本發(fā)明屬于健康產(chǎn)品領(lǐng)域，涉及一種肉蓯蓉提取物的制備方法，及其在抗氧化、提高機(jī)體免疫力和減輕pm2.5對(duì)機(jī)體傷害方面的應(yīng)用。本發(fā)明的提取物可以作為食品、保健食品、或藥品使用。

背景技術(shù)：

免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是人體識(shí)別和消滅外來(lái)侵入的任何異物(病毒、細(xì)菌等)，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞，以及識(shí)別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力，是人體識(shí)別和排除“異己”的生理反應(yīng)。當(dāng)人體免疫功能失調(diào)，或者免疫系統(tǒng)不健全時(shí)，下列問(wèn)題就會(huì)反復(fù)發(fā)作：感冒反復(fù)發(fā)作、扁桃體炎反復(fù)發(fā)作、哮喘反復(fù)發(fā)作、支氣管炎反復(fù)發(fā)作、肺炎反復(fù)發(fā)作、腹瀉反復(fù)發(fā)作。

此外，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)現(xiàn)，環(huán)境問(wèn)題也越來(lái)越突出，尤其是近年來(lái)霧霾現(xiàn)象出現(xiàn)的頻率也日益增高，對(duì)人類健康的傷害是不容忽視的。別以為霧氣看似溫和，其實(shí)它里面卻含有各種對(duì)人體有害的細(xì)顆粒、有毒物質(zhì)達(dá)20多種，包括了酸、堿、鹽、胺、酚等，以及塵埃、花粉、螨蟲(chóng)、流感病毒、結(jié)核桿菌、肺炎球菌等，其含量是普通大氣水滴的幾十倍。因此，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)功能是保持健康的重要手段之一。

本發(fā)明旨在尋找一種具有較好免疫調(diào)節(jié)功效和減輕pm2.5對(duì)機(jī)體傷害的植物提取物，是以肉蓯蓉為原料。肉蓯蓉cistancheherba又名金筍、地精、蓯蓉、大蕓，為列當(dāng)科植物肉蓯蓉cistanchedeserticolay.c.ma或管花肉蓯蓉cistanchetubulosa(schrenk)wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、青海等地。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其后古典《本草經(jīng)疏》、《本草匯言》、《月華子本草》等多有記載。李時(shí)珍曰：“此物補(bǔ)而不峻，故有從容之兮”。肉蓯蓉味甘、成，性溫，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便的功能，在我國(guó)已有兩千多年的使用歷史?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，肉蓯蓉除作為傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽(yáng)中藥外，更兼具有抗衰老、增強(qiáng)記憶、抗疲勞時(shí)等多種功能。本發(fā)明使用特殊工藝制備得到肉蓯蓉提取物，經(jīng)體內(nèi)生物活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)能明顯清除自由基、提高機(jī)體免疫力和減輕pm2.5對(duì)機(jī)體傷害的功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種肉蓯蓉提取物的制備方法及其用途，將肉蓯蓉肉質(zhì)莖晾干粉碎后，使用酶提取法獲得具有生物活性的肉蓯蓉提取物，該提取物可以用作食品、保健食品以及藥品。本發(fā)明種的制備工藝是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的科學(xué)研究而總結(jié)出來(lái)的，其特點(diǎn)在于工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，綠色環(huán)保，同時(shí)用于大規(guī)模生產(chǎn)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)的：

一種肉蓯蓉提取物，其通過(guò)下述方法制備得到：將肉蓯蓉鮮品或干品與水混合，進(jìn)行酶提取，提取液濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.05～1.10g/ml，經(jīng)干燥得到提取物。

所述的肉蓯蓉提取物的提取原料可以為新鮮的肉蓯蓉的干燥肉質(zhì)莖，或者其經(jīng)過(guò)水(不合生物酶)或者有機(jī)溶劑提取后的藥渣。

優(yōu)選地，肉蓯蓉肉質(zhì)莖部分晾干后，粉碎、過(guò)篩，加水?dāng)嚢瑁{(diào)節(jié)溫度和ph，加入生物蛋白酶進(jìn)行酶解提取，提取完成后，煮沸，離心、過(guò)濾，上清液經(jīng)濃縮干燥，得到土黃色肉蓯蓉提取物。

