多肽或它們的鹽被用于細胞生理學(xué)研究時，上述化合物按照該專業(yè)普通技術(shù)人員所公知的方法供入細胞。例如，上述化合物可以以適當(dāng)?shù)纳砭彌_溶液的形式供入這些細胞，用于此項研究的本發(fā)明化合物的適當(dāng)濃度為100μM。然而在這項研究中所述化合物的濃度可以大于或遠小于100μM。所供入的該化合物的量按照公知的方法由該專業(yè)普通技術(shù)人員確定。
實施例1Agelenopsis aperta完整毒液的初步分離將由Natural Product Sciences Inc.，SaltLakeCity，Utah 84108獲得的，并以冷凍狀態(tài)于大約-78℃貯存的Agelenopsis aperta完整毒液融解，并將10-60微升的該毒液稀釋到200微升，再置于C-18多孔層實心球(22毫米×250毫米，300?？讖酱笮?，10微米顆粒尺寸)柱上，并使用15毫升/分的流速和用下列線性梯度程序的溶劑體系洗脫5％→20％B，95％→80％A〔0→30分鐘〕然后20％→70％B，80％→30％A〔30→55分鐘〕，此處A是0.1％的含水三氟乙酸(TFA)，B是乙腈。于220-230毫微米單色波進行峰值檢測，并用ISCO/“FOXY”餾分收集器和ISCO 2159峰值檢測器收集各餾分。餾分收集20分鐘至60分鐘，在峰值檢測的基礎(chǔ)上，收集到以下餾分餾分 洗脫時間A約21分鐘
B 約22.75分鐘E 約27.5分鐘G 約38分鐘H 約39分鐘I 約40分鐘J 約40分鐘L 約43分鐘M 約48.3分鐘實施例2分離Agelenopsis aperta的完整毒液以獲得餾分A＇按照實施例1所述獲得Agelenopsis aperta的完整毒液并將其置于C-18多孔層實心球柱上。使用15毫升/分的流速和用下列線性梯度程序的溶劑體系洗脫該柱5％→10％B，95％→90％A〔0→30分鐘〕，此處A是0.1％的含水三氟乙酸(TFA)，B是乙腈。按實施例1所述進行峰值檢測和餾分收集。以大約12.5分鐘洗脫獲得餾分A＇，然后為進行光譜分析，按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過冷凍干燥去洗脫液和隨后的冷凍干燥去水制備餾分A＇。
由餾分A＇包括的化合物結(jié)構(gòu)隨后通過使用FAB MS確定。如此獲得的數(shù)據(jù)和由此推斷的結(jié)構(gòu)結(jié)下A＇FAB MS/Z 453(M+1)結(jié)構(gòu)苯甲酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷(tetraazeicos)-1-基)-4-羥基 實施例3餾分A的細分離和其中結(jié)構(gòu)的確定將按照如實施例1描述所獲得的餾分A置于C-4多孔層實心球(10毫米×250毫米，300?？讖酱笮?，5微米顆粒尺寸)柱上，并使用4.0毫升/分的流速以及采用下列線性梯度程序的溶劑體系洗脫0％→10％B，100％→90％A〔0→30分鐘〕，此處A是0.1％含水三氟乙酸(TFA)，B是乙腈。使用Waters 990二極管系檢測器完成峰值檢測，并如同實施例1所述完成餾分收集，獲得如下兩種餾分餾分 洗脫時間A1約7分鐘A2約9分鐘為光譜分析，按標(biāo)準(zhǔn)方法通過冷凍干燥去洗脫液和隨后的冷凍干燥去水制備餾分A1和A2。
由餾分A1和A2所包括的化合物結(jié)構(gòu)即而通過使用FABMS確定。如此獲得的數(shù)據(jù)和由此推斷的結(jié)構(gòu)如下A1FAB MSM/Z 469(M+1)，高分辯率對于C23H45N6O計算為469.3863，誤差2.0mmμ，結(jié)構(gòu)苯甲酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基)-2，5-二羥基 A2FAB MSM/Z 449(M+1)，433，376，260，203。
結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺，N-(16-氨基-4-羥基-4，8，13-三氮雜十六烷-1-基)-4-羥基 實施例4餾分B的細分離和其中結(jié)構(gòu)的確定將按照實施例1描述所獲得的餾分B置于C-4多孔層實心球(22毫米×250毫米，300埃孔徑大小，10微米顆粒尺寸)柱上，并使用15毫升/分流速和采用下列非線性梯度程序的溶劑體系洗脫0％→0％B，100％→100％A〔0→5分鐘〕，然后0％→10％B，100％→90％A〔5→20分鐘〕(Waters曲線1)，然后10％→20％B，90％→80％A〔20→30分鐘〕(Waters曲線6)，然后，20％→50％B，80％→50％A〔30→40分鐘〕(Waters曲線11)，此處A是0.1％含水三氟乙酸(TFA)，B是乙腈。使用Waters 990二極管系檢測器完成峰值檢測，并如同實施例1所述完成餾分收集。獲得兩種餾分如下餾分洗脫時間B1約18.5分鐘B2約21.5分鐘為進行光譜分析，再按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過冷凍干燥去除洗脫液和隨后的冷凍干燥去除水制備該餾分。
由餾分B1所包括的化合物結(jié)構(gòu)通過使用FAB MS確定，其結(jié)結(jié)果如下FAB MSM/Z 506(M+1)，489，461，433，378，333，260，231，215，203，155，119。
高分辨率對C26H48N7O3計算為506、3810結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基)-4-羥基 由餾分B2所包括的化合物分子量通過使用FAB MS確定，其結(jié)果如下FAB MS高分辨率對于C27H48N6O3計算為505.3861實施例5由餾分E包括的化合物結(jié)構(gòu)如實施例1描述所得的餾分E，為進行光譜分析，按標(biāo)準(zhǔn)方法通過冷凍干燥去洗脫液和隨后的冷凍干燥去水而制備，由餾分E所包括的化合物結(jié)構(gòu)使用FAB MS，1H-NMR和13C-NMR確定。如此獲得的數(shù)據(jù)和由此推斷的結(jié)構(gòu)如下FAB MSM/Z490(M+1)，472，433，362，333，260，215，203，177，155，119高分辨率對于C26H48N7O2計算為490.3860，誤差0.6mmμ1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)10.89(s，1H)，8.90-7.85(m，6H)，7.55(d，J＝8.0Hz，1H)，7.34(d，J＝8.0Hz，1H)，7.19(s，1H)，7.08(dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，6.98(dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，3.50(s，2H)，3.13(m，2H)，3.03-2.82(m，18H)，1.88(m，6H)，1.78(m，2H)，1.62(m，4H)13C-NMR(125.76MHz，d6-DMSO)170.94，136.10，127.17，123.75，120.92，118.67，118.26，111.33，108.97，57.39，57.07，46.12，46.12，44.06，43.89，43.89，36.52，36.22，32.78，26.71，23.79，23.06，22.65，22.65，22.45結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基) 可供選擇并且較佳的是，采用如實施例1所述的方法分離完整毒液，只是所用的溶劑體系和線性梯度程序為0％→20％B，100％→80％A〔0→30分鐘〕，并于220毫微米波段進行峰值檢測。經(jīng)約26.0分鐘洗脫的餾分被置于Dynamax Phenyl柱上(4.6毫米×250毫米，60?？讖匠叽?，8微米顆粒尺寸)，并使用1毫升/分鐘流速和10％B，90％A的isocratic條件洗脫，此處的A和B如同實施如1所述。使用Waters 990二極管系檢測器(λ＝220毫微米)完成峰值檢測，如同實施例1所述收集各餾分。經(jīng)大約55.27分鐘洗脫的餾分按照標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)冷凍干燥去洗脫液和隨后的冷凍干燥去水，結(jié)果產(chǎn)出本例的化合物。
