本發(fā)明屬于免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)核病免疫診斷分子標(biāo)識及其制備疫苗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌是對人類健康威脅最大的病原體之一，結(jié)核病是當(dāng)今世界上成年人中的主要傳染病，已對國際公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。結(jié)核菌在感染人體以后，多處于潛伏狀態(tài)或持續(xù)感染狀態(tài)，它能在感染宿主細(xì)胞內(nèi)逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主達(dá)到一種微妙的平衡，感染者一生中的任何時候都有可能發(fā)病。一般情況下，10％的感染者將發(fā)展為活動性肺結(jié)核。一個未經(jīng)治療的活動性肺結(jié)核病人，一年能傳染10－15人。
近五十年來，結(jié)核病的控制理論與技術(shù)、臨床診斷治療水平與研究均有長足的進(jìn)步。由于有效化療藥物(異煙肼、利福平、吡嗪酰銨、鏈霉素、乙胺丁醇等)的普遍應(yīng)用和卡介苗在世界范圍的推廣，使得結(jié)核病的發(fā)病率曾一度降低，以至于人們樂觀地認(rèn)為，結(jié)核病將同天花一樣被人類徹底消滅。但在八十年代中期，由于過分樂觀的估計形勢，減少投資、縮減機(jī)構(gòu)，放松對結(jié)核病的治療與管理，結(jié)核病又在許多國家死灰復(fù)燃，發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)再次回升。1993年WHO宣布結(jié)核病處于“全球緊急狀態(tài)”，并呼吁“迅速采取行動與結(jié)核病危機(jī)進(jìn)行斗爭”，這在WHO歷史上發(fā)表這樣的聲明尚屬首次。耐藥及耐多藥結(jié)核病也已成為當(dāng)前結(jié)核病控制工作中的重大威脅。
結(jié)核病的預(yù)防狀況，WHO已將牛分枝桿菌卡介苗Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin(BCG)列入擴(kuò)大免疫計劃范疇。然而，針對肺結(jié)核的免疫保護(hù)作用的報道差異甚大，從0～80％不等。另外，隨著HIV感染的流行，已有報告AIDS病人接種BCG后引起全身播散性感染。
目前結(jié)核病毒診斷方法有：(一)痰菌檢查：痰涂菌檢查和痰結(jié)核菌檢查簡便易行，準(zhǔn)確性較高，痰中查出結(jié)核菌，就能確診患了結(jié)核病。一般初次就診要查三個痰標(biāo)本，即夜間痰、清晨痰和即時痰。它雖然是診斷肺結(jié)核“金指標(biāo)”但診斷率低，培養(yǎng)周期長。痰結(jié)核菌培養(yǎng)，結(jié)果可信度高，并能做結(jié)核菌藥敏試驗，但需時6－8周，應(yīng)用受到限制。(二)Ⅹ射線檢查：胸部Ⅹ線檢查可以早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病，而且可以確定病灶的部位、性質(zhì)、范圍，了解發(fā)病情況及用于治療效果的判斷，并且開展方便，病人樂于接受。胸部CT可以發(fā)現(xiàn)較小的或隱蔽部位的病變，可以彌補(bǔ)一般Ⅹ線檢查的不足。但容易與其他肺部疾病混淆，需要專業(yè)醫(yī)生確證。(三)肺結(jié)核病免疫學(xué)診斷：1.常用的有結(jié)核菌素純蛋白衍化物(PPD)試驗，該試驗陽性是感染過結(jié)核菌的證據(jù)之一，但是假陽性率高，容易誤診。2.血中、痰中結(jié)核抗體檢測陽性也有助于診斷，也容易出現(xiàn)假陽率。3.BACTEC法測結(jié)核分枝桿菌的代謝物，一般兩周可分離出分枝桿菌，但菌量多少能影響陽性結(jié)果出現(xiàn)的天數(shù)。4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，優(yōu)點是敏感性可達(dá)98％－100％，缺點是特異性較差。(四)其他檢查：只能作為輔助診斷，不能作為診斷依據(jù)。1.纖維支氣管鏡檢查，可以直接觀察或間接判斷支氣管、肺內(nèi)病變，并且有活組織檢查、灌洗、錄像、拍攝氣管內(nèi)照片等功能，對于診斷和鑒別診斷特別有用。2.胸腔鏡和縱隔鏡檢查，均可用于觀察胸腔、縱隔內(nèi)腫大淋巴結(jié)，并可取出活組織檢查以利診斷和鑒別診斷。3.超聲波檢查，主要用于胸腔積液的診斷和鑒別診斷。
因此，迫切需要能快速診斷結(jié)核病、高效能預(yù)防、控制結(jié)核病的手段。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，基于結(jié)核分枝桿菌H37Rv得到了兩個分離的多肽(蛋白)，分別命名為Rv0237和Rv1111c。并且本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這兩個多肽能夠作為抗原，在體液免疫反應(yīng)中具有較高的反應(yīng)強(qiáng)度，并且良好的靈敏度和特異性，具有用于制備抗結(jié)核藥物特別是抗結(jié)核疫苗的潛力。由此提供了下述發(fā)明：
