專利名稱:茶黃素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種茶黃素的新的藥物用途，特別涉及其在制備預(yù)防或治療高血脂癥的保健品或藥品中的應(yīng)用。
發(fā)明背景高脂血癥是指血清中總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白-膽固醇水平單項(xiàng)或多項(xiàng)超過正常值范圍，是心血管類疾病的首要的病因，是當(dāng)今社會(huì)的常見病。高脂血癥易產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化，其結(jié)果是導(dǎo)致高血壓、冠心病、中風(fēng)、腎衰等臨床疾病。高脂血癥的發(fā)生與飲食、遺傳、環(huán)境、生活方式密切相關(guān)，有效降低血清總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白-膽固醇水平可顯著降低冠心病的發(fā)生率和死亡率。目前臨床上化學(xué)類降脂藥主要有他汀、貝特、樹脂、丙丁酚等幾大類，它們均存在一定的缺陷，特別是安全性差，2001年西立伐他汀因使用者發(fā)生橫紋肌溶解致死而撤下市場(chǎng)，其它一些他汀類藥物也存在同樣的問題；市場(chǎng)上使用的天然調(diào)酯藥品大部分有效成分復(fù)雜而未知，保健品中大部分降脂產(chǎn)品的療效沒有經(jīng)過科學(xué)而嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)如進(jìn)行雙盲、安慰劑平行對(duì)照的科學(xué)試驗(yàn)證實(shí)。因此人們一直有興趣尋找一種安全而有效的調(diào)脂新藥。
茶葉是用Camellia sinensis的葉子干制而成，是人們的常見飲品，每年有30億噸的茶葉被人們生產(chǎn)和消耗掉。國(guó)際上有關(guān)茶葉與健康的研究很多，主要集中在腫瘤和心血管方面，有報(bào)道茶葉具有降血脂的作用，受試產(chǎn)品是綠茶、紅茶、烏龍茶或茶多酚，如1986年日本keiichiro等報(bào)道了茶葉中兒茶素對(duì)高膽固醇伺養(yǎng)的SD大鼠具有降血脂的功能，市場(chǎng)上已有茶多酚的降酯產(chǎn)品，如“心腦健”，但因茶多酚的降酯效果不明顯，需添加其它中藥成分增強(qiáng)其療效。
有關(guān)茶葉提取物的研究主要集中在茶多酚上，茶黃素單體的研究相比較少，有報(bào)導(dǎo)茶黃素單體具有抗氧化和抗腫瘤作用，未見其作為降血脂的用途報(bào)道，孫劉根申請(qǐng)的有關(guān)茶色素的生產(chǎn)方法及藥物用途的中國(guó)專利和WO專利(CN 93110413，WO 9908674等)所保護(hù)的茶色素為茶褐素、茶紅素和茶黃素的混合物，其茶黃素的含量?jī)H為1-3％，其它主要是茶褐素和茶紅素，但它們均為高聚物，化學(xué)結(jié)構(gòu)未知，尚不能對(duì)茶褐素和茶紅素精確定量，江西綠色工業(yè)集團(tuán)根據(jù)此專利生產(chǎn)的茶色素膠囊也已在市場(chǎng)上銷售，提到此混合物具有降血脂的功效，但還不清楚茶色素中明確具有降血脂的成分，而且服用劑量大，一日為375mg～1125mg。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種茶黃素在制備預(yù)防或治療高血脂癥的保健品或藥品中的應(yīng)用。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的茶黃素的調(diào)脂作用，特別是其降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三脂水平的作用，較其它茶提物如兒茶素的作用強(qiáng)。通過嚴(yán)格規(guī)范的雙盲、安慰劑平行對(duì)照、多中心臨床試驗(yàn)，也證實(shí)了本發(fā)明提供的茶黃素產(chǎn)品對(duì)高血脂病人的降脂作用，并且具有高度的耐受性和安全性。
