本發(fā)明系關(guān)于一種治療或減緩自體免疫相關(guān)之疾病的醫(yī)藥組合物。
背景技術(shù):
:正常情況下,免疫系統(tǒng)可視為身體的防衛(wèi)軍,當(dāng)偵測(cè)到細(xì)菌、病毒等外來(lái)物質(zhì)的入侵時(shí),會(huì)產(chǎn)生抗體且攻打病菌。然而,當(dāng)免疫系統(tǒng)失調(diào)不再能精準(zhǔn)分辨敵我時(shí),則這支防衛(wèi)軍會(huì)反過頭攻擊自身的組織或器官,而引發(fā)了所謂的「自體免疫疾病(autoimmunedisease)」。自體免疫疾病的罹病機(jī)率約為全球人口的5%。而自體免疫疾病的型式可從單一器官的疾病,如橋本氏甲狀腺炎(hashimoto'sthyroiditis),至廣泛的全身性疾病,如全身性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,簡(jiǎn)稱sle)。此疾病之病理特征為,在發(fā)炎的組織或器官中可發(fā)現(xiàn)大量淋巴球的異常浸潤(rùn),以及在患者的血液中可偵測(cè)到自身抗體的存在。特定的自體免疫疾病系存在地域性,與人種、基因及環(huán)境皆可能相關(guān)。以多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis,簡(jiǎn)稱ms)而言,好發(fā)于祖先來(lái)自北歐的高加索人種,且好發(fā)于居住在高緯度的女性。目前研究顯示,多發(fā)性硬化癥是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自發(fā)性去髓鞘(demyelination)的長(zhǎng)期發(fā)炎疾病,且因受損的神經(jīng)不同,患者所發(fā)生的臨床病癥也不同,包括失去平衡、痙攣、手腳活動(dòng)困難、麻痹、及視力模糊等癥狀。而關(guān)于自體免疫疾病的致病機(jī)制,已有多篇研究指向干擾素(interferon)或腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor)的過量表現(xiàn)可能涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、克隆氏癥(crohn'sdisease)、或干癬性關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis)等免疫發(fā)炎相關(guān)疾病,近期的研究結(jié)果更顯示,由輔助型t細(xì)胞(thelpercells)所調(diào)控之介白素(interleukin),例如il-17,亦是主導(dǎo)自體免疫的重要細(xì)胞激素。過去用于治療自體免疫疾病的主要藥物包括:非類固醇抗發(fā)炎藥、類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑、及免疫抑制劑等。然而,這些藥物已知具有副作用風(fēng)險(xiǎn)之外,尚會(huì)衍生藥物間的交互作用。有鑒于此,新一代的治療藥物多采取免疫標(biāo)靶療法,針對(duì)自體免疫疾病特有的免疫訊息或分子來(lái)設(shè)計(jì)生物制劑(biologicalagents),而這些生物制劑可精確地瞄準(zhǔn)異常的免疫分子,卻不會(huì)傷害正常細(xì)胞。因此,目前亟需開發(fā)一種副作用低且具專一性的生物制劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明提供一種用于治療或減緩自體免疫相關(guān)疾病的醫(yī)藥組合物,包括草果(amomumtsao-ko)之萃取物為活性成分及藥學(xué)上可接受的載體或鹽類。本發(fā)明也提供一種用于治療或減緩與自體免疫相關(guān)之疾病的醫(yī)藥組合物,包括一化合物為活性成分及藥學(xué)上可接受的載體或鹽類,其中該化合物為香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或前述之組合。本發(fā)明還提供一種草果之萃取物用于制備治療或減緩與自體免疫相關(guān)之疾病的藥物的用途。本發(fā)明另提供一種化合物用于制備治療或減緩與自體免疫相關(guān)之疾病的藥物的用途,其中該化合物為香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或前述之組合。為了讓本發(fā)明之上述和其他目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂,下文特舉較佳實(shí)施例,并配合所附圖示,作詳細(xì)說明如下:附圖說明圖1顯示草果之萃取物he-06對(duì)于脂多糖(lipopolysaccharide,lps)所誘發(fā)之急性發(fā)炎balb/c小鼠模型之tnf-α分泌的抑制情形。**代表p值小于0.01。圖2a顯示草果之萃取物he-06對(duì)于實(shí)驗(yàn)性自主免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,eae)c57bl/6小鼠模型之eae發(fā)病病程的延緩情形,其中發(fā)病病程是以文獻(xiàn)上已公認(rèn)之a(chǎn)taxiascore及eaescore為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),透過連續(xù)14天每日觀察記錄所獲得的結(jié)果。其中*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。圖2b-圖2c分別顯示草果之萃取物he-06之進(jìn)一步經(jīng)減毒步驟所得之2015-0803-2及2015-0909-2萃取物對(duì)于eae小鼠模型之發(fā)病病程的影響,其中2015-0803-2及2015-0909-2萃取物接投予250mg/kg之劑量。其中**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。圖3a-圖3e分別顯示草果之萃取物he-06之活性分萃區(qū)間(i)對(duì)于eae急性發(fā)炎小鼠模型具緩解與改善的效果,包括延緩eae病程發(fā)展、改善eae病癥、改善頸椎脫髓鞘癥狀(demyelination)、以及減少整體脊髓產(chǎn)生脫髓鞘與軸突腫脹(axonalswelling)的情形。其中*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。圖4a-圖4c分別顯示草果之萃取物he-06之活性分萃區(qū)間(ii)對(duì)于lps所誘發(fā)急性發(fā)炎小鼠模型之tnf-α分泌的抑制情形、延緩eae小鼠模型之病程發(fā)展、以及減緩imq所誘導(dǎo)之類干癬皮膚炎之皮膚發(fā)炎病癥。其中*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。