本發(fā)明的一個方面涉及(分離的)多肽在制備抗結(jié)核病的藥物或者抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物中的用途，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
Rv0237蛋白的氨基酸序列：(359aa)
STTSGASPATPVAVPVPRSCAEPAGIPALLSPRDKLAQLLVVGVRDAADAQAVVTNYHVGGILIGSDTDLTIFDGALAEIVAGGGPLPLAVSVDEEGGRVSRLRSLIGGTGPSARELAQTRTVQQVRDLARDRGRQMRKLGITIDFAPVVDVTDAPDDTVIGDRSFGSDPATVTAYAGAYAQGLRDAGVLPVLKHFPGHGRGSGDSHNGGVTTPPLDDLVGDDLVPYRTLVTQAPVGVMVGHLQVPGLTGSEPASLSKAAVNLLRTGTGYGAPPFDGPVFSDDLSGMAAISDRFGVSEAVLRTLQAGADIALWVTTKEVPAVLDRLEQALRAGELPMSAVDRSVVRVATMKGPNPGCGR(SEQ ID NO:1)
Rv1111c蛋白的氨基酸序列：(185aa)
TALFDSIARKLSSLMTGDSDDDGGRRSAQRPARTRSRHARPPSEDNREPIAERRSRRRPRPQNDPHPRRNAHERPAPRSSRFDSYRSYQPSEPSGPAEPVNRYERRGARYQPYARYEPTYEPQRRRARPSEPTNPTHHPISQVRYRGSATRDARRDNYREEQRFDRRDRSRAPRRPPAESWEYDV(SEQ ID NO:2)
本發(fā)明的實施例2的實驗結(jié)果表明，Rv0237和Rv1111c三次實驗結(jié)果的平均反應(yīng)強(qiáng)度均大于2，且重復(fù)性好，可以應(yīng)用于制備抗結(jié)核病的藥物或者抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物，例如作為疫苗候選物
本發(fā)明的另一方面涉及(分離的)多核苷酸在制備抗結(jié)核病的藥物或者抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物中的用途，其中，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
編碼Rv0237的核酸序列：(1080bp)
TCGACGACCTCCGGCGCGTCGCCCGCAACTCCGGTAGCCGTTCCCGTGCCCCGGAGCTGCGCCGAGCCGGCGGGGATCCCGGCGCTGCTGTCCCCCCGTGACAAGCTGGCCCAGCTGCTGGTGGTCGGCGTGCGAGATGCTGCGGACGCCCAAGCCGTGGTCACCAACTACCACGTCGGCGGCATCCTCATCGGCAGCGACACCGACCTGACGATTTTTGACGGCGCGCTGGCCGAGATCGTTGCCGGCGGGGGTCCGCTGCCGCTGGCGGTGAGTGTCGACGAGGAAGGCGGGCGGGTGTCCCGGTTGAGGTCGCTGATCGGCGGTACGGGGCCGTCGGCCCGCGAACTGGCACAAACCCGAACCGTCCAGCAGGTGCGCGACTTGGCTCGAGACCGCGGCCGGCAGATGAGAAAGCTGGGTATCACCATCGACTTCGCCCCGGTGGTCGACGTCACCGACGCCCCGGATGACACGGTGATCGGGGACCGGTCGTTCGGCTCGGATCCGGCTACGGTCACCGCGTATGCCGGGGCGTACGCGCAGGGTCTGCGCGATGCCGGGGTGCTGCCGGTGCTCAAGCATTTCCCCGGTCACGGGCGTGGCTCGGGTGATTCGCACAACGGGGGTGTCACGACACCACCGCTTGATGACCTGGTGGGCGATGACCTGGTGCCCTACCGAACGCTGGTGACCCAGGCGCCGGTCGGTGTGATGGTGGGTCATCTGCAGGTTCCTGGGTTGACCGGCTCCGAGCCGGCCAGTCTGAGCAAGGCCGCGGTGAACCTGCTGCGCACCGGCACGGGATACGGCGCACCGCCGTTCGATGGTCCAGTGTTCAGCGACGACCTCTCTGGTATGGCCGCGATCTCAGACCGGTTTGGCGTCAGCGAGGCGGTGTTGCGCACCTTGCAAGCCGGTGCCGATATCGCACTGTGGGTTACCACCAAAGAGGTGCCCGCGGTGCTGGACCGCCTGGAACAGGCGCTGCGCGCCGGTGAATTGCCGATGTCGGCGGTCGACCGGTCGGTGGTGCGGGTGGCGACCATGAAGGGGCCCAACCCGGGGTGTGGCCGTTAG(SEQ ID NO:3)
