本發(fā)明屬于納米材料和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種靶向鼻咽癌的納米火車載藥系統(tǒng)及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鼻咽癌(nasopharyngeal?carcinoma,npc)是一種具有獨特地域特色的惡性腫瘤，尤其在我國南方高發(fā)。npc惡性程度高，對放療高度敏感，臨床上對早期npc患者常采取單純放射治療，但npc在早期往往缺乏明顯的癥狀，許多患者在確診時已進入中晚期，錯過了最佳的治療時機。單獨放療的5年生存率僅為35-52％，聯(lián)合化療雖然可以提高治療效果，但同時也帶來了嚴重的毒副作用。隨著醫(yī)學(xué)研究的進展，免疫治療作為一種新興的治療手段，已經(jīng)在多種癌癥治療中顯示出巨大的潛力，包括npc。nk細胞介導(dǎo)的免疫治療與放療和靶向治療的聯(lián)合使用越來越廣泛，在達到更好的治療效果的同時減少其毒副作用。因此，為了提高鼻咽癌治療的精確性和有效性，篩選對鼻咽癌特異分子標志物的探針，并利用該特異性探針制作靶向性藥物及靶向性nk細胞，靶向性藥物能夠?qū)⑺幬锞_地遞送到癌細胞，減少對正常細胞的損害，同時靶向性nk細胞也能更有效地靶向識別并清除腫瘤，達到“一石二鳥”的目的，提高靶向治療效果的同時降低其毒副作用，為鼻咽癌患者提供了一種全新的治療選擇。

2、核酸適配體(aptamer)，也被稱為“化學(xué)抗體”，是一種通過指數(shù)富集的配體結(jié)合過程(selex，systematic?evolution?ofligands?by?exponential?enrichment)技術(shù)從大量核酸庫中篩選出來的單鏈寡核苷酸。這些適配體能夠高度特異性地識別并結(jié)合其目標分子，包括蛋白質(zhì)、小分子化合物、甚至細胞和組織。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有許多優(yōu)勢，例如體積小、生物相容性好、穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低、易于化學(xué)修飾等。在作為靶向基團時，核酸適配體由于體積較小，產(chǎn)生的位阻很少，從而增強了和靶點的結(jié)合能力，在靶向治療方面展現(xiàn)出了巨大潛力。

3、阿霉素(doxorubicin，dox)是一種廣泛用于多種癌癥治療的化療藥物，包括npc。雖然dox常規(guī)化療在一定程度上能改善療效，但在治療過程中常伴隨骨髓抑制和心臟毒性等毒副作用，嚴重限制了其在npc中的應(yīng)用和治療效果。因此，將核酸適配體偶聯(lián)到裝載阿霉素的納米載藥系統(tǒng)即“納米火車”上，該藥物遞送系統(tǒng)利用核酸適配體的高度特異性和親和力，能夠精準識別并靶向腫瘤細胞表面的特定標志物。裝載有阿霉素的“納米火車”在適配體的引導(dǎo)下，能夠高效地將藥物遞送到腫瘤部位，從而在提高治療效果的同時，顯著降低對正常細胞和組織的毒副作用。然而，腫瘤微環(huán)境復(fù)雜多變，單一化療的治療效果是有限的，聯(lián)合免疫治療是非常有必要的，既可以提供直接的殺瘤作用，又可以識別和清除逃逸的癌細胞，實現(xiàn)長期監(jiān)控和防止復(fù)發(fā)。