優(yōu)選地，(1)將肉蓯蓉藥材中的肉質(zhì)莖部分晾干并粉碎，過(guò)40目以上篩網(wǎng)從而獲得蓯蓉藥粉。

(2)將一定量的蓯蓉藥粉與純化水按質(zhì)量比為1∶10～1∶20混合，加入藥粉質(zhì)量的0.1％～0.5％的生物蛋白酶，調(diào)節(jié)ph至5～9，恒溫40～55℃攪拌3～6h；

(3)提取完成后，將步驟(2)中的藥材提取液煮沸5～10min，待冷卻至室溫，離心過(guò)濾，濾液待用；

(4)將步驟(3)中的濾液在溫度為50～60℃濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.05～1.10g/ml，經(jīng)干燥得到土黃色肉蓯蓉提取物；所述肉蓯蓉提取物的收率不低于40％。

優(yōu)選地，所述的生物蛋白酶選自食品級(jí)的中性蛋白酶(酶活力≥20萬(wàn)u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40萬(wàn)u/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力≥30萬(wàn)u/g)、堿性蛋白酶(酶活力≥20萬(wàn)u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地使用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或者它們的混合物；

優(yōu)選地，所述的濃縮方法可以為膜濃縮、減壓濃縮、常壓濃縮；

優(yōu)選地，所述的干燥方法可以為噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥、冷凍干燥。

本發(fā)明還提供了一種肉蓯蓉提取物的提取方法，其包括下述步驟：將肉蓯蓉鮮品或干品與水混合，進(jìn)行酶提取，提取液濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.05～1.10g/ml，經(jīng)干燥得到提取物。

優(yōu)選地，所述提取方法包括下述步驟：

(1)將肉蓯蓉藥材中的肉質(zhì)莖部分晾干并粉碎，過(guò)40目以上篩網(wǎng)從而獲得蓯蓉藥粉；

(2)將一定量的蓯蓉藥粉與純化水按質(zhì)量比為1∶10～1∶20混合，加入藥粉質(zhì)量的0.1％～0.5％的生物蛋白酶，調(diào)節(jié)ph至5～9，恒溫40～55℃攪拌3～6h；

(3)提取完成后，將步驟(2)中的藥材提取液煮沸5～10min，待冷卻至室溫，離心過(guò)濾，濾液待用；

(4)將步驟(3)中的濾液在溫度為50～60℃濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.05～1.10g/ml，經(jīng)干燥得到土黃色肉蓯蓉提取物；所述肉蓯蓉提取物的收率不低于40％。

優(yōu)選地，所述的生物蛋白酶選自食品級(jí)的中性蛋白酶(酶活力≥20萬(wàn)u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40萬(wàn)u/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力≥30萬(wàn)u/g)、堿性蛋白酶(酶活力≥20萬(wàn)u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地使用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或者它們的混合物；

優(yōu)選地，所述的濃縮方法可以為膜濃縮、減壓濃縮、常壓濃縮；

優(yōu)選地，所述的干燥方法可以為噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥、冷凍干燥。

本發(fā)明還提供了一種組合物，其含有上述提取物，和可藥用或食用輔料；可為任意劑型，優(yōu)選其是片劑、分散片、膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、顆粒劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、微丸劑、滴丸劑、糖漿劑、散劑、浸膏劑、煎膏劑、口服液體制劑及其他藥學(xué)上可以接受的劑型。

所述提取物和組合物能明顯清除自由基，具有抗氧化的功效；對(duì)體內(nèi)巨噬細(xì)胞抑制具有明顯的改善，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功效；對(duì)pm2.5引起的心血管毒性具有較強(qiáng)的改善功效，能夠增強(qiáng)吞噬納米活性炭(pm2.5)的巨噬細(xì)胞的功能。

所述的組合物可用于制備治療或預(yù)防自由基過(guò)多引起的癥狀的藥物、食品或保健品的應(yīng)用；可用于制備增強(qiáng)免疫力的藥物、食品或保健品；用于制備預(yù)防、治療或者減輕pm2.5顆粒物對(duì)機(jī)體造成傷害的藥物、食品或保健品。