編碼Rv1111c的核酸序列：(555bp)
ACGGCTCTGTTCGACAGCATCGCCAGGAAGCTCAGCTCGCTGATGACCGGCGATTCGGACGACGACGGCGGCCGGCGGTCGGCCCAGCGGCCTGCCCGTACTCGTTCCCGACACGCCCGACCCCCGTCGGAGGACAACCGCGAACCCATAGCCGAGCGTCGATCGCGCCGCCGCCCTAGGCCGCAGAATGATCCGCACCCGCGCCGCAATGCCCACGAACGGCCGGCACCGCGCAGCAGCCGCTTCGATTCTTACCGCAGCTACCAGCCGTCCGAACCCTCCGGGCCTGCCGAGCCCGTCAACCGGTACGAACGTCGGGGTGCTCGATACCAGCCCTATGCGCGCTACGAGCCCACCTACGAGCCCCAACGCCGACGCGCCCGTCCCAGCGAGCCAACCAACCCGACACACCATCCGATCTCGCAGGTCCGCTACCGCGGGTCAGCTACTCGCGACGCGCGGCGGGACAACTACCGCGAGGAGCAGCGGTTCGATCGGCGGGATCGTTCGCGGGCACCGCGCAGACCACCGGCTGAATCCTGGGAATACGACGTC(SEQ ID NO:4)
本發(fā)明的再一方面涉及重組載體在制備抗結(jié)核病的藥物或者抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物中的用途，其中，所述重組載體含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
本發(fā)明的再一方面涉及宿主細(xì)胞在制備抗結(jié)核病的藥物或者抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物中的用途，其中，所述宿主細(xì)胞含有重組載體，所述重組載體含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
本發(fā)明的再一方面涉及多肽在制備診斷結(jié)核病的藥物或者檢測結(jié)核分枝桿菌的藥物中的用途，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本發(fā)明的再一方面涉及多核苷酸在制備診斷結(jié)核病的藥物或者檢測結(jié)核分枝桿菌的藥物中的用途，其中，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
根據(jù)上面的任一項所述的用途，其中，所述結(jié)核病為肺結(jié)核。
根據(jù)上面的任一項所述的用途，其中，所述結(jié)核分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌H37Rv。
本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
本發(fā)明的再一方面涉及一種疫苗組合物，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽，以及疫苗用輔料例如佐劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疫苗組合物為疫苗制劑。
本發(fā)明的再一方面涉及一種預(yù)防和/或治療結(jié)核病例如肺結(jié)核的方法，包括給予受試者(例如接種)有效量的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽、本發(fā)明的藥物組合物或者本發(fā)明的疫苗組合物的步驟。
給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應(yīng)，所用的具體多肽，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
可改變藥物組合物中各活性成分(多肽)的實際劑量水平，以便所得的活性成分的量能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體多肽的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，給藥劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。
在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