實施例6餾分G的細分離將按照實施例1描述所獲的餾分G置于C-18多孔層實心球(22毫米×250毫米，300?？讖酱笮?，10微米顆粒尺寸)，柱上，并使用10毫升/分流速和采用下列非線性梯度程序的溶劑體系洗脫20％→30％B，80％→70％A〔0→40分鐘〕(Waters曲線6)，并使用Waters 990二極管系檢測器如同實施例1所述收集各餾分。餾分G經(jīng)如上所述進行細分離后，以約22分鐘由柱上洗脫，再將包括多肽的那種餾分按照公知的方法通過冷凍干燥去洗脫液和隨后的冷凍干燥去水制備用來定序。
該餾分的烷基化多肽的氨基酸分析按照制造者的說明書使用Waters Pico-Tag法獲得，序列數(shù)據(jù)由一臺AppliedBiosystems 470A型蛋白質(zhì)/肽定序器(AppliedBiosystems，Inc.，850 Lincoln Center DriveFoster City，California 94404)收集，伴隨有含水TFA轉(zhuǎn)化。所得的苯基海硫因氨基酸的分析用AppliedBiosystems 120A型PTH分析儀在線完成，或用DupontZorbax PTH柱(Biomedical Product Department，Chromatography Products，E.I.dupont deNemours and Co.，Inc.，1007 Market Street，Wilmington，Delaware 19898)離線完成。
作為完整多肽的氨基酸分析和FAB MS的一個確定的結(jié)果，由餾分G包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列被確定為H2N-谷-賴-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-異亮-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-異亮-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-精-甘-亮-賴-賴-蘇-半胱-異亮-絲-賴-亮-絲-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-絲-；FAB MS7267實施例7餾分H的細分離和其中結(jié)構(gòu)的確定將如實施例1描述所得的餾分H置于C-18多孔層實心球(22毫米×250毫米，300?？讖酱笮?，10微米顆粒尺寸)柱上，并使用10毫升/分的流速和采用下列非線性梯度程序的溶劑體系洗脫20％→25％B，80％→75％A〔0→30分鐘〕(Waters曲線6)，然后25％→50％B，75％→50％A〔30→45分鐘〕(Waters曲線11)，此處A是0.1％TFA，B是乙腈，并使用Waters990二極管系檢測器，同時如實施例1所述收集各餾分。收集的各餾分中所關(guān)心的餾分是餾分 洗脫時間H2大約36分鐘H3大約41分鐘然后，按照實施例6所述的步驟制備用于定序的包括多肽的餾分H2和H3，并做定序。
餾分H2包括的多肽部分的氨基末端氨基酸序列被確定為H2N-丙-賴-丙-亮-脯-脯-甘-絲-纈-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-酪-甘-賴-色-組-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-苯丙-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-賴-甘-甲硫-賴-組-蘇-半胱-異亮-蘇-賴-亮-組-半胱-脯-天冬酰胺-賴-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-；該完整多肽的分子量由Ion Spray MS確定為7793。
實施例8餾分I和J的細分離及其中結(jié)構(gòu)的確定如實施例1中所述獲得的餾分I和J由于具有實施例1中所示的相同的洗脫時間而不能充分分離，故將其一起置于C-4多孔層實心球(22毫米×250毫米，300?？讖酱笮?，10微米顆粒尺寸)柱上，并使用10毫升/分的流速和采用下列非線性梯度程序的溶劑體系洗脫20％→30％B，80％→70％A〔0→30分鐘〕(Waters曲線6)，然后30％→50％B，70％→50％A〔30→45分鐘〕(Waters曲線11)，此處A是0.1％含水TFA，B是乙腈。按照實施例6所述步驟完成峰值檢測和餾分收集。收集的各餾分中所關(guān)心的餾分是餾分 洗脫時間I約22分鐘J約27.5分鐘按照實施例6所述步驟制備用于定序的包括多肽的餾分I和J并做定序。
餾分I包括的多肽的氨基酸序列和FAB MS被確定如下H2N-天冬-半胱-纈-甘-谷-絲-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-組-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-蘇-半胱-精-酪-苯丙-脯-賴-半胱-異亮-半胱-纈-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH2，F(xiàn)AB MS4158。
餾分J包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列和完整多肽的FAB MS確定如下H2N-天冬-谷-脯-半胱-異亮-脯-亮-甘-賴-絲-半胱-絲-色-賴-異亮-甘-蘇-脯-酪-半胱-半胱-脯-組-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-蘇-色-半胱-亮-纈-天冬-酪-絲-精-苯丙-纈-蘇-異亮-半胱-絲-甘-精-賴-酪-CONH2；FAB MS5506。
實施例9餾分L的細分離和其中結(jié)構(gòu)的確定將按照實施例1所述獲得的餾分L置于C-18多孔層實心球(10毫米×250毫米，300埃孔徑大小，5微米顆粒尺寸)柱上，并使用3.5毫升/分的流速和采用下列線性梯度程序的溶劑體系洗脫25％→40％B，75％→60％A〔0→30分鐘〕，此處A是0.1％含水TFA，B是乙腈。按照實施例6所述的步驟完成峰值檢測和餾分收集。在收集的餾分中所關(guān)心的餾分是餾分 洗脫時間L1約20.25分鐘L2約22.5分鐘按照實施例6所述的步驟制備用于定序的包括多肽的餾分L1和L2并做定序。