優(yōu)選地，本發(fā)明的肉蓯蓉提取物的制備方法，其包括下述步驟：肉蓯蓉肉質(zhì)莖部分晾干后，粉碎、過(guò)篩，加水?dāng)嚢?，將溫度和ph調(diào)至生物蛋白酶酶提取的最佳條件后，加入一定量的生物蛋白酶進(jìn)行酶解提取，提取完成后，煮沸滅活，離心、過(guò)濾，上清液經(jīng)濃縮干燥，得到土黃色肉蓯蓉提取物，具體制備方法如下：

(1)將肉蓯蓉藥材中的肉質(zhì)莖部分晾干并粉碎，過(guò)40目以上篩網(wǎng)從而獲得蓯蓉藥粉。

(2)將一定量的蓯蓉藥粉與純化水按質(zhì)量比為1∶10～1∶20混合，加入藥粉質(zhì)量的0.1％～0.5％的生物蛋白酶，調(diào)節(jié)ph至5～9，恒溫40～55℃攪拌3～6h。

(3)提取完成后，將步驟(2)中的藥材提取液煮沸5～10min，待冷卻至室溫，離心過(guò)濾，濾液待用。

(4)將步驟(3)中的濾液在溫度為50～60℃濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.05～1.10g/ml，經(jīng)干燥得到土黃色肉蓯蓉提取物。

所述的生物蛋白酶選自食品級(jí)的中性蛋白酶(酶活力≥20萬(wàn)u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40萬(wàn)u/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力≥30萬(wàn)u/g)、堿性蛋白酶(酶活力≥20萬(wàn)u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地使用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或者它們的混合物。

所述的濃縮方法可以為膜濃縮、減壓濃縮、常壓濃縮。

所述的干燥方法可以為噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥、冷凍干燥。

所述肉蓯蓉提取物的收率在40～60％。

本發(fā)明還提供了一種組合物，其含有所述肉蓯蓉提取物，藥物或食品上可接受的助劑。

所述該專利中制備所得肉蓯蓉提取物可以與常規(guī)預(yù)防或治療疲勞疾病的藥物如人參、黃精、枸杞、茯苓等復(fù)配組合。

所述該專利中制備所得肉蓯蓉提取物可以與藥用輔料組合，其是片劑、分散片、膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、顆粒劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、微丸劑、滴丸劑、糖漿劑、散劑、浸膏劑、煎膏劑、口服液體制劑及其他藥學(xué)上可以接受的劑型。

所述該專利中制備所得肉蓯蓉提取物可以明顯清除自由基，具有抗氧化的功效；對(duì)體內(nèi)巨噬細(xì)胞抑制具有明顯的改善，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功效；對(duì)pm2.5引起的心血管毒性具有較強(qiáng)的改善功效，能夠增強(qiáng)吞噬納米活性炭(pm2.5)的巨噬細(xì)胞的功能。因此，可以預(yù)期本發(fā)明的肉蓯蓉提取物或含有它的藥物組合物可以用于治療或預(yù)防自由基過(guò)多引起的癥狀的藥物、食品或保健品的用途；可用于制備增強(qiáng)免疫力的藥物、食品或保健品方面的用途；用于制備預(yù)防、治療或者減輕pm2.5顆粒物對(duì)機(jī)體造成傷害的藥物、食品或保健品方面的用途。

附圖說(shuō)明

圖1：肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞的抑制改善作用的表型圖；

圖2：肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能促進(jìn)作用的表型圖；

圖3：肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)吞噬納米活性炭(pm2.5)的巨噬細(xì)胞吞噬功能促進(jìn)作用的表型圖。

實(shí)施例

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例所述方法僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明制備方法的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。如無(wú)特別說(shuō)明，實(shí)施例中用到的所有原料和溶劑均購(gòu)為市售產(chǎn)品。活性實(shí)施例所用本發(fā)明產(chǎn)品和陽(yáng)性對(duì)照藥品的量，均按照試驗(yàn)受體的最大耐受劑量加入。

