本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，涉及模式昆蟲病毒病的防治方法，具體為1-甲基肌苷在制備防治家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒(bombyx?morinucleopolyhedrovirus，bmnpv)引起的一種嚴(yán)重的傳染性蠶病，是養(yǎng)蠶過程中最常見的病害之一。因其在家蠶發(fā)育的各個(gè)齡期均有發(fā)生，且在發(fā)病前的感染期沒有明顯的外部感染，故經(jīng)常導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)時(shí)已呈現(xiàn)大面積感染特征。bmnpv屬桿狀病毒科，是一類專一感染節(jié)肢動(dòng)物的有囊膜的dna病毒。它在病毒復(fù)制過程中會(huì)形成兩種病毒粒子，即包涵體衍生型病毒粒子(occlusion?derivedvirions，odv)與出芽型病毒粒子(buddedvirions，bv)，隨食物或者體壁傷口攝入的odv感染中腸上皮柱形細(xì)胞引起原發(fā)感染后，產(chǎn)生的bv繼發(fā)感染其他敏感組織和細(xì)胞引起水平傳播，最終導(dǎo)致宿主的全身性感染，而死亡病蠶、蛹、蛾的尸體、膿汁及被之污染的蠶糞、蠶具、蠶繭，也帶有大量的病毒，具有強(qiáng)烈的傳染性，是血液型膿病的主要傳染源。

2、目前對于家蠶血液型膿病的治療尚無特效藥物，生產(chǎn)上主要是通過使用化學(xué)消毒劑在整個(gè)養(yǎng)蠶周期進(jìn)行消毒來防止病毒的感染和擴(kuò)散,但這些措施僅能起到消毒、預(yù)防作用。而實(shí)際飼養(yǎng)過程中，家蠶血液型膿病的潛伏期短，發(fā)病快，感染時(shí)肉眼難以察覺，當(dāng)肉眼發(fā)現(xiàn)時(shí)，則常處于發(fā)病晚期或是暴發(fā)期。且一旦病毒感染了蠶體，蠶農(nóng)根本束手無策。

3、現(xiàn)有技術(shù)中，已有試驗(yàn)研究證明β-丙內(nèi)酯、萘啶酮酸等化合物對家蠶bmnpv感染后的發(fā)病程度具有一定的抑制效果，但其主要作用還是體現(xiàn)在預(yù)防而不是治療。1-甲基肌苷是一種有機(jī)化合物，由嘌呤和核苷組成，來源于肌苷，是其在dna合成過程中起類似核苷作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員常將上述核苷類似物用于阻止病毒在受感染細(xì)胞中復(fù)制，目前1-甲基肌苷應(yīng)用于病毒及bmnpv防治方面尚無專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得一種針對家蠶血液型膿病、且兼具預(yù)防和治療功能的藥物，本發(fā)明提供了1-甲基肌苷在制備防治家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：1-甲基肌苷在制備預(yù)防家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用。

3、1-甲基肌苷在制備治療家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用。

4、1-甲基肌苷在抑制家蠶細(xì)胞中bmnpv病毒復(fù)制或增殖中的應(yīng)用。

5、優(yōu)選的，所述1-甲基肌苷的有效濃度為1-100μm。

6、優(yōu)選的，所述1-甲基肌苷的有效濃度為10μm。

7、優(yōu)選的，應(yīng)用方法包括以下步驟：

8、s1、采用二甲基亞砜(dmso)溶解1-甲基肌苷，配制濃度為10mm的儲(chǔ)存液；

9、s2、bmnpv病毒感染家蠶細(xì)胞前添加1-甲基肌苷

10、在細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種家蠶細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)皿中添加s1中的儲(chǔ)存液，使儲(chǔ)存液終濃度為1-100μm，在27℃條件下繼續(xù)孵育10-120min；然后用moi＝10、攜帶綠色熒光蛋白基因的bmnpv病毒感染細(xì)胞，27℃培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入10μl?mtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入100μl?formazan，混勻后27℃培養(yǎng)3-4小時(shí)，560-600nm處測吸光值，檢測1-甲基肌苷對細(xì)胞活性的影響；

11、s3、bmnpv病毒感染家蠶細(xì)胞后添加1-甲基肌苷

12、在細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種家蠶細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，用moi＝10、攜帶綠色熒光蛋白基因的bmnpv病毒感染細(xì)胞，并在感染后0、12、24、48、72、96小時(shí)后加入1-甲基肌苷儲(chǔ)存液，使儲(chǔ)存液終濃度為1-100μm，27℃培養(yǎng)，取細(xì)胞培養(yǎng)液用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。

13、優(yōu)選的，bmnpv病毒感染家蠶細(xì)胞前后，1-甲基肌苷能夠顯著抑制vp39，lef-1和pe38基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

14、有益效果：(1)本發(fā)明提供了1-甲基肌苷的一種新應(yīng)用形式，用于制備家蠶血液型膿病防治藥物；(2)1-甲基肌苷使用終濃度在1μm以上時(shí)均可實(shí)現(xiàn)bmnpv復(fù)制或增殖的完全抑制，且不限制bmnpv感染前(預(yù)防)和感染后(治療)；(3)本發(fā)明為家蠶血液型膿病的防治藥物研發(fā)提供了新的思路，具有應(yīng)用推廣價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.1-甲基肌苷在制備預(yù)防家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用。

2.1-甲基肌苷在制備治療家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用。

3.1-甲基肌苷在抑制家蠶細(xì)胞中bmnpv病毒復(fù)制或增殖中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述1-甲基肌苷的有效濃度為1-100μm。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述1-甲基肌苷的有效濃度為10μm。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用方法包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，bmnpv病毒感染家蠶細(xì)胞前后，1-甲基肌苷能夠顯著抑制vp39，lef-1和pe38基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了1?甲基肌苷在制備防治家蠶血液型膿病藥物中的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明提供了1?甲基肌苷的一種新應(yīng)用形式，用于制備家蠶血液型膿病防治藥物；(2)1?甲基肌苷使用終濃度在1μM以上時(shí)均可實(shí)現(xiàn)BmNPV復(fù)制或增殖的完全抑制，且不限制BmNPV感染前(預(yù)防)和感染后(治療)；(3)本發(fā)明為家蠶血液型膿病的防治藥物研發(fā)提供了新的思路，具有應(yīng)用推廣價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：錢平,于瓊,方昱佳,俞博涵,唐旭東
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2