術(shù)語“分離的”或“被分離的”指的是，從天然狀態(tài)下經(jīng)人工手段獲得的。如果自然界中出現(xiàn)某一種“分離”的物質(zhì)或成分，那么可能是其所處的天然環(huán)境發(fā)生了改變，或從天然環(huán)境下分離出該物質(zhì)，或二者情況均有發(fā)生。例如，某一活體動物體內(nèi)天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態(tài)下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術(shù)語“分離的”或“被分離的”不排除混有人工或合成的物質(zhì)，也不排除存在不影響物質(zhì)活性的其它不純物質(zhì)。
術(shù)語“載體(vector)”是指，可將多核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等?？捎米鬏d體的動物病毒包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可以含有多種控制表達(dá)的元件，包括但不限于，啟動子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指，可用于導(dǎo)入載體的細(xì)胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等的真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等的昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞或人細(xì)胞等的動物細(xì)胞。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的輔料”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80；離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。
術(shù)語“佐劑”是指非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)其與抗原一起或預(yù)先遞送入機(jī)體時，其可增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實驗中使用較多。
術(shù)語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防疾病(例如結(jié)核病特別是肺結(jié)核)有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病(例如結(jié)核病特別是肺結(jié)核)的發(fā)生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。
術(shù)語“疾病和/或病癥”是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所述疾病和/或病癥有關(guān)。
術(shù)語“受試者”可以指患者或者其它接受本發(fā)明藥物組合物以治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。
術(shù)語“結(jié)核桿菌”，包括但不限于，例如，結(jié)核分枝桿菌；術(shù)語“結(jié)核分枝桿菌”包括但不限于，結(jié)核分枝桿菌H37Rv。
術(shù)語“抗結(jié)核病”包括但不限于預(yù)防和/或治療結(jié)核病。
術(shù)語“結(jié)核病”，包括但不限于，例如由“結(jié)核桿菌”感染引起的疾病和/或病癥，例如肺結(jié)核。
發(fā)明的有益效果
體液免疫實驗表明，作為抗原，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的蛋白具有良好的靈敏度和特異性，并且反應(yīng)強(qiáng)度顯著高于陽性對照38kDa，具有應(yīng)用于制備抗結(jié)核藥物例如抗結(jié)核疫苗的潛力。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
下面的實施例1－3中，如果沒有特別說明，使用的蛋白樣品為Rv0237蛋白以及Rv1111c蛋白；其可以人工化學(xué)合成得到，也可以由相應(yīng)的編碼核苷酸序列通過重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞表達(dá)純化得到。其中，編碼Rv0237的核酸序列和編碼Rv1111c的核酸序列可以克隆自結(jié)核分枝桿菌H37Rv或人工化學(xué)合成得到。
實施例1：質(zhì)譜鑒定實驗
1.實驗材料和儀器
目標(biāo)蛋白樣品：制備的Rv0237蛋白(SEQ ID NO:1)以及Rv1111c蛋白(SEQ ID NO:2)。
儀器：Ultimate 3000Nano-LC system(Dionex,USA)、線性離子阱多級串聯(lián)質(zhì)譜儀(linear trap quadruple，LTQ)，Orbitrap Velos mass spectrometer(Thermo Scientific,Germany)。