制備實(shí)施例1：

將肉蓯蓉藥材中的肉質(zhì)莖部分(和田天力沙生藥物開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，其它商購(gòu)產(chǎn)品亦可)經(jīng)cn105796656a實(shí)施例1水提后的藥渣，將其晾干并粉碎，過(guò)60目篩網(wǎng)備用。稱取100kg蓯蓉藥粉，與純化水按質(zhì)量比為1∶10混合，加入200g中性蛋白酶(酶活力為30萬(wàn)u/g)，調(diào)節(jié)ph至7～8，保持溫度為45～50℃。攪拌提取3h后，將提取液煮沸5～10min，待冷卻至室溫，離心過(guò)濾，濾液待用。將濾液在溫度為55～60℃濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.05g/ml，經(jīng)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為160～170℃，出風(fēng)溫度為70～80℃，干燥完成后，得到52kg土黃色肉蓯蓉提取物(批號(hào)為c-1)。

制備實(shí)施例2：

將肉蓯蓉藥材中的肉質(zhì)莖部分(和田天力沙生藥物開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，其它商購(gòu)產(chǎn)品亦可)晾干并粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)備用。稱取100kg蓯蓉藥粉，與純化水按質(zhì)量比為1∶15混合，加入100g堿性蛋白酶(酶活力為40萬(wàn)u/g)，調(diào)節(jié)ph至8～9，保持溫度為40～45℃。攪拌提取4h后，將提取液煮沸5～10min，待冷卻至室溫，離心過(guò)濾，濾液待用。將濾液在溫度為55～60℃濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.10g/ml，經(jīng)真空干燥箱進(jìn)行干燥，溫度為60～65℃，負(fù)壓為0.08～0.1mpa，干燥12h后，得到56kg土黃色肉蓯蓉提取物(批號(hào)為c-2)。

制備實(shí)施例3：

將肉蓯蓉藥材中的肉質(zhì)莖部分(和田天力沙生藥物開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，其它商購(gòu)產(chǎn)品亦可)晾干并粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)備用。稱取100kg蓯蓉藥粉，與純化水按質(zhì)量比為1∶20混合，加入150g木瓜蛋白酶(酶活力為50萬(wàn)u/g)，調(diào)節(jié)ph至7.5～8.5，保持溫度為50～55℃。攪拌提取4h后，將提取液煮沸5～10min，待冷卻至室溫，離心過(guò)濾，濾液待用。將濾液在溫度為55～60℃濃縮至約30℃時(shí)的相對(duì)密度為1.08g/ml，經(jīng)噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為160～170℃，出風(fēng)溫度為70～80℃，干燥完成后，得到42kg土黃色肉蓯蓉提取物(批號(hào)為c-3)。

生物活性實(shí)施例1(抗氧化活性)：

1dpph自由基清除實(shí)驗(yàn)：

1.1dpph乙醇溶液的配制：精密稱取dpph4mg，置于100ml棕色容量瓶中，加入50ml乙醇，超聲30s，用乙醇定容至刻度，搖勻，待用。本品須現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2供試品溶液的配制：精密稱取適量肉蓯蓉提取物，加乙醇溶解后，定容，稀釋成所需濃度，即可。

1.3操作步驟：準(zhǔn)確吸取2ml供試品溶液和2mldpph溶液混合均勻；準(zhǔn)確吸取2ml供試品溶液和2ml乙醇混合均勻；準(zhǔn)確吸取2mldpph溶液和2ml乙醇混合均勻，室溫放置30min，在515nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并根據(jù)以下計(jì)算公式計(jì)算自由基清除率：

ir％＝[1-(ai-aj)/a0]*100％；

其中，ai表示待測(cè)溶液和dpph混合后溶液的吸光度；

aj表示待測(cè)溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；

a0表示dpph和溶劑混合后溶液的吸光度。

2abts⁺自由基清除實(shí)驗(yàn)：

2.1pbs緩沖液的配制：稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，十二水合磷酸氫二鈉3.62g，置于1000ml燒杯中，加入800ml蒸餾水，攪怑使其溶解，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至7.4，轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。

2.2abts⁺貯存溶液的配制：精密稱取abts⁺78mg左右，置于20ml棕色容量瓶中，加入15ml蒸餾水，超聲5min，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精密稱取過(guò)硫酸鉀76mg左右，置于2ml棕色容量瓶中，加入1ml蒸餾水，超聲使其溶解，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精確吸取352μl過(guò)硫酸鉀溶液加入至abts溶液中，搖勻，靜置過(guò)夜。