圖5a-圖5d分別顯示草果之萃取物he-06之活性成份tsaokoin(tk)可抑制el4淋巴癌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)炎后之il-17分泌、抑制lps所誘發(fā)急性發(fā)炎小鼠模型之tnf-α分泌、延緩eae小鼠模型之病程發(fā)展、以及減緩imq所誘導(dǎo)之類干癬皮膚炎之皮膚發(fā)炎病癥。其中*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。實(shí)施方式在本揭露之一態(tài)樣中,提供一種用于治療或減緩自體免疫相關(guān)之疾病的醫(yī)藥組合物,包括以草果(amomumtsao-ko,簡(jiǎn)稱a.tsao-ko)之萃取物為活性成分及藥學(xué)上可接受的載體或鹽類。上述草果為姜科豆蔻屬的多年生常綠草本植物,植物高度可達(dá)2.5-3米,生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶之蔭蔽潮濕的林中地帶,產(chǎn)地以中國(guó)云南及東南亞地區(qū)為主,人工栽培已有200多年歷史,不僅可作為藥材,且因全株有辛香味,其干燥后的果實(shí)也可作為調(diào)味料,為藥食兩用的素材。而上述草果之萃取物系萃取自草果的根部、莖、葉、花、果實(shí)、種子、樹皮或其組合。在一實(shí)施例中,上述草果之萃取物可萃取自草果的果實(shí)。上述草果之萃取物系由有機(jī)溶劑所萃取,所述有機(jī)溶劑可包括,醇類、酯類、烷類、鹵烷或其組合,但不限于此。上述醇類可以是c1-c12醇類(例如,甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、2-丁醇、第三丁醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、戊醇、異戊醇、2,3-戊二醇、2,4-戊二醇、環(huán)戊醇、己醇、環(huán)己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇等),上述酯類可以是c2-c5酸酯類(例如,乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸戊酯、丙酸戊酯等),上述烷類可以是c5-c6烷類(例如,正庚烷、正戊烷、環(huán)戊烷、正己烷、環(huán)己烷等),而上述鹵烷例如是氯甲烷、氯乙烷等,但不限于此。在一實(shí)施例中,上述草果之萃取物可由乙醇萃取而得。又一實(shí)施例中,草果之萃取物可由濃度為50-95%之乙醇萃取而得。其中,用以萃取草果萃取物之乙醇濃度可以為50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%。又一實(shí)施例中,用以萃取草果之萃取物之乙醇濃度可以是95%之乙醇。萃取之前,先計(jì)算當(dāng)次所使用的草果重量,接著,以有機(jī)溶劑的體積約為草果重量之3-10倍的比例進(jìn)行萃取。在一實(shí)施例中,有機(jī)溶劑的體積可以是草果重量之3-7倍。另一實(shí)施例中,有機(jī)溶劑的體積可為草果重量之5倍。而萃取時(shí),約控制萃取溫度為10-35℃,萃取時(shí)間為3-10天。在一實(shí)施例中,萃取溫度可為20-30℃,萃取時(shí)間可為5-8天。另一實(shí)施例中,萃取溫度可為25℃,萃取時(shí)間可為7天。在一實(shí)施例中,上述草果之萃取物的萃取過程還可配合一震蕩模式,此震蕩模式可包括水平震蕩、垂直震蕩、旋轉(zhuǎn)震蕩、周轉(zhuǎn)震蕩、翹板震蕩、超音波震蕩或其組合,但不限于此。以及,經(jīng)前述萃取過程所獲得之草果萃取液尚經(jīng)過一抽氣過濾步驟,并以取得之濾液作為草果之萃取物的試驗(yàn)物質(zhì),稱之為he-06。在一實(shí)施例中,上述草果之萃取物he-06還經(jīng)過一蒸餾的步驟。在另一實(shí)施例中,上述草果之萃取物he-06更經(jīng)過一以低極性溶劑進(jìn)行加熱回流的步驟。另,在一實(shí)施例中,上述以草果之萃取物he-06為活性成分之醫(yī)藥組合物具有抑制細(xì)胞激素分泌的功能,所述細(xì)胞激素可包括il-17、tnf-α或其組合,但不限于此。以及,在又一實(shí)施例中,上述以草果之萃取物he-06為活性成分之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩自體免疫相關(guān)疾病,所述治療或減緩自體免疫相關(guān)疾病可包括,但不限于緩解自體免疫相關(guān)疾病之癥狀、或延緩自體免疫相關(guān)疾病之病程。其中,所述自體免疫相關(guān)疾病可包括多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis,ms)、視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica,nmo)、急性彌漫性腦脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis,adem)、去髓鞘(demyelination)相關(guān)神經(jīng)炎、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、干癬(psoriasis)、干癬性關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,ra)、克隆氏癥(crohn'sdisease)、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis,jia)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,uc)、或此等疾病的組合,但不限于此等疾病。在一實(shí)施例中,上述以草果之萃取物he-06為活性成分之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩多發(fā)性硬化癥。在另一實(shí)施例中,上述以草果萃取物he-06為活性成分之醫(yī)藥組合物的投予方式可為口服、非口服、經(jīng)由吸入噴霧(inhalationspray)或藉由植入貯存器(implantedreservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮內(nèi)(intracutaneous)靜脈內(nèi)(intravenous)、肌肉內(nèi)(intramuscular)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intraarticular)動(dòng)脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(nèi)(intrasynovial)、胸骨內(nèi)(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(nèi)(intralesional)注射或灌注技術(shù),但不限于此。其中,口服的形式可包括,但不限定于,藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueoussuspensions)、分散液(dispersions)與溶液。在一實(shí)施例中,可經(jīng)由口服或皮下注射方式投予。另,也可在適當(dāng)期間內(nèi)依據(jù)藥學(xué)上的例行方法判定患者所適用的投藥療程對(duì)其進(jìn)行多重劑量的投藥。上述以草果之萃取物he-06為活性成分之醫(yī)藥組合物更包括此