數(shù)據(jù)處理軟件：MassLynx version 4.1(Dionex,USA)，Xcalibur software v2.2.6(Thermo)，MASCOT version 2.2(Matrix Sciences,UK)。
2.實驗方法
(1)目標(biāo)蛋白進(jìn)行SDS PAGE后，去離子水沖洗膠片15分鐘；切下目的片段，1－2mm大??；放到蛋白低吸附的離心管中，用100μL的ddH2O在碟子里沖洗膠粒并重復(fù)一次，棄去液體，加入40μL的(ACN)/ddH2O(50/50)，棄去液體，孵育15分鐘；棄去液體，加入100μL 100mM碳酸氫銨，孵育15分鐘，再加入100μL乙氰，孵育15分鐘；重復(fù)以上步驟；取出所需膠量(根據(jù)估測各取10μg)；加入200μLACN脫水，5分鐘，棄去；真空干燥樣品30分鐘，樣品必須非常干燥。
(2)還原蛋白和烷基化：在樣品中加入40μL10mM二硫蘇糖醇1M貯存液(DTT，1M)/100mM碳酸氫銨，使膠粒完全沒入液體中，56℃水浴45分鐘，取出樣品放涼。
(3)立即加入40μL 55mM碘乙酰胺(IAA1M貯存液)/100mM碳酸氫銨室溫孵育30分鐘，避光。
(4)洗滌：棄去膠粒中的溶液，加入100mM碳酸氫銨40μL，孵育15分鐘；加入40μL乙腈，孵育15分鐘；棄去液體，加入100μL ACN干燥5分鐘，棄去；真空干燥樣品30分鐘。
(5)胰蛋白酶消化蛋白：加入10μL胰蛋白酶溶液(足量，胰蛋白酶和蛋白的質(zhì)量比為1：10)，4℃孵育45分鐘(冰浴)。37℃孵育過夜(12－16小時)；
(6)抽提蛋白：吸取上清，放入低吸附蛋白離心管中，在膠片上加入20μL的25mM碳酸氫銨，孵育15分鐘；加入等量的CAN使之成1:1溶液Ambic/ACN，孵育15分鐘；重復(fù)以上步驟；吸取上清，保存，在膠片上加入20μL的5％的甲酸，孵育15分鐘；加入等量的ACN，孵育15分鐘；吸取上清，保存，吸取上清，保存；加入0.1M DTT使蛋白的終濃度為1mM。徹底干燥，30℃大約1小時；用5％的甲酸重新溶解，使終濃度為500fmol/μL，
(7)除鹽：用ZipTip c18除鹽(www.merckmillipore.com,Germany)按說明書進(jìn)行。
(8)上樣：樣品上樣體積10μL加6μL到分離柱C18precolumn(Symmetry C18,5μm,180μm X 20mm)，用5％的乙腈(含0.05％甲酸以10μL/min的流速洗脫5分鐘,上樣到C-18分析柱(Waters ACQUITY UPLC BEH130C18,1.7μm,100μm X 100mm)恒溫35℃。洗脫鹽梯度從5％到35％，帶陽性的肽通過電噴霧進(jìn)行分析，噴霧電壓為2.0kV。通過Orbitrap(m/z＝445.120025)實時獲取MS數(shù)據(jù)(m/z 300-1,800,R＝60,000at m/z 400)。原始數(shù)據(jù)通過Xcalibur software v2.2.6(Thermo)獲取。肽段到蛋白搜索軟件MASCOT version 2.2，搜索數(shù)據(jù)庫:3,988 entries of H37Rv genome and 247known contaminant protein sequences，搜索參數(shù)和修飾：max missed cleavage:1；固定修飾:Carbamidomethylation(C)；可變修飾:Oxidation(M)；Carbamyl(N-term),Deamidated(NQ)；Precursor ion mass tolerance:±50ppm；fragment mass tolerance:±0.6Da.High peptide confidence(p<0.01)and the false positive rate(FPR)was controlled at under 1％,missed cleavages permitted:2。
3.實驗結(jié)果
見下面的表1和表2。
表1：質(zhì)譜鑒定蛋白信息表
注：PSMs：peptide spectrum matches(肽譜符合數(shù))
表2：鑒定蛋白二級質(zhì)譜后肽信息表
注：PSMs：peptide spectrum matches(肽譜符合數(shù))
表1的實驗結(jié)果表明，表1中每項蛋白都是唯一的蛋白，與NCBI原始序列比對，蛋白得分值和覆蓋率都很很高，符合鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
表2是鑒定出的氨基酸序列和得分情況，每一個蛋白都有二十多條肽段被鑒定出來，符合大于2條肽段相符即為該蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，其他各項都說明肽的正確性和各個標(biāo)準(zhǔn)(一般鑒定出的肽多于兩條就無需質(zhì)譜圖了)。由此可見，制得的蛋白為確為H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株蛋白。