餾分L1包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列被確定如下H2N-異亮-纈-甘-甘-賴-蘇-丙-賴-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-纈-絲-異亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-賴-天冬酰胺-賴-賴-甘-甘-苯丙-天冬-完整多肽的分子量按照已如方法通過凝膠電泳確定，約為20000。
實施例10包括餾分M的化合物結(jié)構(gòu)的確定如實施例1所述獲得的并包括多肽的餾分M按照實施例6所述步驟做用于定序的制備，并做定序。
餾分M所包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列確定如下H2N-谷-丙-蘇-谷-丙-丙-賴-纈-亮-絲-天冬酰胺-亮-天冬-谷-蘇-纈-天冬-脯-完整多肽的分子量按照已知方法通過凝膠電泳確定，約為80000。
實施例111H-吲哚-3-乙酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基)確認由實施例4所述的餾分E所包括的標(biāo)題化合物的合成如下面所述完成。
在氮氣氛下，攪拌13.22克(0.15摩爾)二氨基丁烷和3.5毫升甲醇并通過注射泵加入9.94毫升(0.15摩爾)丙烯腈，時間超過兩小時，同時冷卻到0-5℃，在大約18小時之后，使用如下溶劑體系將該混合物在600克硅膠上進行色譜分離3∶1CH2Cl/MeOH(2升)繼而含5％體積異丙基胺的3∶1CH2Cl2/MeOH(2升)，將含偶合產(chǎn)物的各餾分在真空中蒸發(fā)濃縮并產(chǎn)出一種黃色的粘性油，核磁共振(NMR)分析檢證出該產(chǎn)物是上面結(jié)構(gòu)式(I)的偶合產(chǎn)物。

在氮氣氛下，將5.78克(0.041摩爾)上述A部分中制備的結(jié)構(gòu)式I的化合物加入75毫升CH3CN和11.48克KF硅藻土(Celite)中并攪拌。向攪拌的混合物中加入9.75克(0.041摩爾)按照制備A時所述步驟制備的結(jié)構(gòu)式為II的化合物于25毫升CH3CN中的溶液。該反應(yīng)被回流加熱并用薄層色譜法(TLC)(3∶1 CH2Cl2/MeOH)監(jiān)測。三小時之后，使該反應(yīng)冷卻并置于室溫下。然后將硅藻土過濾掉并用二氯甲烷充分洗滌濾餅。將濾液在真空中濃縮。包含在濃縮濾液中的粗產(chǎn)物在硅膠上色譜分離。使用2升3∶1 CH2Cl2/MeOH，然后2升3∶1CH2Cl2/MeOH和10毫升異丙基胺，再用2升3∶1CH2Cl2/MeOH和30毫升異丙基胺。在該柱被異丙基胺飽和之后由柱上洗脫該產(chǎn)物，但該產(chǎn)物還是不純的。將所有產(chǎn)物餾分合并并濃縮。用500克在CH2Cl2中的硅膠和125毫升異丙基胺調(diào)漿制成硅膠，然后以標(biāo)準(zhǔn)方法用其填充一個柱，使用二氯甲烷將上述粗產(chǎn)物置于柱上，接著以500毫升二氯甲烷和隨后的1升3∶1CH2Cl2/MeOH流過該柱。將產(chǎn)物餾分合并并在真空中濃縮。結(jié)果產(chǎn)出1.5克上面結(jié)構(gòu)式III的產(chǎn)物。另有2克結(jié)構(gòu)式III的產(chǎn)物使用1升3∶1 CH2Cl2/MeOH和30毫升異丙基苯胺由柱上洗脫。C.III+〔BOC〕2O→
在氮氣氛下，將3.5克(11.8毫摩爾)的如以上B部分所述而制備的結(jié)構(gòu)式III的化合物，以及150毫升二氯甲烷一起攪拌，并加入5.2克(23.6毫摩爾)的二-t-丁基碳酸氫酯。在室溫下攪拌該混合物約68小時。再將該混合物在真空中濃縮，并使用400克硅膠和60∶40己烷/乙酸乙酯溶劑進行色譜分離，結(jié)果產(chǎn)出5.62克結(jié)構(gòu)式為IV的油狀化合物。 在氮氣氛下，如上述C部分所述制備的結(jié)構(gòu)式為IV的化合物3.0克在250毫升帕爾瓶中溶于30毫升乙酸。向該溶液中加入3.0克Pd(OH)2/碳，并于50磅/吋2H2壓力下將該混合物氫化兩小時。經(jīng)過濾去除催化劑并將濾餅用乙酸良好洗滌。將濾液濃縮，再置于75毫升二氯甲烷中、用75毫升1N NaOH洗滌兩次并以K2CO3干燥。將該溶液在真空中濃縮，結(jié)果產(chǎn)生2.86克上面結(jié)構(gòu)式為V的產(chǎn)物。 在氮氣氛下，將如上面D部分所述制備的結(jié)構(gòu)式為V的化合物2.86克(5.7毫摩爾)溶于75毫升甲醇中。伴隨攪拌將0.41毫升(6.3毫摩爾)丙烯腈加入該混合物中，再攪拌該反該物一夜。然后將該反應(yīng)混合物濃縮，再濃縮三次去除30毫升二氯甲烷并在真空中去掉溶劑，結(jié)果產(chǎn)出3.18克結(jié)構(gòu)式為VI的油狀化合物。 在氮氣氛下，如上面E部分所述制備的結(jié)構(gòu)式為VI的化合物3.18克(5.7毫摩爾)與100毫升二氯甲烷合并并攪拌成溶液，向該溶液中加入1.37克(6.3毫摩爾)二-t-丁基碳酸氫酯，并在室溫下攪拌該反應(yīng)90分鐘，再將該反應(yīng)混合物濃縮并在300克硅膠上使用60∶40己烷/乙酸乙酯作為洗脫液進行色譜分離。將這些產(chǎn)物餾分合并、濃縮，用3×20毫升二氯甲烷萃取并在真空中除去溶劑，得到3.12克上述式VII的產(chǎn)物。 在上述D部分的步驟之后，將上述F部分所得到的3.12克(4.76毫摩爾)式VII化合物溶于30毫升乙酸中，并在55磅/吋2下有3.0克Pb(OH)2/C存在時氫化2小時，得到3.02克油狀的上所式VIII產(chǎn)物。 在氮氛下將1.0克(1.5毫摩爾)G部分所述制得的式VIII化合物溶于10毫升甲醇中。向該溶液加入0.1毫升(1.67毫摩爾)丙烯腈并將該反應(yīng)攪拌過夜。然后將該反應(yīng)混合物由20毫升二氯甲烷中濃縮，再濃縮三次并在真空中除去溶劑，得到1.0克上述式IX化合物I.X→ 在上述D部分的步驟之后，將1.0克(1.4毫摩爾)上述H部分制得的式IX化合物溶于30毫升乙酸中，并在50磅/吋2下氫化2.5小時，得到0.85克上述式X產(chǎn)物。 通過攪拌制得含有6.78克(20毫摩爾)硫酸四丁氫銨和75毫升水的溶液，并當(dāng)容許起泡時加入3.36克(40毫摩爾)NaHCO3。然后加入3.5克(20毫摩爾)吲哚乙酸，將混合物攪拌5分鐘并添加75毫升CHCl3。將混合物再攪拌5分鐘并使底部兩層分離。用Na2SO4鹽處理含水層并用CHCl3萃取，合并全部CHCl3萃取液并用Na2SO4干燥，將生成的純凈琥珀色溶液濃縮，用3×75毫升丙酮檢查并最后溶于75毫升丙酮中。然后添加1.9毫升(22毫摩爾)烯丙基溴并使該混合物保持30分鐘。然后將混合物濃縮并使用3∶1己烷/乙酸乙酯在硅膠上色譜分離，得到3.57克輕黃油狀的上式XI產(chǎn)物。 在Angew.Chem.Int.Ed.Engl.23∶298(1984)步驟之后，將2.15克(10毫摩爾)上述J部分制得的式XI化合物與20毫升乙腈合并，并向該混合物中添加2.61克(12毫摩爾)二-t-丁基碳酸氫酯。然后加0.122克(1毫摩爾)4-(N，N-二甲基一氨基)吡啶并使反應(yīng)進行15分鐘。然后用乙酸乙酯將混合物稀釋至125毫升，用稀HCl洗滌二次，25毫升水洗滌三次，鹽水洗滌一次，干燥并濃縮。使用14.5∶1己烷/乙酸乙酯作洗脫劑通過在硅膠上色譜分離將產(chǎn)物提純。得到2.87克無色油狀的上式XII化合物。 向3.27克(10.4毫摩爾)在20毫升二氯甲烷中的按上述K部分制得的式XII化合物添加7.4毫升2-乙基己酸鈉的乙酸乙酯溶液(0.231克/毫升)。然后加0.5克3P和0.5克(3P)4Pd并將混合物攪拌60分鐘。然后將該混合物濃縮，溶于150毫升乙酸乙酯中并以5×25毫升H2O洗滌。將含水萃取液合并并用1×25毫升乙酸乙酯和1×25毫升二乙醚反萃。向含水層添加75毫升新鮮乙酸乙酯，然后酸化至PH3。分離乙酸乙酯層并用1×50毫升新鮮乙酸乙酯萃取含水層。將兩次乙酸乙酯萃取液合并并用2×20毫升水，然后1×20毫升鹽水洗滌，再干燥、濃縮，用3×30毫升己烷檢查，在第二次檢查中生成結(jié)晶。用己烷將混合物稀釋至75毫升。將固體過濾，用己烷充分洗滌并在空氣中干燥，得到1.37克白色固體。核磁共振(NMR)證實了式XIII標(biāo)明的結(jié)構(gòu)。M.XIII+X→