技術(shù)領(lǐng)域:
中熟知的藥學(xué)上可接受之載體及/或鹽類,并以適當(dāng)比例添加。藥學(xué)上可接受之載體可包括,但不限于溶劑、分散媒(dispersionmedium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorptiondelaying)試劑等與藥學(xué)投予相容者。對(duì)于不同的給藥方式,可利用一般方法將藥學(xué)組合物配置成劑型(dosageform)。而藥學(xué)上可接受之鹽類可包括,但不限于鹽類包括無(wú)機(jī)陽(yáng)離子,例如,堿金屬鹽類,如鈉、鉀或胺鹽,堿土金族鹽類,如鎂、鈣鹽,含二價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子之鹽類,如鋅、鋁或鋯鹽。此外,也可是為有機(jī)鹽類,如二環(huán)己胺鹽類、甲基-d-葡糖胺,胺基酸鹽類,如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸酰胺。于本揭露之又一態(tài)樣中,另提供一種如上述之草果之萃取物用于制備治療或減緩與自體免疫相關(guān)之疾病的藥物的用途。在本揭露之另一態(tài)樣中,提供一種用于治療或減緩與自體免疫相關(guān)之疾病的醫(yī)藥組合物,包括一化合物為活性成分及藥學(xué)上可接受的載體或鹽類,所述化合物為香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合。其中,上述香草醛及草果素系來(lái)自于草果(a.tsao-ko)之萃取物he-06,而此草果之萃取物he-06是以有機(jī)溶劑體積/草果重量=3-10/1,于10-35℃經(jīng)3-10天震蕩所萃取而得。在一實(shí)施例中,上述由有機(jī)溶劑所萃取出之草果之萃取物he-06更經(jīng)過一蒸餾的步驟以去除精油部分,再以一低極性溶劑透過一加熱回流的步驟進(jìn)一步減毒且萃取出其中的活性成分。所述低極性溶劑可包括石油醚、c4-c9直鏈烷類(如正己烷(n-hexane)、正庚烷(n-heptane))、c4-c9環(huán)烷類、不飽和苯、酯類、酮類或前述之組合,但不限于此。而關(guān)于上述草果之萃取物之萃取部位、所使用之有機(jī)溶劑的種類、濃度與體積、以及萃取過程所采用的條件,包括其萃取溫度、時(shí)間、所配合的震蕩模式等,則如同上述說明所記載,于此不再贅述。在另一實(shí)施例中,上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合為活性成分之醫(yī)藥組合物系具有抑制細(xì)胞激素分泌的功能,所述細(xì)胞激素可包括il-17、tnf-α或其組合,但不限于此。在又一實(shí)施例中,上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合為活性成分之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩自體免疫相關(guān)疾病,所述治療或減緩自體免疫相關(guān)疾病可包括,但不限于緩解自體免疫相關(guān)疾病之癥狀、或延緩自體免疫相關(guān)疾病之病程。而所述自體免疫相關(guān)疾病包括多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis,ms)、視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica,nmo)、急性彌漫性腦脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis,adem)、去髓鞘(demyelination)相關(guān)神經(jīng)炎、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、干癬(psoriasis)、干癬性關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,ra)、克隆氏癥(crohn'sdisease)、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis,jia)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,uc)、或此等疾病的組合,但不限于此等疾病。在另一實(shí)施例中,上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合為活性成分之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩多發(fā)性硬化癥。又,在一實(shí)施例中,上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合活性成分之醫(yī)藥組合物的投予方式可包括,但不限于以口服、非口服、經(jīng)由吸入噴霧(inhalationspray)或藉由植入貯存器(implantedreservoir)的方式進(jìn)行投予。而關(guān)于口服的形式、非口服的形式、以及投藥療程,則如同上述說明所記載,于此不再贅述。上述以香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合活性成分之醫(yī)藥組合物更包括此
技術(shù)領(lǐng)域:
中熟知的藥學(xué)上可接受之載劑或鹽類,并以適當(dāng)比例添加。而關(guān)于藥學(xué)上可接受之載體或或鹽類的種類,亦如同上述說明所記載,于此不再贅述。因此,于本揭露之另一態(tài)樣中,可提供一種如上述之化合物用于制備治療或減緩與自體免疫相關(guān)之疾病的藥物的用途,其中此化合物為香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin)、或其組合。。實(shí)施例本揭露之具體實(shí)施方式說明如下,然而以下的實(shí)施例僅用于進(jìn)一步揭露本發(fā)明之技術(shù)內(nèi)容,不應(yīng)藉以限制本發(fā)明的范疇。實(shí)施例1:制備草果之萃取物he-06a.材料以草果之果實(shí)為藥材,經(jīng)清洗干凈并烘干后,初步以藥材粉碎機(jī)進(jìn)行粗粉碎。b.方法取500克上述草果之粗粉碎物,加入5倍體積(即2500ml)的95%乙醇,于25℃以震蕩器125rpm約震蕩7天,之后收取萃取液進(jìn)行抽氣過濾。