實施例2：體液免疫實驗
體液免疫抗原能與體內(nèi)產(chǎn)生的專一性的結(jié)合，阻止它感染正常細(xì)胞，并與巨噬細(xì)胞結(jié)合，使巨噬細(xì)胞吞噬抗原，達(dá)到消菌的目的，因此體液免疫反應(yīng)強(qiáng)度高的蛋白同樣可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，達(dá)到免疫保護(hù)作用。
1.實驗材料
蛋白樣品：Rv0237蛋白以及Rv1111c蛋白。陽性對照38kDa(Immuno Diagnostics Inc.USA)。
主要試劑：鼠源二抗高通量試劑盒，PS-MK15 Wes-Mouse 12-230 kDa master kit with split buffer for 200 data(Immuno Diagnostics Inc.USA)。鏈霉素標(biāo)記羊抗人IgG，Thermo Scientific,Germany)。
2.實驗原理和方法
采用Western Blot方法。Western Blot技術(shù)是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，傳統(tǒng)的方法是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結(jié)合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結(jié)合，第一抗體與膜上特異抗原結(jié)合后，再用標(biāo)記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測?，F(xiàn)有的新儀器protein simple(請參見http://www.proteinsimple.com/)完全可以替代傳統(tǒng)的方法，并且用使用試劑和抗原等都是微量進(jìn)行，并且有專用的試劑盒，節(jié)省時間，規(guī)范實驗步驟，定量準(zhǔn)確。
38kDa(Rv0934,GenBank登錄號為：NC_000962.2，gi:15608080)最為常用，是最早發(fā)展的商用診斷試劑盒抗原。對活動性肺結(jié)核的診斷非常有效，其缺點是對不同人群的靈敏度波動較大，尤其對涂片陰性結(jié)核患者和合并HIV感染的結(jié)核患者效果較差。它是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于膜結(jié)合脂蛋白，含量高于BCG(牛分枝桿菌卡介苗，Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin)10倍，也是目前最為常用的結(jié)核診斷抗原之一。在用于結(jié)核病血清學(xué)檢測時，Wilkinson等用38kD抗原檢測肺結(jié)核病人血清，其靈敏度和特異性分別為65.6％和95.8％。因此本實驗用38kDa作為陽性對照，檢測表達(dá)抗原的抗原體液免疫效果。
實驗方法按照試劑盒說明書給定的方法進(jìn)行，具體步驟如下：
(1)樣品準(zhǔn)備
分別將目標(biāo)蛋白樣品和陽性對照38kDa(Immuno Diagnostics Inc.USA)，按照500ng/μl稀釋蛋白樣品加入5x蛋白上樣緩沖液。
一抗制備：
A.選擇臨床檢查90位ESAT-6陽性的肺結(jié)核病人，抽取抗凝血，離心取上清，每人200微升混合。按照每100μl血漿:100微克大腸桿菌粉末的比例，加入預(yù)先制備好的大腸桿菌粉末，混勻，4℃孵育過夜。離心收取上清，再用磁珠吸附方法去除血清中的雜蛋白。按照和原液血漿等體積用抗體稀釋液1:100倍稀釋，待用。
其中，所用大腸桿菌粉末參考如下方法制備：
接種E.coli BL21(DE3)至100mL LB培養(yǎng)基中，220rpm，37℃培養(yǎng)過夜，次日收集菌體；10mL PBS重懸E.coli BL21(DE3)菌體，再加入40mL預(yù)冷的丙酮，4℃條件下充分混勻；12000rpm，4℃離心10min收集菌體，使用丙酮洗滌兩次；取出菌體放在干凈的紙上待其自然風(fēng)干備用。
B.磁珠吸附IgG處理方法
磁珠處理方法：
250μL ddH2O洗滌50μL磁珠，500μL IgG Binding buffer(20mM Na3PO4，pH7.5)平衡50μL磁珠。
磁珠處理血清：
已處理磁珠(50μL)加入500μL血清混勻，室溫孵育30min，分鐘，然后置于磁力架上，棄上清。
50μL磁珠加入250μL 0.1M Gly-Hcl pH為2.7洗脫緩沖液洗脫，收集上清，使IgG與磁珠分離，收集上清。
在收集的上清中加入60μL Tris-Hcl pH為9.0中性緩沖液中和至PH為7.0，分裝-80℃保存，可用于體液免疫實驗。
二抗準(zhǔn)備：鏈霉素標(biāo)記羊抗人IgG，用抗體稀釋液進(jìn)行1:200倍稀釋。
(2)上樣