4、以nk細胞為基礎(chǔ)的免疫療法展現(xiàn)出了巨大的潛力，nk細胞殺傷腫瘤細胞不需要抗原呈遞，也無需事先增敏或克隆擴增，通過釋放穿孔素誘導(dǎo)靶細胞死亡，激活細胞信號通路觸發(fā)細胞凋亡。nk細胞的這些固有特性展示出其在過繼性腫瘤免疫治療中的巨大應(yīng)用價值。然而，由于nk細胞缺少細胞特異性受體，選擇性較差，這限制了它在臨床上的應(yīng)用。通過糖代謝標記和點擊反應(yīng)在nk細胞表面修飾適配體s3，這種適配體修飾的nk細胞能夠更精確地識別腫瘤細胞表面的特定標志物，從而顯著提高nk細胞對腫瘤的靶向性。通過這種方式，nk細胞的免疫殺傷能力得到了顯著增強，同時減少了對正常細胞的損害，降低了毒副作用。

5、總之，利用核酸適配體的靶向特異性，偶聯(lián)“納米火車”裝載化療藥物dox，聯(lián)合nk細胞過繼免疫治療策略，在提高靶向治療效果的同時降低毒副作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種靶向鼻咽癌的納米火車載藥系統(tǒng)及其制備方法與應(yīng)用，提出了一種基于特異靶向npc細胞的核酸適配體s3修飾的“納米火車”載藥系統(tǒng)和工程化的nk細胞產(chǎn)品聯(lián)合治療鼻咽癌的制備方法與應(yīng)用，該聯(lián)合系統(tǒng)通過核酸適配體分別與“納米火車”以及nk細胞相結(jié)合，核酸適配體修飾的“納米火車”在顯著提高藥物的負載量的同時能減少對正常組織及細胞的毒副作用，核酸適配體修飾的nk細胞在達到靶向免疫治療效果的同時能減少car-nk容易引起插入突變的風險，二者聯(lián)合可實現(xiàn)對npc更精準的靶向，顯著提高npc的治療效果，因此，利用核酸適配體的靶向特異性，偶聯(lián)“納米火車”與nk細胞聯(lián)合實現(xiàn)對鼻咽癌細胞的靶向遞送和治療。

2、為達到上述目的，本方案首先提供了一種靶向鼻咽癌的納米火車載藥系統(tǒng)，包括核酸適配體納米火車載藥納米粒和工程化nk細胞，所述核酸適配體納米火車載藥納米粒包括核酸適配體s3、dna納米火車和阿霉素，所述dna納米火車是由dna單體m1和m2在核酸適配體觸發(fā)探針trigger的作用下堿基互補配對發(fā)生雜交鏈式反應(yīng)自組裝形成的長雙鏈結(jié)構(gòu)；所述dna納米火車裝載阿霉素后被核酸適配體s3修飾；所述工程化nk細胞為核酸適配體s3修飾的nk細胞；

3、所述核酸適配體s3的序列如seq?id?no.1所示；

4、所述dna單體m1的序列如seq?id?no.2所示；

5、所述dna單體m2的序列如seq?id?no.3所示；

6、所述核酸適配體觸發(fā)探針trigger的序列如seq?id?no.4所示。

7、基于一個總的發(fā)明構(gòu)思，本方案還提供了一種納米火車載藥系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

8、s1、dna納米火車的制備：在核酸適配體s3的5′末端修飾核酸適配體觸發(fā)探針trigger得到嵌合體s3-trigger，將其引入dna單體m1和m2的混合物中，通過堿基互補配對原則發(fā)生雜交鏈式反應(yīng)自組裝，形成dna納米火車s3-ntr；

9、s2、核酸適配體納米火車載藥納米粒的制備：將阿霉素與s1步驟制得的dna納米火車s3-ntr以摩爾比50:1的比例混合于含mg2+的杜氏磷酸鹽緩沖液中，室溫放置，阿霉素即載入到s3-ntr的載藥位點中，得到s3-ntr-dox；

10、s3、疊氮修飾的nk92細胞的制備：向nk92細胞中加入n-疊氮乙酰基甘露糖胺-四?；cnk92細胞共孵育，之后收集細胞用pbs洗滌得到疊氮修飾的nk92細胞；