接著,將過濾后之濾液定量,并取樣2ml進(jìn)行高效液相層析法(hplc)與薄膜層析法(tlc)之分析,其余濾液減壓濃縮至體積約30ml,爾后分裝且進(jìn)行冷凍干燥,即為本揭露之草果之萃取物的試驗(yàn)物質(zhì),將其稱之為he-06。實(shí)施例2:草果之萃取物he-06可抑制il-17分泌a.以el4(murinelymphoma)淋巴癌細(xì)胞平臺(tái)篩選(1)細(xì)胞培養(yǎng)el4為小鼠淋巴癌細(xì)胞,購(gòu)自食品工業(yè)發(fā)展研究所之生物資源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter,簡(jiǎn)稱bcrc),培養(yǎng)于包含有10%胎牛血清(fetalbovineserum,簡(jiǎn)稱fbs)之rpmi1640培養(yǎng)液中,并添加1.5g碳酸氫鈉(sodiumbicarbonate)、1mm丙酮酸鈉(sodiumpyruvate)、1x非必需氨基酸(non-essentialaminoacids,簡(jiǎn)稱neaa)、以及0.05mm硫醇基乙醇(2-mecaptoethanol,簡(jiǎn)稱2-me),培養(yǎng)方式則依據(jù)bcrc之建議,以每周2-3次繼代培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)。(2)il-17分泌及mtt測(cè)試于96孔盤中,每孔植入1x105el4淋巴癌細(xì)胞,并于實(shí)驗(yàn)組之各孔加入適當(dāng)濃度之10μl草果之萃取物he-06后,置入37℃且包含5%co2之細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。接著,添加丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,簡(jiǎn)稱pma或tpa)及離子霉素(ionomycin)作為誘導(dǎo)淋巴癌細(xì)胞活化之因子,使pma最終濃度為10ng/ml,而ionomycin最終濃度為5ng/ml,并繼續(xù)置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)。上述測(cè)試中,同時(shí)以添加pma(最終濃度10ng/ml)及ionomycin(最終濃度為5ng/ml)者作為對(duì)照組。其后,取出上述含el4細(xì)胞之96孔盤,以1200rpm離心5分鐘,先將上清液(supernatant)轉(zhuǎn)至新的96孔盤,原包含el4細(xì)胞之96孔盤中則于各孔加入5μl之5mg/mlmtt,先置于37℃、包含5%co2之細(xì)胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)1小時(shí)以產(chǎn)生結(jié)晶紫,再加入150μl之dmso將結(jié)晶紫溶出,之后檢測(cè)其570nm之吸光值,以評(píng)估細(xì)胞的存活率。而轉(zhuǎn)至新的96孔盤之上清液,則以mouseil-17elisakit(r&d,dy421e)檢測(cè)上清液中之il-17含量,所述上清液中之il-17含量即象征細(xì)胞所分泌之il-17量。上述il-17含量的檢測(cè)結(jié)果皆先以對(duì)照組為100%進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(normalization),之后計(jì)算草果之萃取物he-06抑制il-17分泌之ic50,結(jié)果如表一所示。b.以pbl(peripheralbloodleukocyte)大鼠周邊血白血球平臺(tái)篩選(1)細(xì)胞培養(yǎng)利用隱靜脈采血方式采集sd大鼠(spraguedawleyrat)之血液后置入含edta的離心管中(edta之最終濃度為2mg/ml)充份混合均勻,接著加入約4倍于血液與edta加總體積量之紅血球裂解液(acklysisbuffer或redbloodcelllysisbuffer)以破解紅血球細(xì)胞,期間置于37℃水浴中反應(yīng)5分鐘,再加入約4倍于血液、edta與紅血球裂解液加總體積量之緩沖液(pbsbuffer),以3000rpm離心5分鐘后去除上清液,且重復(fù)此破解紅血球細(xì)胞之步驟二次,而離心所得之沉淀部分即pbl,加入適量體積的rpmi細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。(2)抑制il-17分泌之測(cè)試于96孔盤中,每孔植入2x105pbl細(xì)胞,并于實(shí)驗(yàn)組之各孔加入適當(dāng)濃度之10μl草果之萃取物he-06后,置入37℃且包含5%co2之細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。接著,添加如上述之pma(最終濃度為10ng/ml)及ionomycin(最終濃度為5ng/ml)作為誘導(dǎo)白血球活化之因子,并繼續(xù)置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。上述測(cè)試中,同時(shí)以添加pma(最終濃度10ng/ml)及ionomycin(最終濃度為5ng/ml)者作為對(duì)照組。其后,取出上述含pbl細(xì)胞之96孔盤,以3000rpm離心5分鐘,先將上清液轉(zhuǎn)至新的96孔盤,原包含pbl細(xì)胞之96孔盤中則于各孔加入5μl之a(chǎn)lamarblue,先置于37℃、包含5%co2之細(xì)胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時(shí),再以elisareader于激發(fā)光560nm而發(fā)射光590nm進(jìn)行細(xì)胞存活率之檢測(cè)。而轉(zhuǎn)至新的96孔盤之上清液,則以ratil-17elisakit(ebioscience,88-7170)檢測(cè)上清液中之il-17含量。上述il-17含量的檢測(cè)結(jié)果皆先以對(duì)照組為100%進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,之后計(jì)算草果之萃取物he-06抑制il-17分泌之ic50,結(jié)果如表一所示。表一、he-06對(duì)于el4小鼠淋巴癌細(xì)胞及pbl大鼠周邊血白血球之抑制il-17分泌之ic50的效果由表一所示之活體外(invitro)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,草果之萃取物he-06可抑制經(jīng)pma及ionomycin誘導(dǎo)之el4淋巴癌細(xì)胞與pbl周邊血白血球之il-17分泌。實(shí)施例3:草果之萃取物he-06可抑制tnf-α分泌(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以購(gòu)自樂斯科生物科技股份有限公司(biolascotaiwanco.,ltd)之6-8周大balb/c公鼠進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。