按照assay plate(25x6)要求進(jìn)行。A行分別加入抗原(5μl)，A行第一孔為系統(tǒng)對照，其他孔為樣品孔。在樣品孔加入一孔5μl的38kDa為陽性對照，其他孔為加入5μl蛋白樣品，B行為10μl的一抗稀釋液，C行為一抗，加入稀釋后一抗即10μl血清，第一孔為抗體稀釋液，D行為二抗，加入二抗(10μl)，第一孔為鏈霉素過氧化物酶，E行加入10μl系統(tǒng)發(fā)光過氧化混合物，F(xiàn)行空白。再加入三行(3x5)洗液500μl，洗去未結(jié)合的一抗及二抗，離心10分鐘，去掉氣泡，待上樣。
(3)上機(jī)
打開compass software v2.7，打開wes界面，設(shè)定方法采用儀器默認(rèn)設(shè)定程序：毛細(xì)管電泳時間是25min，電泳時電壓為375伏，抗體稀釋時間5min，一抗、二抗孵育時間均為30min，洗板時間系統(tǒng)默認(rèn)。打開capillary cartridge支撐架，放入apillary cartridge，撕掉assay plate的封口膜，關(guān)門。點擊開始按鈕開始運(yùn)行機(jī)器。機(jī)器會自動運(yùn)行并進(jìn)行圖片收集和反應(yīng)強(qiáng)度取值。
調(diào)整系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)分子量，之后在edit下的analysis菜單下調(diào)節(jié)曝光時間，在edit下copy選擇圖片格式保存圖片。程序設(shè)定好后，在file下點擊保存整個運(yùn)行文件。可以輸出反應(yīng)強(qiáng)度的峰值面積，然后計算靶蛋白和陽性對照的峰面積比，作為反應(yīng)強(qiáng)度。陽性對照38kDa的反應(yīng)強(qiáng)度視為1。
實驗完成后再重復(fù)2次。
3.實驗結(jié)果
如下面的表3所示。
表3：反應(yīng)強(qiáng)度結(jié)果
由表3可見，Rv0237和Rv1111c三次實驗結(jié)果的平均反應(yīng)強(qiáng)度均大于2，且重復(fù)性好，可以作為疫苗候選物。
盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所
<120> 一種結(jié)核病免疫診斷分子標(biāo)識及其制備疫苗的應(yīng)用
<130> 1602
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 359
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 1
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1 5 10 15
Pro Arg Ser Cys Ala Glu Pro Ala Gly Ile Pro Ala Leu Leu Ser Pro
20 25 30
Arg Asp Lys Leu Ala Gln Leu Leu Val Val Gly Val Arg Asp Ala Ala
35 40 45
Asp Ala Gln Ala Val Val Thr Asn Tyr His Val Gly Gly Ile Leu Ile
50 55 60
Gly Ser Asp Thr Asp Leu Thr Ile Phe Asp Gly Ala Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Gly Pro Leu Pro Leu Ala Val Ser Val Asp Glu Glu
85 90 95
Gly Gly Arg Val Ser Arg Leu Arg Ser Leu Ile Gly Gly Thr Gly Pro
100 105 110
Ser Ala Arg Glu Leu Ala Gln Thr Arg Thr Val Gln Gln Val Arg Asp
115 120 125
Leu Ala Arg Asp Arg Gly Arg Gln Met Arg Lys Leu Gly Ile Thr Ile
130 135 140
Asp Phe Ala Pro Val Val Asp Val Thr Asp Ala Pro Asp Asp Thr Val
145 150 155 160
Ile Gly Asp Arg Ser Phe Gly Ser Asp Pro Ala Thr Val Thr Ala Tyr
165 170 175
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225 230 235 240
Gly His Leu Gln Val Pro Gly Leu Thr Gly Ser Glu Pro Ala Ser Leu
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260 265 270
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275 280 285
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