本發(fā)明提供的茶黃素的通式如下 其中R1為H或G；R2為H或G；G為 茶黃素(theaflavins，TFs)的特征是含有茶黃素(Theaflavin，TFl，當(dāng)R1為H，R2為H時(shí))，茶黃素-3-單沒食子酸脂(theaflavin-3-gallate，TF2A，當(dāng)R1為G，R2為H時(shí))，茶黃素-3’-單沒食子酸脂(theaflavin-3’-gallate，TF2B當(dāng)R1為H，R2為G時(shí))，茶黃素-3，3’-雙沒食子酸脂(theaflavin-3.3’-digallate，TF3，當(dāng)R1為G，R2為G時(shí))四個(gè)單體中的一種或它們的任意組合，它們可表現(xiàn)出降血脂的活性，可以用于治療高脂血癥。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所指的茶黃素是由成對(duì)的兒茶素氧化聚合而成，存在二羥基苯駢酚酮結(jié)構(gòu)(1’，2’-二羥基-3，4-苯駢卓酚酮)，尤其指茶黃素(Theaflavin，TF1)，茶黃素-3-單沒食子酸脂(theaflavin-3-gallate，TF2A)，茶黃素-3’-單沒食子酸脂(theaflavin-3’-gallate，TF2B)，茶黃素-3，3’-雙沒食子酸脂(theaflavin-3.3’-digallate，TF3)四個(gè)單體中的一種或它們的任意組合，其水溶液色橙黃，提純結(jié)晶后為色澤金黃的結(jié)晶狀粉末，在水中重結(jié)晶得橙黃色針狀晶體，熔點(diǎn)237～240℃(分解)，易溶于熱水、乙酸乙脂、正丁醇、異丁基甲酮、甲醇等，溶液顯很弱的酸性，在堿性溶液中有自動(dòng)氧化的傾向，并隨PH值的增加而加強(qiáng)。
茶黃素在紅茶中的含量最高，是紅茶茶湯的主要黃色色素，是衡量紅茶品質(zhì)的主要指標(biāo)，紅茶的茶黃素的含量一般為0.3％～1.5％，高的可達(dá)1.7％以上，但從紅茶直接提取茶黃素的方法得率低，成本高，不適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，本發(fā)明提供了茶黃素工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵利用多酚氧化酶的酶促反應(yīng)，并模擬紅茶的發(fā)酵工藝將作為反應(yīng)底物的游離的兒茶素單體或鮮綠茶葉中的兒茶素氧化催化為茶黃素；粗純化通過離心和過濾將發(fā)酵液固液分離，液相用有機(jī)溶劑萃取，并用堿洗1～3次，有機(jī)相通過減壓濃縮至干浸膏備用；純化將步驟2得到的干浸膏用硅膠柱分離，用不同濃度的乙酸乙脂溶液進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)峰經(jīng)濃縮干燥后即可得目標(biāo)產(chǎn)物。
本發(fā)明利用了生物酶將反應(yīng)底物氧化催化，將兒茶素聚合為茶黃素，通過分離、純化得到茶黃素單體。藥理試驗(yàn)證實(shí)茶黃素對(duì)哺乳動(dòng)物有降血脂的活性。降血脂的活性是指哺乳動(dòng)物使用茶黃素后血脂水平下降，并且血脂下降水平與茶黃素給與的量成一定的量效關(guān)系。
按照本發(fā)明，在應(yīng)用此化合物或活性成分時(shí)，可通過任何一種的給藥劑型給予哺乳動(dòng)物作為預(yù)防和/或治療高脂血癥用，在制備成制劑過程中，將茶黃素作為主要活性成分，可加入賦形劑、防腐劑、粘合劑、矯味劑、崩結(jié)劑、潤(rùn)滑劑、溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑等敷料混合，制成一種適于臨床使用的劑型，如制成口服、注射等劑型(其中口服軟膠囊為首選)，用于藥品、保健藥品、保健食品和食品添加劑等領(lǐng)域。按照本發(fā)明還可將茶黃素與其它降血脂藥聯(lián)合使用或制備成復(fù)方制劑。茶黃素的給藥劑量必須根據(jù)給藥途徑確定，一般成人(以70kg計(jì))的每天給藥劑量為50～500mg(通常在50～200mg之間)。
本發(fā)明制備的茶黃素的藥品、保健藥品、保健食品和食品副作用遠(yuǎn)小于西立伐他汀等化學(xué)藥物，可長(zhǎng)期使用，作為預(yù)防和/或治療高脂血癥與其相關(guān)的其它心血管疾病，如動(dòng)脈粥狀硬化、冠心病等。
下面的例子作為例舉而不是為了限制。