除飼養(yǎng)的條件皆符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范之外,此批公鼠自取得后即做標(biāo)示、分籠及秤重,并于一般區(qū)檢疫室進(jìn)行為期一周的檢疫工作,檢疫期間針對(duì)活動(dòng)力與環(huán)境適應(yīng)性做觀察,經(jīng)評(píng)估正常后即移入飼養(yǎng)區(qū)待實(shí)驗(yàn)執(zhí)行。飼養(yǎng)區(qū)之光照時(shí)間自動(dòng)控制為12小時(shí)亮、12小時(shí)暗,溫度控制為23±2℃。期間,小鼠皆可自由取得充分之食物及飲水。本品系小鼠已有豐富的參考資料及相關(guān)數(shù)據(jù)可證實(shí)其適用于發(fā)炎功能性的評(píng)估試驗(yàn)。以下所述發(fā)炎模式建立的實(shí)驗(yàn)方法并已獲得工研院iacuc委員會(huì)核準(zhǔn)。(2)建立小鼠急性發(fā)炎之模式上述小鼠于實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行秤重及分組,使各組平均體重?zé)o明顯差異。實(shí)驗(yàn)前2-4小時(shí),小鼠予以禁食,但仍正常供應(yīng)飲水。接著,以腹腔注射(ip)方式對(duì)每只小鼠投予1mg/kg脂多醣(lipopolysaccharide,簡(jiǎn)稱lps)的刺激(約0.25ml/mouse),實(shí)驗(yàn)組并于lps刺激之前2小時(shí)以口服方式投予草果之萃取物he-06,對(duì)照組則投予相同體積之溶劑,給藥后即持續(xù)觀察并紀(jì)錄小鼠的臨床癥狀。上述小鼠經(jīng)lps刺激1.5小時(shí)后,以過量co2執(zhí)行安樂死,并以心臟采血方式取得小鼠的全血。接著,以6000rpm于4℃離心10分鐘后收集血漿,以待進(jìn)行tnf-α分泌量之分析。(3)tnf-α分泌之檢測(cè)與分析血漿中tnf-α之分泌量系依照elisa套組所示如下步驟進(jìn)行分析。首先,在室溫下于96孔盤之每孔加入100μl之captureantibody混合液以覆蓋各孔的表面。隔夜后,吸干混合液并以每孔300μl之washbuffer清洗三次,接著,每孔加入200μl之blockbuffer于室溫下作用1小時(shí),并重復(fù)前述之清洗步驟。其后,每孔加入100μl之適當(dāng)稀釋倍數(shù)的待測(cè)樣品(上述血漿)及標(biāo)準(zhǔn)品,于室溫下作用2小時(shí),并重復(fù)前述清洗步驟。接著,于每孔加入100μl之detectionantibody混合液,于室溫下作用2小時(shí),并重復(fù)前述之清洗步驟。之后,每孔加入100μl之streptavidin-hrp混合液,先于室溫下避光作用20分鐘,重復(fù)前述之清洗步驟后,再于每孔中加入100μl之substratesolution(tmb),于室溫下再次避光作用20分鐘,最后于每孔加入50μl之stopsolution(1nhcl)終止顯色反應(yīng),并測(cè)定od450nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以所測(cè)試數(shù)據(jù)之平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(standarderror,簡(jiǎn)稱s.e.)來(lái)表示,并采用t-test統(tǒng)計(jì)比較各組間是否具差異性,以**代表p值小于0.01且表示兩組別之間存在統(tǒng)計(jì)上之顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。如圖1所示,草果萃取物he-06可抑制由lps所誘導(dǎo)急性發(fā)炎小鼠中tnf-α的分泌,且抑制程度可達(dá)34%,顯示草果萃取物he-06可于活體內(nèi)(invivo)有效抑制因發(fā)炎所引起的tnf-α分泌。實(shí)施例4:草果之萃取物he-06可延緩eae(experimentalautoimmuneencephalomyelitis)病程發(fā)展且改善eae臨床癥狀(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(thenationallaboratoryanimalcenter,tainan)之約8周大c57bl/6雌鼠進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。經(jīng)馴化、檢疫后,該批小鼠于實(shí)際執(zhí)行eae實(shí)驗(yàn)時(shí)之周齡約為10-12周。飼養(yǎng)區(qū)之光照時(shí)間自動(dòng)控制為12小時(shí)亮、12小時(shí)暗,溫度控制為23±2℃,且相對(duì)濕度控制為40-70%。期間,小鼠皆可自由取得充分之食物及飲水,但于eae發(fā)病后將于飼育籠的底部額外給予泡軟之飼料及洋菜膠果凍,以使發(fā)病的小鼠更易取食及補(bǔ)充水分。此外,該批小鼠于檢疫及實(shí)驗(yàn)期間皆由工研院之獸醫(yī)師及實(shí)驗(yàn)操作人員每日觀察及記錄其臨床癥狀,以確保實(shí)驗(yàn)小鼠的健康狀況。(2)建立小鼠自主免疫性腦脊膜炎(eae)之模式上述c57bl/6小鼠先以皮下注射內(nèi)含200μgmog35-55peptide和400μgmycobacteriumtuberculosish37ra之200μl乳化液,接著立刻以腹腔注射500ng之pertussistoxin,經(jīng)48小時(shí)后,再次以腹腔注射500ng之pertussistoxin,以誘導(dǎo)其發(fā)生eae。誘導(dǎo)后第7天起,每天觀察且記錄上述小鼠之eae臨床病癥,并依文獻(xiàn)上已公認(rèn)之a(chǎn)taxiascore(神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)分級(jí))及eaescore作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(ataxiascore及eaescore說明如下)。當(dāng)小鼠開始出現(xiàn)ataxiascore0++(即eaescore介于0-1之間)時(shí),以s型依序分組,且開始以草果萃取物he-06連續(xù)投予14天,期間每日觀察該批小鼠狀況且依eaescore記錄其臨床病癥,同時(shí)以僅投予溶劑者作為對(duì)照組。其后,于第15天將小鼠犧牲,并采集其血液與相關(guān)器官進(jìn)行后續(xù)分析。(3)ataxiascore及eaescore之記錄與數(shù)據(jù)分析ataxiascore之標(biāo)準(zhǔn)為:0+代表動(dòng)物行進(jìn)時(shí)后腳呈八字形,會(huì)左右搖擺且步態(tài)無(wú)法平衡;0++代表抓住動(dòng)物后頸部,觀察其尾巴是否可自行抬起,并以手指測(cè)試其尾巴張力強(qiáng)弱時(shí),其尾巴出現(xiàn)無(wú)法自主抬起且張力減弱情況。