在氮氣氛下，將200毫克(0.73毫摩爾)式XIII化合物與25毫升二氯甲烷、84毫克(0.73毫摩爾)N-羥基琥珀酰二胺和150毫克(0.73毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺混合，隨后幾乎立刻生成沉淀。將該混合物攪拌3小時。然后，將二環(huán)己基脲過濾出來，并向濾液中逐滴添加40毫升實施例11 A-I部分所述制得的式X化合物的二氯甲烷溶液。將混合物攪拌12小時，然后用0.1 NaOH洗滌并用K2′CO3干燥、濃縮并使用150克硅膠色譜分離，用9∶1二氯甲烷/甲烷(0.5升)淋洗以分離雜質(zhì)，而后用9∶1∶0.1二氯甲烷/甲醇/異丙胺洗脫。再將該產(chǎn)物濃縮，用二氯甲烷檢查并再次濃縮，得到400毫克由300兆赫核磁共振證實的式XIV化合物。N.XIV→ 在氮氣氛下，將0.34克(0.35毫摩爾)上述制得的式XIV化合物與30毫升丙酮混合，攪拌成溶液并在冰/丙酮浴中冷卻至約0℃。然后在8-10分鐘內(nèi)逐滴加入0.212克(1.05毫摩爾)85％3-氯過苯甲酸在20毫升丙酮中的溶液。使反應(yīng)攪拌30分鐘，然后用二乙醚稀釋至150毫升，并用2×25毫升10％K2CO3、2×25毫升H2O、2×25毫升10％K2CO3、2×25毫升水洗滌，用K2CO3干燥。將該混合物濃縮，用2×30毫升二氯甲烷檢查并在真空中濃縮至恒定重量0.33克。核磁共振分析表明，該產(chǎn)物是所需的式XV產(chǎn)物、原料和副產(chǎn)品的混合物。將該產(chǎn)品混合物加入3毫升在其中加有20毫克NaCNBH3的乙酸中。將該混合物攪拌過液，在真空中除去乙酸，溶于50毫升二氯甲烷中并用PH7的含水緩沖劑1×75毫升洗滌。如果需要，用1N NaOH將PH調(diào)至7，分離二氯甲烷層并使用PH7的含水緩沖劑1×50毫升，以及1×25毫升鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，在真空中濃縮至恒定重量0.31克。將生成的產(chǎn)物在100克硅膠上色譜分離，用95∶5乙酸乙酯/甲醇洗脫并收集25毫升餾分。提純的式XV產(chǎn)物洗下在餾分18-25中。將這些餾分合并、濃縮，用2×5毫升二氯甲烷檢查并在真空中濃縮成68毫克白色泡沫，將該泡沫在-80℃下貯存。也含有所需產(chǎn)物的餾分26-40還含有某些雜質(zhì)。將餾分26-40合并、濃縮、用二氯甲烷檢查并在真空中濃縮至恒定重量66毫克。將后面的產(chǎn)物與6毫克已用作核磁共振研究的前面的產(chǎn)物和按上述步驟制得的混合物合并。將生成的混合物在75克硅膠上色譜分離，用9∶5乙酸乙酯/甲醇洗脫并收集25毫升餾分。提純的式XV產(chǎn)物存在于餾分16-21中。將這些餾分合并、濃縮，用2×5毫升二氯甲烷檢查并在真空中濃縮至恒定重量46毫克，在-80℃下貯存。O.XV→ 在氮氣氛下，將108毫克(0.109毫摩爾)如上述制得的XV化合物溶于1.5毫升二氯甲烷中。然后，添加2毫升三氟乙酸并將混合物在室溫下攪拌1小時。然后將反應(yīng)混合物濃縮成薄膜并加15毫升二乙醚。該薄膜轉(zhuǎn)變成固體并在攪拌30分鐘以后得到白色粉末。將粉末過濾，用二乙醚充分洗滌，在氮中干燥，然后抽干至恒定重量為109克的本實施例的標(biāo)題化合物。
實施例121H-吲哚-3-乙酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17一四氮雜二十烷(tetraazeicos)-1-基)-4-羥基如下所述完成由實施例3所述餾分B1所包括的確定的標(biāo)題化合物的合成。

在氬氣氛下使用火焰干燥的玻璃器皿，將4.0克(30毫摩爾)4-羥基吲哚與25毫升Aldrich干燥的二甲基甲酰胺(DMF)混合并攪拌成溶液。然后添加1.44克(30毫摩爾)以50％油分散體形式的NaH。在起泡減退后，添加2.5毫升氯甲基甲基醚(Aldrich)并將生成的暗綠色溶液攪拌過夜。然后用乙酸乙酯將該溶液稀釋至125毫升，用5×25毫升H2O和1×25毫升鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并使用4∶1己烷/乙酸乙酯色譜分離。將含有該產(chǎn)物的餾分合并并濃縮，得到2.70克油狀XVII化合物。 在50毫升配有機械攪拌器和氮氣氛的三頸圓底燒瓶中冷卻1.3克含水甲醛(37％)和2.28克乙酸。然后添加3.23毫升冷卻的二甲基胺(25％水溶液)。使用約1.5-2.0毫升四氫呋喃作為轉(zhuǎn)移溶劑向該生成的冷卻溶液添加2.7克(15.2毫摩爾)式XVII化合物。將反應(yīng)加溫至室溫并攪拌過夜。然后添加40毫升10％NaOH，隨后生成沉淀。在攪拌后，將沉淀過濾，用水洗滌、空氣干燥，得到3.26克式XVIII化合物。 在氮氣氛下，將4.62克KCN和10毫升H2O混合并攪拌成溶液。然后添加30毫升乙醇和3.26克(14毫摩爾)式XVIII化合物，將該混合物攪拌并回流加熱約65小時。使反應(yīng)冷卻并濃縮。將生成的含式XX化合物的沉淀過濾，用水洗滌、空氣干燥。用4×15毫升二氯甲烷萃取含水層，保留有機萃取液。然后用50毫升乙酸乙酯復(fù)蓋含水層并酸化至PH2。將乙酸乙酯層分離，鼓氮氣泡通過乙酸乙酯層脫氣，干燥并濃縮成固體，用二異丙醚研制該固體得到1.03克灰白色固體形式的式XIX化合物。然后將所有來自堿性含水層中的萃取液合并、干燥、與來自上述的濾液混合并濃縮，得到0.4克固體形式的XX化合物。D.XX→XIX在氮氣氛下，將1.6克式XX化合物與75毫升乙醇、30毫升H2O和1.3克KOH混合。將該混合物回流加熱并攪拌過夜。然后將該反應(yīng)冷卻，用2×15毫升乙酸乙酯萃取，用新鮮乙酸乙酯復(fù)蓋并酸化至PH2。將合并的乙酸乙酯層干燥并濃縮。用異丙醚研制所得到的固體，得到1.1克式XIX化合物。 將1.44克(4.25毫摩爾)TBAHSO4溶于10毫升水中。然后添加714毫克(8.5毫摩爾)NaHCO3。在起泡消除后，添加1.0克(4.25毫摩爾)式XIX化合物并將混合物攪拌1分鐘，然后添加40毫升氯仿。反應(yīng)被攪拌5分鐘，分離氯仿層，然后用1×15毫升氯仿萃取含水混合物。將混合的氯仿萃取液干燥、濃縮并用2×30毫升丙酮檢查。然后將產(chǎn)物在氮氣氛下再溶于30毫升丙酮中，添加0.37毫升(4.25毫摩爾)烯丙基溴并攪拌該反應(yīng)2小時。將混合物濃縮并使用乙酸乙酯作洗脫劑色譜分離。將產(chǎn)物濃縮，得到1.1克油。