實(shí)施例1取茶多酚100公斤(含兒茶素98.6％，EGCG45.2％)投入多功能提取罐中，加入1000升PH6.4的磷酸鹽緩沖液，加入10公斤的多酚氧化酶(發(fā)明人自己制備，從蘋果中提取)，加熱到35.2℃，通氧，以10rpm速度攪拌，發(fā)應(yīng)40分鐘后，通入飽和水蒸氣終止反應(yīng)，將發(fā)酵液放入離心機(jī)離心，將上清液板材過濾，濾液以一比一的體積加入乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?，然后離心取上清液酯層，用等體積5.0％Na2CO3溶液洗脫三次，離心取酯層減壓回收乙酸乙酯并濃縮至浸膏，取浸膏適量用硅膠柱分離，用40％的乙酸乙酯溶液洗脫，收集不同時(shí)間的峰濃縮后用無水乙醇多次重結(jié)晶，即可得到茶黃素、茶黃素-3-單沒食子酸脂、茶黃素-3’-單沒食子酸脂、 茶黃素-3，3’-雙沒食子酸脂單體，純度分別為99.1％、98.7％、97.8％，99.3％，并經(jīng)HPLC-MS連用確證其具體結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2取新鮮綠茶100公斤搗碎后投入多功能提取罐中，加入1000升PH6.4的磷酸鹽緩沖液，加熱到30℃，通氧，以10rpm速度攪拌，發(fā)應(yīng)60分鐘后，通入飽和水蒸氣終止反應(yīng)，將發(fā)酵液放入離心機(jī)離心，將上清液板材過濾，濾液以一比一的體積加入乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?，然后離心取上清液酯層，用等體積5.0％Na2CO3溶液洗脫三次，離心取酯層減壓回收乙酸乙酯并濃縮至浸膏，取浸膏適量用硅膠柱分離，用40％的乙酸乙酯溶液洗脫，收集某一時(shí)段的峰濃縮后真空干燥后，即可得到99.3％茶黃素，含茶黃素46.8％、茶黃素-3-單沒食子酸脂18.5％.、茶黃素-3’-單沒子酸脂13.7％、茶黃素-3，3’-雙沒食子酸脂20.3％。
實(shí)施例3 茶黃素軟膠囊的制備取2kg蜂蠟加入到油溫80℃的橄欖油500kg中，攪拌均勻后，冷至40℃，將100kg的99.3％茶黃素混懸其中，攪拌均勻，使用加入鈦粉的囊材，經(jīng)擠壓機(jī)制備軟膠囊，每粒內(nèi)容物裝量700mg，含茶黃素75mg。
實(shí)施例4本發(fā)明茶黃素對(duì)大鼠血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三脂(TG)和高密度脂蛋白(HDL-C)的影響。
將雄性SD大鼠90只，體重為100-130克，分籠飼養(yǎng)于恒溫室內(nèi)，房間的溫度為22-24℃。同時(shí)，把90只大鼠隨機(jī)分成9組，每組10只，分別喂給不同的飼料和固定量的水，其中TFl-1，TFl-2，TFl-3組分別給予茶黃素TF1純品1mg/kg/d、2mg/kg/d、4mg/kg/d，TF2A-2，TF2B-2和TF3-2組分別給予茶黃素純品TF2A、TF2B和TF3各2mg/kg/d。CA-1和CA-2組分別給予兒茶素1mg/kg/d、2mg/kg/d，飼料配方見表1。
表1 實(shí)驗(yàn)用大鼠飲食配方


將上述飼料連續(xù)喂養(yǎng)大鼠8周，末次給藥前禁食12小時(shí)，給藥后1小時(shí)采血測(cè)定各項(xiàng)血脂。結(jié)果見表2表2 本發(fā)明茶黃素純品對(duì)大鼠血脂(mg/dL)的影響(
X±SD)


1P＜0.01，與control組比較2P＜0.05，與control組比較3與control組比較無顯著性差異結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，本發(fā)明茶黃素純品對(duì)吃高脂飼料的大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三脂水平有明顯下降，并且下降幅度大于服用兒茶素產(chǎn)品的大鼠。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明茶黃素純品的服用劑量與血脂的下降呈現(xiàn)量效關(guān)系。
實(shí)施例5通過臨床研究，評(píng)價(jià)CholeveTM(CholeveTM表示從實(shí)施例2獲得的產(chǎn)品，每粒含茶黃素70mg)對(duì)血LDL-C水平在3.36mmol/L-4.91mmol/L之間的受試者的血脂譜的作用。
本臨床實(shí)驗(yàn)為安慰劑作對(duì)照的，雙盲、隨機(jī)多中心臨床試驗(yàn)，受試者每天服用CholeveTM(每粒含茶黃素70mg)1粒，周期為12周。