而eaescore之判斷標(biāo)準(zhǔn)為:score0代表無(wú)eae癥狀;score0.5代表尾巴短暫無(wú)力,有時(shí)可舉起;score1代表尾巴無(wú)力,無(wú)法正常舉起;score2代表尾巴癱瘓或輕微后肢無(wú)力;score3代表中度至嚴(yán)重的后肢癱瘓或輕微的前肢無(wú)力;score4代表完全的后肢癱瘓或中度至嚴(yán)重的前肢無(wú)力;score5代表四肢癱瘓伴隨失禁或呈現(xiàn)瀕死狀態(tài);score6代表動(dòng)物死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以所記錄分?jǐn)?shù)之平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(standarderrorofmean,簡(jiǎn)稱s.e.m.)來(lái)表示,并采用t-test統(tǒng)計(jì)比較各組間是否具差異性,其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001,且表示兩組別之間存在統(tǒng)計(jì)上之顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2a所示。如圖2a所示,經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生eae之小鼠于發(fā)病后14天之臨床病癥已呈現(xiàn)后肢癱瘓而前肢中重度無(wú)力(如上述score4),而經(jīng)投予草果之萃取物he-06者可顯著延緩eae病程發(fā)展,顯示草果之萃取物he-06可有效改善eae動(dòng)物模式之臨床癥狀。實(shí)施例5:he-06之活性分萃區(qū)間(i)的純化、制備與減毒測(cè)試將草果之萃取物he-06先以水蒸氣蒸餾24小時(shí)以去除精油部分,再以溶劑進(jìn)行加熱回流(reflux)約8小時(shí)以去除藥渣并減少毒性成份。以減少毒性成份步驟而言,如以溶劑{n-hexane:ethylacetate=1:1}進(jìn)行加熱回流8小時(shí),所得之萃取物稱之為2015-0803-2,而經(jīng)eae小鼠模式測(cè)試結(jié)果,以250mg/ml之2015-0803-2投予10只eae小鼠,雖可改善eae臨床癥狀(如第2b圖所示),但造成有3只小鼠死亡。而若改以低極性溶劑n-hexane進(jìn)行加熱回流8小時(shí),接著采梯度沖提法以n-hexane、etoac及meoh沖提萃取物(即,先利用沖提極性較低的溶劑將容易沖提的物質(zhì)分離,然后逐漸增加沖提極性高的溶劑量,以致于可將吸附較緊密的物質(zhì)自管柱中除去),以進(jìn)一步執(zhí)行硅膠管柱劃分(silicagelcolumnchromatography),各劃分部分并經(jīng)細(xì)胞活性評(píng)估測(cè)試后獲得其中最佳活性區(qū)間,其中所得萃取物稱之為2015-0909-2,而經(jīng)eae小鼠模式測(cè)試結(jié)果,以250mg/ml之2015-0909-2投予10只eae小鼠,除可改善eae臨床癥狀外(如第2c圖所示),并無(wú)造成小鼠死亡。其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。因此,后續(xù)以減毒效果較佳之萃取物2015-0909-2作為he-06之活性分萃區(qū)間(i)。實(shí)施例6:he-06之活性分萃區(qū)間(i)可改善eae臨床病癥除投予的藥物更換為he-06之活性分萃區(qū)間(i),而投藥濃度為he-06之活性分萃區(qū)間(i):0mg/ml(即對(duì)照組vehicle)、30mg/ml、100mg/ml之外,所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、小鼠自主免疫性腦脊膜炎(eae)之模式建立與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)皆同于上方記載,于此不再贅述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3a-圖3e所示,同時(shí)以投予相同體積之溶劑為對(duì)照組,且以投予5mg/ml之甲基培尼皮質(zhì)醇(methylprednisolone,為一類固醇藥物,可用于抗發(fā)炎)作為正對(duì)照組(positivecontrol)。如第3a與3b圖所示,經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生eae之小鼠于發(fā)病后14天的臨床病癥已呈現(xiàn)后肢癱瘓而前肢中重度無(wú)力(如score4),而經(jīng)投予he-06之活性分萃區(qū)間(i)30mg/ml及100mg/ml者具明顯延緩eae病程發(fā)展之功效。其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。又,透過luxolfastblue(lfb)染色來(lái)檢視神經(jīng)組織之髓鞘(myelin),髓鞘為包覆在神經(jīng)細(xì)胞軸突外面的管狀鞘,藉由髓鞘染色可用以觀察正常及病理情況下之髓鞘是否完整。如第3c圖之組織病理染色圖所示,he-06之活性分萃區(qū)間(i)可明顯改善eae動(dòng)物模式之頸椎脫髓鞘癥狀。另,依據(jù)shackelford等人所發(fā)表文獻(xiàn)中之組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重度評(píng)分(histopathologicallesionseverityscores)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢視脊髓的狀況,由病理獸醫(yī)師來(lái)分別評(píng)估脊髓包括頸椎(cervicalvertebrae)、胸椎(thoracicvertebrae)及腰椎(lumbarvertebrae)的組織病理分級(jí)及髓鞘損害的程度。其中,組織病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)共分為5個(gè)等級(jí):grade1代表出現(xiàn)最小損傷(整體損傷區(qū)域<1%);grade2代表出現(xiàn)輕微損傷(整體損傷區(qū)域約1-25%);grade3代表出現(xiàn)中度損傷(整體損傷區(qū)域約26-50%);grade4代表出現(xiàn)中度到重度損傷(整體損傷區(qū)域約51-75%);grade5代表出現(xiàn)重度損傷(整體損傷區(qū)域約76-100%)。觀察評(píng)分的結(jié)果如第3d與3e圖所示,經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生eae之小鼠于發(fā)病后14天之脊髓產(chǎn)生脫髓鞘(demyelination)及軸突腫脹(axonalswelling)的情形,而經(jīng)投予he-06之活性分萃區(qū)間(i)30mg/ml及100mg/ml者可顯著降低eae所引發(fā)的脊髓損傷程度,且所投予he-06之活性分萃區(qū)間(i)的藥效呈現(xiàn)劑量效應(yīng),顯示he-06之活性分萃區(qū)間(i)可有效改善eae動(dòng)物模式于臨床上之脊髓損傷癥狀。其中*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01。實(shí)施例7:he-06之活性分萃區(qū)間(ii)的純化與制備取2.19公斤he-06藥材,以16l甲醇加熱回流萃取2小時(shí),重復(fù)兩次以去除藥渣,之后合并兩次萃取液。接著濃縮兩次萃取液至100ml,加入1900ml水均勻分散萃取液,且將萃取液依序以正庚烷及乙酸乙酯分別萃取兩次。其后濃縮乙酸乙酯萃取液呈浸膏狀26.07克,并取乙酸乙酯浸膏21.27克進(jìn)行固相吸附萃取。接著,依序以80%正庚烷之乙酸乙酯溶液900ml、60%正庚烷之乙酸乙酯溶液1800ml、55%正庚烷之乙酸乙酯溶液3600ml、40%正庚烷之乙酸乙酯溶液900ml、乙酸乙酯900ml等溶液沖堤,并以每900ml/瓶方式收集且編號(hào)為no.1~9。其中no.3即為he-06之活性分萃區(qū)間(ii)。實(shí)施例8:he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可抑制il-17及tnf-α分泌(1)抑制il-17分泌之測(cè)試除將草果萃取物he-06更換為he-06之活性分萃區(qū)間(ii)之外,所使用之el4淋巴癌細(xì)胞、培養(yǎng)條件及檢測(cè)il-17分泌之方法皆同于上方記載,于此不再贅述,il-17分泌之檢測(cè)結(jié)果如表二所示。表二、he-06之活性分萃區(qū)間(ii)對(duì)于el4小鼠淋巴癌細(xì)胞之抑制il-17分泌之ic50的效果由表二所示之活體外(invitro)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可抑制活化之el4淋巴癌細(xì)胞之il-17分泌。(2)抑制tnf-α分泌之測(cè)試除將草果萃取物he-06更換為he-06之活性分萃區(qū)間(ii)之外,所使用之balb/c小鼠、飼養(yǎng)條件、小鼠急性發(fā)炎之模式及檢測(cè)tnf-α分泌之方法皆同于上方記載,于此不再贅述,tnf-α分泌之檢測(cè)結(jié)果如第4a圖所示。如第4a圖所示,he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可抑制由lps所誘導(dǎo)急性發(fā)炎小鼠中tnf-α的分泌,抑制程度約為16%,顯示he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可于活體內(nèi)(invivo)抑制因發(fā)炎所引起的tnf-α分泌。實(shí)施例9:he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可改善eae臨床病癥除投予的藥物更換為he-06之活性分萃區(qū)間(ii),而投藥濃度為he-06之活性分萃區(qū)間(ii):0mg/ml(即對(duì)照組vehicle)、30mg/ml、100mg/ml、300mg/ml之外,所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、小鼠自主免疫性腦脊膜炎(eae)之模式建立與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)皆同于上方記載,于此不再贅述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如第4b圖所示,同時(shí)以投予相同體積之溶劑作為對(duì)照組。如第4b圖所示,經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生eae之小鼠于發(fā)病后14天的eae臨床病癥已呈現(xiàn)score4之后肢癱瘓而前肢中重度無(wú)力病癥,而經(jīng)投予he-06之活性分萃區(qū)間(ii)30mg/ml、100mg/ml、300mg/ml者皆具延緩eae病程發(fā)展之功效,且呈現(xiàn)劑量效應(yīng),顯示he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可有效改善eae動(dòng)物模式之臨床病癥。其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。實(shí)施例10:he-06之活性分萃區(qū)間(ii)可減緩咪喹莫特(imiquimod,簡(jiǎn)稱imq)所誘導(dǎo)之類干癬皮膚炎(psoriasis-likedermatitis)(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以購(gòu)自樂斯科生物科技股份有限公司(biolascotaiwanco.,ltd)之約8周大balb/c公鼠進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。經(jīng)馴化、檢疫后,該批小鼠于實(shí)際執(zhí)行imq誘導(dǎo)類干癬皮膚炎實(shí)驗(yàn)時(shí)之周齡約為9-10周。飼養(yǎng)區(qū)之光照時(shí)間自動(dòng)控制為12小時(shí)亮、12小時(shí)暗,溫度控制為23±2℃,且相對(duì)濕度控制為40-70%。期間,小鼠皆可自由取得充分之食物及飲水,并由工研院之獸醫(yī)師及實(shí)驗(yàn)操作人員每日觀察及記錄其臨床癥狀,以確保實(shí)驗(yàn)小鼠的健康狀況。(2)建立小鼠類干癬皮膚炎之模式實(shí)驗(yàn)開始前,依據(jù)小鼠體重隨機(jī)分組,使各組平均體重及體重分布趨勢(shì)相近,且將小鼠背上的毛發(fā)剃除,剃除區(qū)域約4*2cm2,并于第0天開始,每日于每只小鼠之剃毛區(qū)域以涂敷方式于皮膚投予3.125mg咪喹莫特(imq),連續(xù)投予6天。同時(shí),依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以管喂(體積10ml/kg)或皮膚涂敷(約30~50mg/mouse)方式投予he-06之活性分萃區(qū)間(ii)或溶劑,投予時(shí)間同樣為6天,并于第6天時(shí)以過量co2犧牲小鼠。(3)皮膚發(fā)炎程度之記錄與數(shù)據(jù)分析上述皮膚發(fā)炎程度系以干癬面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasisareaandseverityindex,簡(jiǎn)稱pasi)為標(biāo)準(zhǔn),針對(duì)皮膚紅斑(erythema)、皮膚厚度(thickening)、及皺折皮屑(scaling)作相關(guān)分析,且依scale0-4層級(jí)作如下定義:scale0代表無(wú)明顯癥狀,scale1代表癥狀輕微,scale2代表呈現(xiàn)中度之上述癥狀,scale3代表已產(chǎn)生中重度之上述癥狀,而scale4代表已呈現(xiàn)重度之上述癥狀。將同一只小鼠所觀察記錄的指數(shù)進(jìn)行累加后,統(tǒng)計(jì)各組之平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(standarderrorofmean,簡(jiǎn)稱s.e.m.),并采用t-test比較各組間是否具差異性,以p值小于0.05表示兩組別之間存在統(tǒng)計(jì)上之顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如第4c圖所示。如第4c圖所示,經(jīng)imq誘導(dǎo)產(chǎn)生類干癬皮膚炎之小鼠于第2天已開始產(chǎn)生干癬皮膚炎之臨床癥狀,例如皮膚呈現(xiàn)紅斑、厚度不均、及皺折皮屑等臨床病癥,而經(jīng)投予he-06之活性分萃區(qū)間(ii)者可減緩imq所誘導(dǎo)之類干癬皮膚炎的皮膚病狀。其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01。實(shí)施例11:he-06之化合物活性成份香草醛(vanillin)、草果素(tsaokoin,tk)的分離與制備將草果萃取物he-06先以水蒸氣蒸餾24小時(shí)以去除精油部分,接著以低極性溶劑如n-hexane進(jìn)行加熱回流(reflux)約8小時(shí),之后采梯度沖提法以n-hexane、etoac及meoh沖提萃取物,并進(jìn)一步執(zhí)行硅膠管柱劃分,各劃分部分經(jīng)tlc分析,獲得各個(gè)草果之萃取物he-06之片段,并透過活性測(cè)試確認(rèn)出其中的活性片段。其后,自活性片段單離出2個(gè)化合物,并經(jīng)分析判斷此2個(gè)化合物為香草醛(vanillin)與草果素(tsaokoin)。接著,分別將含有香草醛或草果素成份之劃分部分各自合并,而獲得he-06之化合物活性成份香草醛與草果素。實(shí)施例12:活性成份tsaokoin(tk)可抑制il-17及tnf-α分泌(1)il-17分泌及mtt測(cè)試除將草果萃取物he-06更換為he-06之活性成份tsaokoin(tk)之外,所使用之el4淋巴癌細(xì)胞、培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)發(fā)炎方式、以及il-17分泌與mtt檢測(cè)方法皆同于上方記載,于此不再贅述,il-17分泌及mtt之檢測(cè)結(jié)果如第5a圖及表三所示。表三、活性成分tk對(duì)于el4小鼠淋巴癌細(xì)胞之抑制il-17分泌之ic50的效果試驗(yàn)樣品ic50(μg/ml)tsaokoin(tk)12.1由第5a圖所示之活體外(invitro)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,he-06之活性成份tsaokoin(tk)可抑制經(jīng)活化之el4淋巴癌細(xì)胞之il-17分泌。(2)抑制tnf-α分泌之測(cè)試除將草果萃取物he-06更換為tsaokoin(tk)之外,所使用之balb/c小鼠、飼養(yǎng)條件、小鼠急性發(fā)炎之模式及檢測(cè)tnf-α分泌之方法皆同于上方記載,于此不再贅述,tnf-α分泌之檢測(cè)結(jié)果如圖5b所示。如圖5b所示,he-06之活性成份tsaokoin(tk)可明顯抑制由lps所誘導(dǎo)急性發(fā)炎小鼠中tnf-α的分泌,顯示tk應(yīng)可于活體內(nèi)(invivo)抑制因發(fā)炎所引起的tnf-α分泌。其中以***代表p值小于0.001。實(shí)施例13:活性成份tsaokoin(tk)可改善eae臨床病癥除投予的藥物更換為he-06之活性成份tsaokoin(tk),而投藥濃度為tsaokoin:0mg/ml(即對(duì)照組vehicle)、30mg/ml、100mg/ml之外,所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、小鼠自主免疫性腦脊膜炎(eae)之模式建立與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)皆同于上方記載,于此不再贅述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5c所示,同時(shí)以投予相同體積之溶劑作為對(duì)照組。如圖5c所示,經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生eae之小鼠于發(fā)病后14天的eae臨床病癥已呈現(xiàn)score4之后肢癱瘓而前肢中重度無(wú)力病癥,而經(jīng)投予tsaokoin30mg/ml、100mg/ml者皆有延緩eae病程發(fā)展的趨勢(shì),且呈現(xiàn)劑量效應(yīng),顯示tsaokoin可有效改善eae動(dòng)物模式之臨床病癥。其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01;***代表p值小于0.001。實(shí)施例14:活性成份tsaokoin(tk)可減緩imq所誘導(dǎo)之類干癬皮膚炎除投予的藥物更換為he-06之活性成份tsaokoin(tk),而投藥濃度為tsaokoin100mg/ml之外,所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、類干癬皮膚炎之模式建立與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)皆同于上方記載,于此不再贅述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5d所示,同時(shí)以投予相同體積之溶劑作為對(duì)照組。如圖5d所示,經(jīng)imq誘導(dǎo)產(chǎn)生類干癬皮膚炎之小鼠于第2天已呈現(xiàn)重度皮膚紅斑、皮膚厚度不均、及產(chǎn)生皺折皮屑等臨床病癥,而經(jīng)投予tsaokoin者可明顯減緩imq所誘導(dǎo)之類干癬皮膚炎的皮膚炎病狀。其中以*代表p值小于0.05;**代表p值小于0.01。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上,然其并非用以限定本發(fā)明,任何熟習(xí)此技藝者,在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi),當(dāng)可作些許之更動(dòng)與潤(rùn)飾,因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視后附之權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12