11、s4、工程化nk細胞的制備：將s3制得的疊氮修飾的nk92細胞與fam標記、dbco修飾的s3適配體在添加1％胎牛血清的pbs緩沖液中孵育，之后采用pbs緩沖液洗滌；

12、所述dbco修飾的s3適配體的序列如seq?id?no.5所示。

13、作為優(yōu)選，所述步驟s1中嵌合體s3-trigger與dna單體m1和m2的混合物濃度比為1:10。

14、作為優(yōu)選，所述步驟s2中室溫放置的時間為2h。

15、作為優(yōu)選，所述步驟s3中孵育時間為24h。

16、作為優(yōu)選，所述步驟s4中孵育的溫度為37℃，時間為2h。

17、基于一個總的發(fā)明構(gòu)思，本方案還提供了一種納米火車載藥系統(tǒng)在制備靶向治療鼻咽癌藥物中的應(yīng)用。

18、作為優(yōu)選，所述納米火車載藥系統(tǒng)為任何藥學(xué)上認可的制劑。

19、作為優(yōu)選，所述納米火車載藥系統(tǒng)的給藥順序為：先給藥工程化nk細胞，4h后再給藥核酸適配體納米火車載藥納米粒s3-ntr-dox。

20、本方案治療的機理如下：

21、該聯(lián)合系統(tǒng)通過核酸適配體分別與“納米火車”以及nk細胞相結(jié)合，核酸適配體修飾的“納米火車”在顯著提高藥物的負載量的同時能減少對正常組織及細胞的毒副作用，核酸適配體修飾的nk細胞在達到靶向免疫治療效果的同時能減少car-nk容易引起插入突變的風險，二者聯(lián)合可實現(xiàn)對npc更精準的靶向，顯著提高npc的治療效果，因此，利用核酸適配體的靶向特異性，偶聯(lián)“納米火車”與nk細胞聯(lián)合實現(xiàn)對鼻咽癌細胞的靶向遞送和治療。

22、核酸適配體納米火車載藥納米粒包括核酸適配體s3、dna納米火車和抗腫瘤藥物dox。核酸適配體s3通過堿基互補配對連接在納米火車的一端，作為靶向分子識別鼻咽癌細胞表面的cd109蛋白；納米火車由dna單體m1和m2在核酸適配體觸發(fā)探針(s3-trigger)的作用下自組裝而成，形成長雙鏈結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有大量可裝載藥物的位點。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

24、(1)本方案提供了特異性識別npc細胞的核酸適配體s3修飾的“納米火車”載藥系統(tǒng)(s3-ntr-dox)，該系統(tǒng)能特異性地識別并結(jié)合npc細胞表面的cd109分子，實現(xiàn)抗腫瘤藥物dox的高效靶向遞送。相較于游離dox，s3-ntr-dox顯著增強了dox對npc細胞的殺傷效果，同時在npc腫瘤球中也表現(xiàn)出良好的靶向殺傷性，為npc的靶向治療提供了新的有效手段。

25、(2)阿霉素是一種廣泛應(yīng)用于多種癌癥治療的化療藥物，盡管常規(guī)使用阿霉素進行化療能夠在一定程度上改善治療效果，但由于其無靶向性，其殺傷作用仍會波及正常細胞和組織。本發(fā)明通過將阿霉素裝載到能特異性識別npc細胞的核酸適配體s3修飾的“納米火車”上，該系統(tǒng)在實現(xiàn)高效靶向治療的同時，顯著降低了阿霉素對正常組織和細胞的毒性作用。體內(nèi)外實驗均證明，s3-ntr-dox治療組對正常組織的毒性低或無毒性，生物安全性良好，有望減輕患者在化療過程中的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量。

26、(3)本發(fā)明提供的靶向npc細胞的載藥系統(tǒng)，制備方法簡單，載藥效率高，通過對其作用機制的深入探索，為抗腫瘤藥物的特應(yīng)性靶向遞送和npc的個性化治療提供了新的思路和策略。