將所有產(chǎn)物與25毫升二氯甲烷混合并添加0.98克(4.5毫摩爾)二-t-丁基碳酸氫酯及51毫克(0.425毫摩爾)4-(N，N-二甲氨基)吡啶。將反應(yīng)攪拌過夜。然后將該反應(yīng)混合物濃縮并用9∶1己烷/乙酸乙酯色譜分離，濃縮后得到1.33克粘油狀的式XXI化合物。 將64毫克(0.17毫摩爾)式XXI化合物溶于2毫升甲醇中。向該溶液添加1.7毫升0.1N NaOH，將得到的反應(yīng)混合物攪拌過夜。然后使反應(yīng)酸化，干燥，用乙酸乙酯萃取并濃縮。核磁共振分析表明，全部式XXI化合物的烯丙酯已被分離，但是發(fā)生某些基酯轉(zhuǎn)移并存在一些甲酯。為此將產(chǎn)物與剩余量的式XXI化合物(約1.26克)混合，溶于5毫升四氫呋喃中并冷卻至0℃。然后添加3.8毫升1N NaOH，在0℃下攪拌該反應(yīng)5分鐘。再加溫至室溫。反應(yīng)導(dǎo)至兩相，需要添加5毫升甲醇以消除該兩相。將該反應(yīng)攪拌過夜。然后除去四氫呋喃和甲醇。并用50毫升乙酸乙酯復(fù)蓋剩余的含水溶液并酸化至PH2。分離乙酸乙酯層，用1×20毫升H2O洗滌，再用鹽水洗滌一次，用Na2SO4干燥、過濾并濃縮成膠，該膠在用己烷研制時結(jié)晶，得到1.08克白色固體。用70∶30乙酸乙酯/己烷色譜分離該固體并將純凈的產(chǎn)物餾分合并、濃縮并由乙酸乙酯/己烷中結(jié)晶出，得到0.884克式XXII化合物。G。G.XXII+ 在氮氣氛中，將271毫克(0.81毫摩爾)式XXII化合物在攪拌下溶于4毫升無水四氫呋喃中。然后，添加93毫克(0.81毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺和167毫克(0.81毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺并將混合物攪拌。1小時50分鐘后，加入0.58克(0.8毫摩爾)按照實施例11步驟制得的溶于30毫升二氯甲烷中的式X化合物，并將該混合物攪拌一周(Over theweekend)。然后將二環(huán)己脲過濾出，用2×3毫升1N NaOH萃取該混合物，用K2CO3干燥并濃縮。然后將產(chǎn)物在100克硅膠上色譜分離，用9∶1二氯甲烷/甲醇洗脫所需產(chǎn)物外的一切化合物，然后用9∶10∶1二氯甲烷/甲醇/異丙胺洗脫該產(chǎn)物。將含有該產(chǎn)物的餾分濃縮，用二氯甲烷檢查若干次并除去溶劑，得到349毫克白色泡沫狀的式XXIII化合物。
可選擇地和較好的是，用0.165克(1.43毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺，隨后0.294克(1.43毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺處理50毫升含有0.480克(1.43毫摩爾)式XXII化合物的二氯甲烷溶液并使之?dāng)嚢?小時。將反應(yīng)混合物過濾，在20分鐘內(nèi)逐滴將含有粗羥基琥珀酰亞胺的濾液加入100毫升按實施例11所述步驟制得的1.03克(1.43毫摩爾)式X化合物的二氯甲烷溶液中。該反應(yīng)被攪拌72小時。然后用20毫升1NNaOH將粗反應(yīng)混合物洗滌兩次，用K2CO3干燥，過濾并濃縮。然后在硅膠上用4∶1二氯甲烷/甲醇，隨后用9∶1∶1二氯甲烷/甲醇/二異丙胺色譜分離該產(chǎn)物，得到912毫克式XXIII化合物。H.XXIII→ 在氮氣氛下，將吲哚基乙酰胺XXIII(900毫克，0.87毫摩爾)溶于40毫升二氯甲烷中。向該溶液添加2-(苯磺酰)-3-苯基氧化氮丙啶(Phenyloxaziridine)(500毫克，1.92毫摩爾)。通過薄層氣相色譜控制反應(yīng)的進程。1小時后，將反應(yīng)混合物在真空中濃縮，得到主要是粗氮羰基，將其溶于35毫升乙酸中，添加大過量氰氫硼化鈉(1.00克，15.9毫摩爾)并使反應(yīng)攪拌約2小時。將反應(yīng)在真空中濃縮，溶于二氯甲烷中(50毫升)，用PH7的緩沖液(1×50毫升)洗滌，用1NNaOH調(diào)節(jié)PH至7。再次用PH7的緩沖液(1×50毫升)洗滌有機層，用碳酸鉀干燥，在真空中濃縮，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，將該產(chǎn)物在硅膠上用95∶5乙酸乙酯/甲醇色譜分離，產(chǎn)出612毫克(67％)白色泡沫狀式XXIV的化合物。I.XXIV→ 通過交替抽真空和排吸氬三次，使3毫升三氟乙酸脫氣。然后將平底燒瓶包封在鋁箔中，并用約2.5毫升二氯甲烷作為轉(zhuǎn)移劑添加98毫克式XXIV化合物。45分鐘后，將混合物濃縮，得到一種油，該油在用二乙醚研制時，得到88毫克白色固體形式的式XXV化合物，在-80℃下貯存。
可選擇地以及較好的是，在1.5分鐘內(nèi)向用氬清洗過的100毫升飽和二惡烷-HCl溶液中加入0.520克(0.495毫摩爾)按上述H部分步驟制得的式XXIV化合物的10毫升二惡烷溶液。立即生成沉淀并使反應(yīng)攪拌1小時。然后加二乙醚，5分鐘后，將溶液過濾。用二乙醚洗滌所產(chǎn)生的固體，在氮氣氛下，然后在減壓下干燥，產(chǎn)生345毫克式XXIV＇的酸，可在-78℃下貯存。然后，向氬清洗過的含水溶液加入150毫克(0.205毫摩爾)式XXIV＇的酸。通過高效液體色譜控制該反應(yīng)。在約7小時后該反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物冷凍干燥，產(chǎn)出103毫克鹽酸鹽形式的XXV化合物。
實施例13苯甲酰胺，N-(20-氨基-4-羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基)-4-羥基如下所述完成由實施例2所述餾分A＇所包括的確定的標(biāo)題化合物的合成。 在400毫升燒杯中，將6.78克(20毫摩爾)硫酸四丁氫銨與60毫升水混合并攪拌成溶液。然后，當(dāng)容許起泡時，添加3.36克(40毫摩爾)NaHCO3，隨后加40毫升含2.76克(20毫摩爾)對羥基苯甲酸、0.8克NaOH和40毫升H2O的溶液。將反應(yīng)混合物攪拌5分鐘，然后添加200毫升二氯甲烷。將混合物再攪拌5分鐘并使各層分離。用50毫升二氯甲烷萃取含水層二次。將合并的二氯甲烷萃取液用Na2SO4干燥、濃縮，用75毫升丙酮檢查二次并再溶于50毫升丙酮中。然后添加1.9毫升(22毫摩爾)烯丙基溴并攪拌該混合物。然后將反應(yīng)混合物濃縮，溶于100毫升乙酸乙酯中，用30毫升H2O洗滌2次，用50毫升飽和碳酸氫鹽洗滌一次，用30毫升水洗滌一次，用鹽水洗滌一次，用水洗滌一次再用鹽水洗滌一次。將得到的產(chǎn)物干燥并濃縮，得到一種油。用50毫升石油醚將該油研制1小時。然后將該混合物過濾，用石油醚充分洗滌并空氣干燥，得到1.7克上述式XXVI化合物。 在氮氣氛下，將1.7克(9.55毫摩爾)如以上A部分所述制得的式XXVI化合物與50毫升Aldrich干燥二甲基甲酰胺混合并攪拌成溶液。然后添加0.38克(9.55毫摩爾)60％油分散體形式的NaH并使該反應(yīng)攪拌過夜。然后添加0.76毫升氯甲基·甲醚(Aldrich)，隨后立即生成沉淀。將該反應(yīng)混合物攪拌18小時。使反應(yīng)在200毫升乙酸乙酯/100毫升水中驟冷。分離乙酸乙酯層，用50毫升H2O洗滌三次，用50毫升1NNaOH洗滌1次，用50毫升水洗滌一次和用鹽水洗滌一次。將所得溶液干燥、濃縮并在硅膠上用4∶1己烷/乙酸乙酯色譜分離，得到1.63克上述式XXVII化合物。 將1.62克(7.3毫摩爾)如上B部分所述制得的式XXVII化合物溶于75毫升四氫呋喃中。然后添加含有0.4克(10毫摩爾)NaOH的15毫升水溶液，結(jié)果形成兩層。添加甲醇直至得到均勻混合物。然后將反應(yīng)攪拌過夜。在真空中除去四氫呋喃和甲醇并用15毫升乙酸乙酯萃取剩余的含水溶液二次。然后用50毫升新鮮乙酸乙酯復(fù)蓋該含水層并用6N HCl酸化至PH2.5。而后分離乙酸乙酯層，用10毫升H2O洗滌一次和用25毫升鹽水洗滌一次。將形成的溶液濃縮得到固體，該固體用己烷研制，過濾并真空干燥，得到1.2克上述式XXVIII化合物。D.X+XXVIII→
用0.081克(0.7毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺，隨之用0.144克(0.7毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺處理20毫升含有0.127克(0.7毫摩爾)以上C部分所述制得的式XXVIII化合物的二氯甲烷溶液，并將其攪拌4小時。然后將反應(yīng)混合物過濾，并將含有粗羥基琥珀酰亞胺的濾液在20分鐘內(nèi)逐滴加入80毫升含有0.50克(0.7毫摩爾)實施例11A-I部分所述步驟制得的式X化合物的二氯甲烷溶液中。然后攪拌該反應(yīng)數(shù)小時。再用1NNaOH(2×20毫升)洗滌該反應(yīng)混合物，用碳酸鉀干燥，過濾并濃縮。在硅膠上用9∶1二氯甲烷/甲醇，隨后用9∶1∶0.25二氯甲烷/甲醇/二異丙胺色譜分離該濃縮物，得到370毫克上述式XXXII化合物。E.XXXII→ 在氮氣氛下，將0.335克(0.38毫摩爾)按以上D部分所述步驟制得的式XXXII化合物溶于30毫升二氯甲烷中。將0.230克(0.88毫摩爾)2-(磺酰苯基)-3-苯基-氧化氮丙啶(oxaziridine)加入該溶液中。0.5小時后，使反應(yīng)在真空中濃縮并將該濃縮物溶于15毫升乙酸中。添加大過量氫氰硼化物(0.100克，1.6毫摩爾)，并攪拌該反應(yīng)2小時。然后將反應(yīng)在真空中濃縮，再溶于50毫升二氯甲烷中，用50毫升PH7的緩沖液洗滌一次，用1N NaOH調(diào)節(jié)至PH7。再用50毫升PH7的緩沖液洗滌有機層一次，用碳酸鈉干燥并在真空中濃縮。在硅膠上用50∶50丙酮/己烷色譜分離該濃縮物，得到253毫克上述式XXXIV化合物。F.(XXXIV)→ 在室溫氬氣氛下，將上面E部分所述制備的式XXXIV化合物和5毫升三氟乙酸混合。將該反應(yīng)攪拌1.5小時。補充加入2毫升三氟乙酸洗滌燒瓶壁。使該反應(yīng)另外再進行1.5小時。然后，該反應(yīng)在真空中濃縮，用乙醚研制，在氮氣氛下過濾并干燥以產(chǎn)出218毫克式XXXVI化合物，即本實施例標(biāo)題化合物。
實施例14苯甲酰胺，N-(20-氨基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基)-2，5-二羥基如下所述進行如實施例3所述餾分A1所包括的確定的標(biāo)題化合物的合成。 采用實施例12A部分所述的步驟，不同的是初始用3.08克(20毫摩爾)2，5-二羥基苯甲酸，產(chǎn)生3.0克上式XXIX化合物。 在氮氣氛下，將3.0克(15.5毫摩爾)的式XXIX化合物與50毫升Aldrich干燥DMF混合并攪拌成溶液。然后，加入1.24克(31毫摩爾)60％油分散劑形式的NaH并攪拌混合物。3小時后，加入2.5毫升(33毫摩爾)氯甲基甲醚并將該反應(yīng)攪拌18小時。然后將該反應(yīng)混合物加入到300毫升乙酸乙酯和100毫升水中。而后分離乙酸乙酯層并用75毫升水洗滌三次，用75毫升1N NaOH洗滌二次，用50毫升H2O洗滌二次和用鹽水洗滌一次。干燥并濃縮得到的溶液，產(chǎn)出2.9克油，該油用4∶1己烷/乙酸乙酯在硅膠上進行色譜分離，得到兩種餾分，其第二種餾分含有1.16克上式XXX化合物。 將1.16克(4.1毫摩爾)上式XXX化合物加入10毫升四氫呋喃中。然后，加入0.24克(6毫摩爾)NaOH的10毫升水溶液中，結(jié)果形成兩相。將甲醇加入該混合物中直至獲得單一相，然后攪拌該混合物18小時。然后將溶劑分離，剩余的水溶液用15毫升乙酸乙酯萃取二次。然后該水相層用35毫升新鮮乙酸乙酯覆蓋，并用6N HCl調(diào)節(jié)PH至2.5。隨后分離該乙酸乙酯層，用10毫升水洗滌一次，用鹽水洗滌一次，干燥并濃縮，產(chǎn)出1.0克油狀的上式XXXI化合物。D.
X+XXXI→D.X+XXXI→ 采用實施例13D部分所述的步驟，使用0.17克(0.7毫摩爾)如上面C部分所述制備的式XXXI化合物，0.081克(0.7毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺，0.144克(0.7毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺和0.5克(0.7毫摩爾)按實施例11中A-I部分所述步驟制備的式X化合物，經(jīng)色譜分離后，產(chǎn)出370毫克的上式XXXIII化合物。E.XXXIII→ 采用實施例13E部分所述的步驟，用0.308克(0.33毫摩爾)按以上D部分所述步驟制備的式XXXIII化合物和0.250克(0.96毫摩爾)2-(磺酰苯基)-3-苯基-氧化氮丙啶，用乙酸乙酯隨后用50∶50丙酮/己烷硅膠色譜分離后，產(chǎn)出210毫克上式XXXV化合物。F.
XXXV→ 采用實施例13F部分所述的步驟，用0.100克(0.104毫摩爾)按上述E部分所述步驟制備的式XXXV化合物，產(chǎn)出108毫克式XXXVII化合物，即本實施例的標(biāo)題化合物。
實施例151H-吲哚-3-乙酰胺，N-(16-氨基-4-羥基-4，8，13-三氮雜十六烷-1-基)-4-羥基如下所述進行實施例3所述的餾分A2所包括的確定的標(biāo)題化合物的合成。

采用實施例11D部分所述的步驟，用1.15克(2.07毫摩爾)如實施例11中A-E部分所述制備的式VI化合物，產(chǎn)出1.10克上式XXXVIII化合物。B.
XXXVIII+XXII→ 采用實施例12中G部分所述的可選擇的步驟，用含有0.228克(6.8毫摩爾)按上述實施例12的A-F部分所述制備的式XXII化合物的二氯甲烷溶液(15毫升)，0.380克(6.8毫摩爾)按上述A部分所述制備的式XXXVIII化合物，0.078克(6.8毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺和0.140克(6.8毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺，用9∶1二氯甲烷/甲醇隨后用9∶1∶0.5二氯甲烷/甲醇/二異丙胺硅膠色譜分離后，產(chǎn)出0.407克式XXXIX化合物。C.
XXXIX→
C.XXXIX→ 采用實施例12H部分所述的步驟，用0.350克(0.4毫摩爾)式XXXX化合物和0.230克(0.88毫摩爾)2-(磺酰苯基)-3-苯基-氧化氮丙啶，用50∶50丙酮/己烷硅膠色譜分離后，產(chǎn)出0.274克上述式XL化合物。該產(chǎn)物含有少量苯氨磺酰，因而用乙酸乙酯隨后用50∶50丙酮/己烷在硅膠上進一步提純。D.
XL→ 采用實施例12I部分的可選擇步驟，用0.166克(0.186毫摩爾)按上述C部分所述步驟制備的式XL化合物，經(jīng)二惡烷/HCl處理后得到粗酸。將該式XL＇酸溶于水中8小時，隨后通過冰凍干燥，產(chǎn)出88毫克式XLI化合物。
制劑A 在氮氣氛下，攪拌600毫升N，N-二甲基甲酰胺中的34.5克(157.6毫摩爾)3-溴丙胺氫溴酸鹽。向該溶液加入34.4克(157.6毫摩爾)二-t-碳酸氫丁酯并隨后加入32.3毫升(236毫摩爾)三乙胺。立即產(chǎn)生沉殿，反應(yīng)攪拌過夜然后將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋至1.5升，用500毫升1N HCl洗滌一次，用500毫升水洗滌三次，用鹽水洗滌一次并用Na2SO4干燥。濃縮后，產(chǎn)物用4∶1己烷/乙酸乙酯在800克硅膠上色譜分離，用薄層色譜法(KMnO4/I2)檢測餾分。將含有產(chǎn)物的餾分合并，在真空下濃縮，用50毫升二氯甲烷檢查二次并用高真空提純，產(chǎn)出25.8克本制劑產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種制備阻滯哺乳動物神系統(tǒng)細胞鈣通道的藥物組合物的方法，該方法包括將一種基本上純的多肽或它的一種可作藥用的鹽以可產(chǎn)生鈣通道阻滯作用的有效量與適量的一種可作藥用的稀釋劑或載體相混合，所說的一種基本上純的多肽是從如下的一組多肽中選出一種具有如下確定特征的多肽(I))存在于來自Agelenopsis aperta蜘蛛的粗毒液的一種液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，并用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A(0→30分鐘)然后20％→70％B，80％→30％A(30-55分鐘)的溶劑體系，其中A是0.1％TFA水溶液，B是乙腈，洗脫時間約為38分鐘；(b)存在于上述(a)所述液份的一種液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱，該柱體孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為10毫升/分鐘，并用非線性梯度程序為20％→30％B，80％→70％A(0→40分鐘)(waters曲線6)的溶劑體系，其中A為0.1％的TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為22分鐘；(c)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-谷-賴-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-異亮-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-異亮-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-精-甘-亮-賴-賴-蘇-半胱-異亮-絲-賴-亮-絲-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-絲-；以及(d)FAB MS7267；和所說的多肽(I)具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的一種多肽(II)該多肽(II)具有下式天冬-半胱-纈-甘-谷-絲-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-組-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-蘇-半胱-精-酪-苯丙-脯-賴-半胱-異亮-半胱-纈-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH2。和所說的多肽(II)具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的一種多肽(III)該多肽(III)具有如下確定特征(a)存在于來自Agelenopsis aperta蜘蛛的粗液的液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A(0→30分鐘)然后20％→70％B，80％→30％A(30-55分鐘)的溶劑體系，其中A是0.1％TFA水溶液，B是乙腈，洗脫時間約為39分鐘；(b)存在于上述(a)所述液份的一種液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱，該柱體孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為10毫升/分鐘，用非線性梯度程序為20％→25％B，80％→75％A(0→30分鐘)(wates曲線6)然后25％→50％B，75％→50％A，(30％→45分鐘)(Waters a曲線11)的溶劑體系，其中A為0.1％的TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為36分鐘；和(c)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-丙-賴-丙-亮-脯-脯-甘-絲-纈-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-酪-甘-賴-色-組-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-苯丙-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-賴-甘-甲硫-賴-組-蘇-半胱-異亮-蘇-賴-亮-組-半胱-脯-天冬酰胺-賴-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-；和(d)Ion-Spray MS7793；以及與所說多肽(III)具有基本相同氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的一種多肽(IV)該多肽(IV)具有下式H2H-天冬-谷-脯-半胱-異亮-脯-亮-甘-賴-絲-半胱-絲-色-賴-異亮-甘-蘇-脯-酪-半胱-半胱-脯-組-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-蘇-色-半胱-亮-纈-天冬-酪-絲-精-苯丙-纈-蘇-異亮-半胱-絲-甘-精-賴-酪-CONH2；和所說的多肽(IV)具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的一種多(V)，該多肽(V)具有如下確定特征(a)存在于來自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A(0→30分鐘)然后20％→70％B，80％→30％A(30-55分鐘)的溶劑體系，其中A是0.1％TFA水溶液，B是乙腈，洗脫時間約為43分鐘；(b)存在于上述(a)所述液份的一種液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米，該柱體孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為5μ，洗脫所用流速為3.5毫升/分鐘，用線性梯度程序為25％→40％B，75％→60％A(0→30分鐘)的溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為20.35分鐘。(c)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-異亮-纈-甘-甘-賴-蘇-丙-賴-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-纈-絲-異亮-谷-谷-賴-天冬酰胺-賴-賴-甘-甘-苯丙-天冬-；和(d)分子量約為20000；以及與所說的多肽(V)具有基本相同氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的一種多肽(VI)，該多肽(VI)具有如下確定特征(a)存在于來自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A(0→30分鐘)然后20％→70％B，80％→30％A(30-55分鐘)的溶劑體系，其中A是0.1％TFA水溶液，B是乙腈，洗脫時間約為43分鐘；(b)存在于上述(a)所述液份的一種液份中，該液份洗離自C-18Vydac10毫米×250毫米的柱，該柱體孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為5μ，洗脫所用流速為3.5毫升/分鐘并使用線性梯度程序為25％→40％B，75％→60％A(0→30分鐘)的溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為22.5分鐘；以及與所說的多肽(VI)具有基本相同氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的一種多肽(VII)，該多肽(VII)具有如下確定特征(a)存在于來自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的液份中，該液份洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A(0→30分鐘)然后20％→70％B，80％→30％A(30-55分鐘)的溶劑體系，其中A是0.1％TFA水溶液，B是乙腈，洗脫時間約為48.3分鐘；(b)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-谷-丙-蘇-谷-丙-丙-賴-纈-亮-絲-天冬酰胺-亮-天冬-谷-蘇-纈-天冬-脯-；和(c)分子量為80000以及與所說的多肽(VII)具有基本相同氨基酸序列和基本相同的鈣通道阻滯活性的多肽，
2.一種制備在哺乳動物細胞中阻滯鈣通道的藥物組合物的方法，該方法包括將一種基本上純的多肽或它的一種可作藥用的鹽以可產(chǎn)生鈣通道阻滯作用的有效量與適量的一種可作藥用的稀釋劑或載體相混合，其中所述的一種基本上純的多肽是從根據(jù)權(quán)利要求1中所應(yīng)用的如下一組多肽中選出一種具有如下確定特征的多肽(a)存在于來自Agelenopsis Aperta蜘蛛粗毒液的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A
然后20％→70％B，80％→30％A[30→55分鐘]溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為38分鐘；(b)存在于上述(a)所述餾分的餾分中，餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為10毫升/分鐘，用非線性梯度程序為20％→30％B，80％→70％A
(Waters曲線6)的溶劑體系，其中，A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為22分鐘；(c)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-谷-賴-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-異亮-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-異亮-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-精-甘-亮-賴-賴-蘇-半胱-異亮-絲-賴-亮-絲-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-絲-；和(d)FAB MS7267；一種具有如下通式的多肽天冬-半胱-纈-甘-谷-絲-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-組-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-蘇-半胱-精-酪-苯丙-脯-賴-半胱-異亮-半胱-纈-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH2，一種具有如下確定特征的多肽(a)存在于來自Agelenopsis Aperta蜘蛛粗毒液的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A
然后20％→70％B，80％→30％A[30→55分鐘]溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為39分鐘；(b)存在于上述(a)所述餾分的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為10毫升/分鐘，用非線性梯度程序為20％→25％B，80％→75％A
(Waters曲線6)然后25％→50％B，75％→50％A[30→45％分鐘](Waters曲線11)的溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約方36分鐘；和(c)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-丙-賴-丙-亮-脯-脯-甘-絲-纈-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-絲-天冬-半胱-賴-半胱-酪-甘-賴-色-組-賴-半胱-精-半胱-脯-色-賴-色-組-苯丙-蘇-甘-谷-甘-脯-半胱-蘇-半胱-谷-賴-甘-甲硫-賴-組-蘇-半胱-異亮-蘇-賴-亮-組-半胱-脯-天冬酰胺-賴-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-；和(d)Ion-Spray MS7793，一種如下通式的多肽H2N-天冬-谷-脯-半胱-異亮-脯-亮-甘-賴-絲-半胱-絲-色-賴-異亮-甘-蘇-脯-酪-半胱-半胱-脯-組-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-蘇-色-半胱-亮-纈-天冬-酪-絲-精-苯丙-纈-蘇-異亮-半胱-絲-甘-精-賴-酪-CONH2，一種具有如下確定特征的多肽(a)存在于來自Agelenopsis Aperta蜘蛛粗毒液的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A
然后20％→70％B，80％→30％A[30→55分鐘]溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為43分鐘；(b)存在于上述(a)所述餾分的餾分中，該餾分洗離自C-18 Vydac22毫米×250毫米的柱體該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為5μ，洗脫所用流速為3.5毫升/分鐘，用非線性梯度程序為25％→40％B，75％→60％A
的溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為20.25分鐘；(c)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-異亮-纈-甘-甘-賴-蘇-丙-賴-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-纈-絲-異亮-谷-谷-賴-天冬酰胺-賴-賴-甘-甘-苯丙-天冬-；和(d)分子量約為20000，一種具有如下確定特征的多肽(a)存在于來自Agelenopsis Aperta蜘蛛粗毒液的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A
然后20％→70％B，80％→30％A[30→55分鐘]溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為43分鐘；(b)存在于上述(a)所述餾分的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac10毫米×250毫米的柱體，該柱體孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為5μ，所用洗脫流速為3.5毫升/分鐘，用線性梯度程序為25％→40％B，70％→60％A
的溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為22.5分鐘；一種具有如下確定特征的多肽(a)存在于來自Agelenopsis Aperta蜘蛛粗毒液的餾分中，該餾分洗離自C-18Vydac22毫米×250毫米的柱體，該柱體的孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，用線性梯度程序為5％→20％B，95％→80％A
然后20％→70％B，80％→30％A[30→55分鐘]的溶劑體系，其中A為0.1％TFA水溶液，B為乙腈，洗脫時間約為48.3分鐘；(b)一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-谷-丙-蘇-谷-丙-丙-賴-纈-亮-絲-天冬酰胺-亮-天冬-谷-蘇-纈-天冬-脯；和(c)分子量約為80000，
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中的活性成分-所述的基本上純的多肽及其可作藥物應(yīng)用的鹽的制備方法的特征在于(a)當(dāng)所需的化合物是基本上純的多肽(I)時，將Agelenopsis aperta全毒液從一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300以及顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱上洗脫，洗脫所用流速為15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％A的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)然后20％→70％乙腈，80％→30％0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的線性梯度程序以及單色峰在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)，收集38分鐘的液份并將其放置于一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，以及顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱上，應(yīng)用流速為10毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用20％→30％乙腈，80％→70％的0.1含水三氟乙酸(0→40分鐘)(Waters曲線6)的非線性梯度程序和峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)進行洗脫，收集22分鐘洗脫出的洗脫液，并任意選擇地冷凍干燥，再懸浮在水中以及冷凍干燥；(b)當(dāng)所需的化合物是基本上純的多肽(II)時，將Agelenopsis aperta全毒液在一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300以及顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱上進行洗脫，所應(yīng)用的流速是15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)是應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)，然后20％→70％乙腈，80％→30％的0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的線性梯度程序以及單色峰檢測在220-230毫微米，收集40分鐘的液份并將其放置于一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300以及顆粒尺寸為10μ的C-4Vydac柱上并應(yīng)用流速為10毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用20％→30％乙腈，80％→70％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)(Waters曲線6)，然后30％-50$乙腈，70％-50％的0.1含水三氟乙酸(30→45分鐘)(Waters曲線11)的非線性梯度程序和峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)進行洗脫，收集22分鐘洗脫出的洗脫液，并任意選擇地冷凍干燥，再懸浮于水中和冷凍干燥；(c)當(dāng)所需的化合物基本上純的多肽(III)時，將Agelenopsis aperta毒素在一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱上進行洗脫，所應(yīng)用的流速是15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)，然后20％→70％乙腈，80％→30％的0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的線性梯度程序以及單色峰檢測在220-230毫微米，收集39分鐘洗脫出的液份并將放置于一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300以及顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱上，并以流速為10毫升/分鐘進行洗脫，所應(yīng)用的溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用20％→25％乙腈，80％→75％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)(Waters曲線6)，然后25％-50％乙腈，75％-50％的0.1含水三氟乙酸(30→45分鐘)(Waters曲線11)的非線性梯度程序以及峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)，收集36分鐘洗脫出的液份，并任意選擇地冷凍干燥，再懸浮于水中以及冷凍干燥；(d)當(dāng)所需要的化合物是基本上純的多肽(IV)時，從一支22毫米250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱上進行洗脫Agelenopsis aperta的全毒液，所應(yīng)用的流速為15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)，然后20％→70％乙腈，80％→30％的0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的線性梯度程序以及單色峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)，收集40分鐘洗脫出的液份并放置于一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300和顆粒尺寸為10μ的C-4Vydac柱上，并以10毫升/分鐘洗脫，所應(yīng)用的溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用20％→30％乙腈，80％→70％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)(Waters曲線6)，然后30％-50％乙腈，70％-50％的0.1含水三氟乙酸(30→45分鐘)(Waters曲線11)的非線性梯度程序以及峰檢測在220-230毫微米，收集27.5分鐘洗脫出的液份，并任意選擇地冷凍干燥，再懸浮于水中和冷凍干燥；(e)當(dāng)所需要的化合物是基本上純的多肽(V)時，從一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱洗脫Agelenopsis aperta的全毒液，所應(yīng)用的流速為15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)是應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)，然后20％→70％乙腈，80％→30％的0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的一種線性梯度程序以及單色峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑體系，收集43分鐘洗脫出的液份，將該液份放置于一支10毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為5μ的C-18Vydac柱上，應(yīng)用流速為3.5毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用線性梯度程序25％→40％乙腈，75％→60％的0.1三氟乙酸水溶液(0→30分鐘)以及峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)進行洗脫，收集20.25分鐘洗脫的液份，以及任意選擇地冷凍干燥，再懸浮于水中和冷凍干燥；(f)當(dāng)所需要的化合物是基本上純的多肽(VI)時，從一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸是300，顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱洗脫Agelenopsis aperta的全毒液，應(yīng)用的流速是15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)是應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)然后20％→70％乙腈，80％→30％的0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的一種線性梯度程序以及單色峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑體系統(tǒng)，收集43分鐘洗提出的液份，將該液份放置于一支10毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為5μ的C-18Vydac柱上，應(yīng)用流速為3.5毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)為應(yīng)用線性梯度程序25％→40％乙腈，75％→60％的0.1三氟乙酸水溶液(0→30分鐘)以及峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)進行洗脫，收集22.5分鐘洗脫出的液份，以及任意選擇地冷凍干燥，再懸浮于水中和冷凍干燥；(g)當(dāng)所需要的化合物是基本上純的多肽(VII)時，從一支22毫米×250毫米，孔隙尺寸為300，顆粒尺寸為10μ的C-18Vydac柱洗脫Agelenopsis aperta的全毒液，所應(yīng)用的流速是15毫升/分鐘，溶劑系統(tǒng)是應(yīng)用5％→20％乙腈，95％→80％的0.1含水三氟乙酸(0→30分鐘)然后20％→70％三氟乙酸，80％→30％的0.1含水三氟乙酸(30-55分鐘)的一種線性梯度程序以及單色峰檢測在220-230毫微米的一種溶劑系統(tǒng)，收集48.3分鐘洗提出的液份，任意選擇地冷凍干燥，再懸浮于水中和冷凍干燥；或者，另一選擇的方法是用本身已知的方法合成任何一種上述的多肽；以及當(dāng)所需的多肽是具有其氨基酸順序與任何一種上述多肽的氨基酸順序基本上相同的氨基酸順序時，可通過本身已知的方法合成這種多肽或這些多肽；以及可以通過本身已知的方法任意選擇地將這些多肽轉(zhuǎn)化成它們的可作藥用的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及某種被發(fā)現(xiàn)存在于
文檔編號A61K31/404GK1136960SQ9610178
公開日1996年12月4日 申請日期1996年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月28日
發(fā)明者N·A·薩科曼諾, R·A·沃爾克曼 申請人:美國輝瑞有限公司, 自然產(chǎn)品科學(xué)有限公司