該臨床實(shí)驗(yàn)的入選受試者必須是十八歲以上的男女；在0周，空腹情況下，130mg/dL≤LDL-C≤190mg/dL，TG≤350mg/dL；每日能量來源中脂肪所占比例≤32％；體重指數(shù)(BMI)＜35。同時(shí)，入選的受試者不得具有以下任意一項(xiàng)或幾項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)在放松靜坐狀況下測(cè)得的血壓(收縮壓≥160mmHg或舒張壓≥95mmHg；臨床表現(xiàn)出前期動(dòng)脈粥樣硬化需要藥物治療；慢性疾病，包括肺、肝、腎、內(nèi)分泌、血液或胃的異常；正在服用心血管類藥物，如Aspirin一類藥物者。當(dāng)前周期性的使用荷爾蒙(HRT)，包括口服避孕藥(注非循環(huán)HRT是允許的)；已被診斷患有惡性疾病或出現(xiàn)任何明顯惡性疾病前兆；在篩選訪問前4周內(nèi)使用過降脂藥物或保健食品，其中包括魚油，煙酸或其他類似物劑量＞400mg/天，高纖維保健品，HMGCoA還原酶抑制劑。入選的受試者并要求在試驗(yàn)期間不得改變飲食習(xí)慣。
入選符合以上要求的受試者240例，并隨機(jī)進(jìn)入用藥組和安慰劑組。隨機(jī)化入選后，受試者需在服藥后4周、8周和12周到醫(yī)院檢查。血脂測(cè)定必須在禁食12小時(shí)后前臂肘靜脈抽血，酶法測(cè)定血清TC、HDL-C、TG，LDL-C采用去處non-LDL-C后直接測(cè)定，以上指標(biāo)均在BECKMAN SYNCHRONLX20全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定。血小板聚集率采用ADP誘導(dǎo)比濁法測(cè)定，分析記錄1分鐘及最大的血小板聚集率，在上海通用技術(shù)研究所的TYXN96型血小板聚集儀上測(cè)定。其它肝、腎功能等生化指標(biāo)均在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定，血細(xì)胞計(jì)數(shù)在自動(dòng)計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行。另外，還需要進(jìn)行受試者的血壓、心率、體重等常規(guī)檢查，以及收集連續(xù)3天的飲食日記。
整個(gè)臨床共入選240名受試者，CholeveTM組和安慰劑組各為120例，均符合入選標(biāo)準(zhǔn)，LDL-C水平范圍在3.36mmol/1-4.9lmmol/l之間。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CholeveTM組失訪4例，自行終止試驗(yàn)1例，違背方案1例；安慰劑組失訪11例，自行終止試驗(yàn)1例，違背方案2例；經(jīng)過12周的臨床實(shí)驗(yàn)，服用CholeveTM4周、12周后，血LDL-C水平從4.08mmol/L降低至3.68mmol/L和3.40mmol/L，分別顯著下降了9.6％和16.4％(P值均等于0.0001)；而安慰劑組血LDL-C水平幾乎無改變，血LDL-C水平的變化百分?jǐn)?shù)僅為1.8％和0.26％。服用CholeveTM4周、12周后，血TC水平的改變盡管不及LDL-C水平，但仍分別下降了6.7％和11.3％(P值均等于0.0001)。(具體結(jié)果見表3、表4)。而且服用CholeveTM后，血LDL-C水平和TC水平的下降幅度12周大于4周。服用CholeveTM對(duì)血TG和HDL水平無明顯影響。
表3 服藥4周和12周后，受試者的血脂譜1分析(單位mmol/L)0 weeks 4 weeks 12 weeksCholeveTMPlacebo CholeveTMPlacebo CholeveTMPlacebo(n＝114) (n＝109) (n＝114) (n＝109) (n＝114) (n＝106)TC 6.31±0.58 6.18±0.64 5.87±0.682，36.18±0.80 5.58±0.702，36.12±0.64LDL-c 4.08±0.42 4.00±0.46 3.68±0.552，34.06±0.65 3.40±0.562，34.00±0.55HDL-c41.43±0.32 1.45±0.36 1.40±0.32 1.42±0.35 1.42±0.29 1.41±0.32TG52.10±0.86 1.93±0.82 2.08±0.97 2.00±0.82 2.07±1.02 1.90±0.791x±SD2p＝0.0001與0周基線比較3p＝0.0001與0周基線比較，并將基線值作為協(xié)變量，進(jìn)行協(xié)方差分析的結(jié)果4，5服藥組與安慰劑組之間無顯著性差異表4 