2.3abts⁺工作溶液的配制：精確吸取貯存溶液1ml，加入65ml左右pbs緩沖液，搖勻。

2.4供試品溶液的配制：精密稱取適量肉蓯蓉提取物，加pbs緩沖液溶解后，定容，稀釋成所需濃度，即可。

2.5操作步驟：準(zhǔn)確吸取0.5ml供試品溶液和5mlabts工作溶液混合均勻；準(zhǔn)確吸取0.5ml供試品溶液和5mlpbs緩沖液混合均勻；準(zhǔn)確吸取5mlabts工作溶液和0.5mlpbs緩沖液混合均勻，立即在734nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率：

ir％＝[1-(ai-aj)/a0]*100％；

其中，ai表示待測(cè)溶液和abts混合后溶液的吸光度；

aj表示待測(cè)溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；

a0表示abts和溶劑混合后溶液的吸光度。

3srsa超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)：

3.1nbt溶液的配制：精密稱取氯化硝基四氮唑藍(lán)(nbt)24.5mg，置于100ml棕色容量瓶中，加入50ml蒸餾水，超聲30s，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，待用。

3.2nadh溶液的配制：精密稱取煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型輔酶i(nadh)33.2mg，置于100ml棕色容量瓶中，加入50ml蒸餾水，超聲30s，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，待用。

3.3pms溶液的配制：精密稱取吩嗪硫酸甲酯(pms)4.59mg，置于250ml棕色容量瓶中，加入150ml蒸餾水，超聲30s，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，待用。

3.4tris-hcl緩沖溶液的配制：精密稱取三羥甲基氨基甲烷(tris)3.025g，置于500ml燒杯中，加入200ml蒸餾水，攪拌使其溶解，用1mhcl調(diào)節(jié)ph至8.0，轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，待用。使用時(shí)，取16ml上述溶液置于100ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。

3.3供試品溶液的配制：精密稱取適量肉蓯蓉提取物，加tris-hcl緩沖液溶解后，定容，稀釋成所需濃度，即可。

3.4吸光值檢測(cè)及自由基清除率的計(jì)算：準(zhǔn)確吸取1mlnadh溶液，1mlnbt溶液和3ml供試品溶液，對(duì)照加3mltris-hcl緩沖溶液，分別混合均勻，各加1mlpms溶液混勻，室溫放置5min，在558nm處測(cè)定吸光度，自由基清除率計(jì)算公式如下：

ir％(srsa)＝(1-ai/a0)*100％

其中，ai表示待測(cè)溶液和檢測(cè)試劑混合后溶液的吸光度；

a0表示空白溶液和檢測(cè)試劑混合后溶液的吸光度。

分別配制制備實(shí)施例1中的肉蓯蓉提取物濃度為600μg/ml，以維生素c為陽(yáng)性對(duì)照(濃度為100μg/ml)，測(cè)試結(jié)果如表1所示：

表1肉蓯蓉提取物的抗氧化活性

由表1可知，本發(fā)明方法所制備的肉蓯蓉提取物對(duì)abts自由基和對(duì)超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除活性，而對(duì)dpph自由基具有中等強(qiáng)度的清除活性。

生物活性實(shí)施例2(免疫調(diào)節(jié)活性)：

1肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制的改善作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：黑色素等位基因突變型albino品系斑馬魚(yú)，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，年齡為受精后2天(2dpf)。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ喊唏R魚(yú)靜脈注射長(zhǎng)春瑞濱建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制模型。

實(shí)驗(yàn)步驟：對(duì)受精后2天(2dpf)斑馬魚(yú)靜脈注射長(zhǎng)春瑞濱建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制模型。分別溶于魚(yú)水給予肉蓯蓉提取物和陽(yáng)性對(duì)照藥小檗胺，提取物的濃度為500μg/ml，小檗胺的濃度為1.9μg/ml；同時(shí)設(shè)置模型對(duì)照組以及正常對(duì)照組(不做任何處理)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為30尾斑馬魚(yú)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理至3dpf時(shí)，對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)進(jìn)行中性紅染色，染色4h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚(yú)在顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并保存圖片；利用圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞數(shù)量(n)，分別定量評(píng)價(jià)肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制的改善作用。供試品對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制的改善作用計(jì)算公式為：改善作用(％)＝(n供試品組/n模型對(duì)照組-1)×100％。計(jì)學(xué)分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗(yàn)，p＜0.05為顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞的改善作用

與模型對(duì)照組比較：**p＜0.01，***p＜0.001

由表2可知，正常對(duì)照組斑馬魚(yú)平均的巨噬細(xì)胞數(shù)量為26個(gè)，與模型對(duì)照組(15個(gè))比較，說(shuō)明斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制模型建立成功。陽(yáng)性藥物小檗胺濃度為1.9μg/ml時(shí)，平均的巨噬細(xì)胞數(shù)量為20個(gè)，與模型對(duì)照組(15個(gè))比較，對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制的改善作用為45.45％，說(shuō)明小檗胺濃度為1.9μg/ml時(shí)，對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制有顯著的改善作用。而肉蓯蓉提取物在濃度為500μg/ml時(shí)，平均的巨噬細(xì)胞數(shù)量為22個(gè)，63.64％，說(shuō)明本發(fā)明制備的肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞抑制有顯著的改善作用。

2肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：黑色素等位基因突變型albino品系斑馬魚(yú)，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，年齡為受精后2天(2dpf)。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ喊唏R魚(yú)靜脈注射墨汁建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞促進(jìn)模型。

實(shí)驗(yàn)步驟：對(duì)受精后2天(2dpf)斑馬魚(yú)靜脈注射墨汁建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞促進(jìn)模型。分別溶于魚(yú)水給予肉蓯蓉提取物和陽(yáng)性藥匹多莫德，肉蓯蓉提取物的濃度為2000μg/ml，匹多莫德的濃度為100μg/ml；同時(shí)設(shè)置模型對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為30尾斑馬魚(yú)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理至3dpf時(shí)，對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)進(jìn)行中性紅染色，染色4h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚(yú)在顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并保存圖片；利用圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞中的墨汁信號(hào)(n)，定量評(píng)價(jià)供試品對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用。供試品對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用計(jì)算公式為：促進(jìn)作用(％)＝(n供試品組/n模型對(duì)照組-1)×100％。計(jì)學(xué)分析采用方差分析和dunnett’st-檢驗(yàn)，p＜0.05為顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)吞噬墨汁的巨噬細(xì)胞的促進(jìn)作用

與模型對(duì)照組比較：**p＜0.01，***p＜0.001

由表3可知，陽(yáng)性藥物匹多莫德濃度為100μg/ml時(shí)，平均的已吞噬墨汁的巨噬細(xì)胞數(shù)量為3.4個(gè)，與模型對(duì)照組(1.5個(gè))比較，對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬的促進(jìn)作用為2.3倍，說(shuō)明匹多莫德濃度為100μg/ml時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著的促進(jìn)作用。肉蓯蓉提取物濃度為2000μg/ml時(shí)，平均的已吞噬墨汁的巨噬細(xì)胞數(shù)量為4.4個(gè)，與模型對(duì)照組(1.5個(gè))比較，對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬的促進(jìn)作用為2.9倍，說(shuō)明肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著的促進(jìn)作用。

生物活性實(shí)施例3(抗pm2.5活性)：

1評(píng)價(jià)肉蓯蓉提取物對(duì)pm2.5引起心血管毒性的改善作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1.野生型ab品系斑馬魚(yú)，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行。年齡為受精后2天，共150尾，每實(shí)驗(yàn)組為30尾。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ河胮m2.5處理2dpf野生型ab品系斑馬魚(yú)24h，建立pm2.5誘發(fā)的心血管毒性模型。

實(shí)驗(yàn)步驟：隨機(jī)選取150尾受精后2天(2dpf)野生型ab品系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均處理30尾斑馬魚(yú)，水溶給予pm2.5誘發(fā)斑馬魚(yú)心血管毒性評(píng)價(jià)模型。分別水溶給予肉蓯蓉提取物，濃度為2000μg/ml，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組(養(yǎng)魚(yú)用水處理斑馬魚(yú))和模型對(duì)照組，每孔(實(shí)驗(yàn)組)容量為3ml。分別與pm2.5共同處理24h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)心率(n)；另隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚(yú)血流視頻，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)血流速度(v)，根據(jù)心率和血流速度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)供試品對(duì)pm2.5引起心血管毒性的改善作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±se表示，供試品對(duì)pm2.5引起心血管毒性的改善作用計(jì)算公式為：1)對(duì)心率的增加作用：心率增加作用(％)＝(n模型對(duì)照組-n供試品組)/(n模型對(duì)照組-n正常對(duì)照組)×100％；2)對(duì)血流速度的影響：血流速度增加作用(％)＝(v供試品組-v模型對(duì)照組)/(v正常對(duì)照組-v模型對(duì)照組)×100％。用方差分析和dunnett’st-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05表明具有顯著性差異，結(jié)果如表4所示。

表4肉蓯蓉提取物對(duì)pm2.5引起心血管毒性的改善作用

與模型對(duì)照組比較，＊＊＊p＜0.001

由表4可知，模型對(duì)照組斑馬魚(yú)心率(128次/分鐘)與正常對(duì)照組(165次/分鐘)比較p＜0.001，表明模型建立成功。肉蓯蓉提取物在濃度為2000μg/ml時(shí)斑馬魚(yú)心率為152次/分鐘，心率增加作用為65％，與模型對(duì)照組比較，p＜0.001，表明肉蓯蓉提取物在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下對(duì)pm2.5引起的心率減慢有改善作用。模型對(duì)照組斑馬魚(yú)血流速度(540μm/s)與正常對(duì)照組(1064μm/s)比較p＜0.001，表明模型建立成功。肉蓯蓉提取物在濃度為2000μg/ml時(shí)斑馬魚(yú)血流速度為856μm/s，血流速度增加作用為60％，與模型對(duì)照組比較，p＜0.001，表明肉蓯蓉提取物在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下對(duì)pm2.5引起的血流速度減慢有改善作用。

2評(píng)價(jià)肉蓯蓉提取物對(duì)吞噬納米活性炭(pm2.5)的巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：黑色素等位基因突變型半透明albino品系斑馬魚(yú)，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行。年齡為受精后2天，共150尾，每實(shí)驗(yàn)組為30尾。

模型制作：將62.5mg/ml納米活性炭(pm2.5)作為納米顆粒，注射到2dpf斑馬魚(yú)血液循環(huán)中(相當(dāng)于人靜脈注射)，每尾斑馬魚(yú)注射10nl，即以625ng/尾劑量建立斑馬魚(yú)pm2.5吞噬模型。

實(shí)驗(yàn)方法：隨機(jī)選取150尾受精后2天(2dpf)黑色素等位基因突變型半透明albino品系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均處理30尾斑馬魚(yú)，靜脈注射給予納米活性炭建立斑馬魚(yú)納米活性炭吞噬模型。分別水溶給予肉蓯蓉提取物500μg/ml濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組(養(yǎng)魚(yú)用水處理斑馬魚(yú))和模型對(duì)照組，每孔(實(shí)驗(yàn)組)容量為3ml。供試品每天換液，處理2d后，加入中性紅溶液對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行活體染色16h，染色結(jié)束，在解剖顯微鏡下統(tǒng)計(jì)吞噬了納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量(s)，根據(jù)吞噬納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義來(lái)評(píng)價(jià)供試品對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±se表示，巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)作用計(jì)算公式為：巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)作用(％)＝(s供試品組-s模型對(duì)照組)/s模型對(duì)照組×100％。用方差分析和dunnett’st-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05表明具有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5肉蓯蓉提取物對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用

與模型對(duì)照組比較，＊＊＊p＜0.001

由表5可知，模型對(duì)照組吞噬納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量為12個(gè)，而肉蓯蓉提取物濃度為500μg/ml時(shí)吞噬納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量為21個(gè)，巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)作用為70％，與模型對(duì)照組比較，p＜0.001，由此可知肉蓯蓉提取物在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬有促進(jìn)作用。