服藥4周和12周后，受試者的血脂下降百分率1x±SE4 weeks 12 weeksCholeveTMPlacebo CholeveTMPlacebo(n＝114) (n＝109) (n＝114) (n＝106)TC(％)2-6.70±0.84 0.05±0.87 -11.34±0.89 -0.72±0.77LDL-c(％)3-9.58±1.09 1.75±1.29 -16.4±1.10 0.26±1.24HDL-c(％)40.35±2.10 -0.36±1.65 2.30±2.06 -0.69±1.59TG(％)50.51±2.58 11.79±4.82 2.58±3.52 5.58±3.761x±SEM2，3P＝0.0001與0周基線比較4，5服藥組與安慰劑組之間無顯著性差異表5的結(jié)果表明，服用CholeveTM對(duì)1分鐘和最大血小板聚集率無明顯影響。
表5 經(jīng)過12周服藥后受試者血小板聚集率PLAG(
x±SD)的情況0 weeks 12 weeksCholeveTMPlacebo CholeveTMPlacebo(n＝114) (n＝106) (n＝114) (n＝106)PLAG％(1min) 40.2±16.1 37.5±14.0 36.8±15.6 40.3±16.1PLAG％(Tmax) 56.2±20.6 57.3±19.1 56.5±23.0 57.4±19.1結(jié)論研究結(jié)果表明茶黃素具有顯著降低血LDL-C的作用，4周、12周LDL-C水平與基線以及安慰劑比較降低幅度分別為9.6％、16.4％以及分別為11.33％、16.66％(P值均為0.0001)，而且研究期間臨床入選病例的血常規(guī)、肝、腎功能、血糖、血電解質(zhì)均無異常，亦無與用藥相關(guān)的腹脹、腹痛、惡心等不良事件，這些結(jié)果表明，茶黃素具有高度的耐受性和安全性。這是任一化學(xué)合成藥物不能比擬的，也是調(diào)脂藥物所追求的第一目標(biāo)。而且如果增加CholeveTM的每天攝入量(從安全性而言是可行的)，使LDL-C下降20％以上是完全可能的。一般認(rèn)為，LDL-C水平下降20％以上對(duì)冠心病一級(jí)預(yù)防、二級(jí)預(yù)防就可取得顯著的臨床效益，特別是對(duì)于輕、中度危險(xiǎn)的冠心病一級(jí)預(yù)防、二級(jí)預(yù)防而言，其臨床意義更大，可為預(yù)防和/或治療高脂血癥與其相關(guān)的其它心血管疾病的健康產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的茶黃素在制備預(yù)防或治療高血脂癥的保健品或藥品中的應(yīng)用， 其中R1為H或G；R2為H或G；G為
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其特征在于R1＝H，R2＝H。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其特征在于R1＝G，R2＝H。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其特征在于R1＝H，R2＝G。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其特征在于R1＝G，R2＝G。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用，其特征在于該茶黃素為權(quán)利要求
2或3或4或5中所述單體的任意組合。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種茶黃素(theaflavins，TFs)在制備預(yù)防或治療高血脂癥的保健品或藥品的應(yīng)用，該茶黃素為茶黃素(theaflavin，TF1)，茶黃素-3-單沒食子酸脂(theaflavin-3-gallate，TF2A)，茶黃素-3′-單沒食子酸脂(theaflavin-3′-gallate，TF2B)，茶黃素-3，3′-雙沒食子酸脂(theaflavin-3，3′-digallate，TF3)四個(gè)單體中的一種或它們的任意組合。
文檔編號(hào)A61K31/352GKCN1156276SQ02111512
公開日2004年7月7日 申請(qǐng)日期2002年4月26日
發(fā)明者趙劍, 周睿, 陳虎, 趙 劍 申請(qǐng)人:上?？茖毶锛夹g(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan