本發(fā)明屬于日用化妝品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種面膜，特別是涉及一種基因重組超氧化物歧化酶面膜。

背景技術(shù)：

面膜是一種特殊的美容化妝品，涂敷于面部皮膚形成一層薄膜，將皮膚與外界隔離開，面膜中的有效成分可滲入皮膚，起滋潤皮膚、增加營養(yǎng)、促進(jìn)皮膚技能和新陳代謝作用，從而使面部皮膚潔白、柔軟、舒爽，保持青春活力。目前，市售的面膜制品按其形態(tài)分為膏狀、液體狀、啫膠和粉狀。從組成成分看，中藥面膜居多，而活性蛋白面膜較為少見。

超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase，SOD)是生物體防御氧化損傷的一種十分重要的生物酶。由于SOD具有清除體內(nèi)氧自由基的能力，能較好地抵御氧自由基和基他氧化物自由基對細(xì)胞質(zhì)膜的毒性，在機(jī)體保護(hù)方面起重要作用。國內(nèi)外已用SOD治療氧中毒、老年性白內(nèi)障、糖尿病、心血管疾病、各種炎癥等多種疾??；SOD還可作為輻射防護(hù)劑，用于輔助放療與化療以及腎、肝、心臟等器官的保護(hù)和移植，以降低大劑量輻射所引起的副作用。加入SOD的化妝品，在皮膚表層能抑制氧自由基的強(qiáng)氧化作用，有效的清除自由基，從而起美白防曬、防止皮膚衰老、祛斑、去粉刺、抗皺、抗炎的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對目前市場上的面膜以中藥面膜居多，活性蛋白面膜較少，且效果不理想的問題，提供了一種可美白防曬抗衰老的基因重組超氧化物歧化酶面膜。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該面膜由基因重組超氧化物歧化酶凍干粉和溶媒組成，使用時將基因重組超氧化物歧化酶凍干粉完全溶解于溶媒后浸濕面膜紙即可。

上述的基因重組超氧化物歧化酶凍干粉是在無菌條件下將基因重組超氧化物歧化酶溶于含甘露醇的磷酸鹽緩沖液中并凍干制備而成，基因重組超氧化物歧化酶與含甘露醇的磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量-體積比為0.04g～0.06g:1mL，其中所述的基因重組超氧化物歧化酶的氨基酸序列為：ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

上述的溶媒的組成是：每100mL溶媒包含0.02～0.06g分子量為120～150萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.035～0.05g分子量為20～40萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.1～0.3g羥乙基纖維素、0.4～0.6g三甲基甘氨酸、4～6mL乳酸鈉、3～5mL甘油、2～4mL山梨醇、0.04～0.06g EDTA-2Na，其余為磷酸鈉緩沖液。

本發(fā)明面膜使用時優(yōu)選將基因重組超氧化物歧化酶與溶媒按質(zhì)量-體積比為0.30g～0.45g:100mL混合均勻后浸濕面膜紙。

上述含甘露醇的磷酸鹽緩沖液的pH值是6.5～7.2，其中磷酸鹽的濃度是4.5～6.0mmol/L、甘露醇的濃度為2～5g/100mL，優(yōu)選pH值是7.0、磷酸鹽的濃度是5mmol/L、甘露醇的濃度為3g/100mL。

上述溶媒的組成進(jìn)一步優(yōu)選：每100mL溶媒包含0.04g分子量為120～150萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.045g分子量為20～40萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.18g羥乙基纖維素、0.5g三甲基甘氨酸、5mL乳酸鈉、4mL甘油、3mL山梨醇、0.05g EDTA-2Na，其余為磷酸鈉緩沖液，所述磷酸鈉緩沖液的pH值是6.5～7.2、濃度是4.5～6.0mmol/L，優(yōu)選磷酸鈉緩沖液的pH值是7.0、濃度是5mmol/L。

本發(fā)明的基因重組超氧化物歧化酶面膜的制備方法為：

1、制備基因重組超氧化物歧化酶凍干粉

在無菌條件下，將基因重組超氧化物歧化酶完全溶解于含甘露醇的磷酸鹽緩沖液中，采用孔徑為0.22μm的水相過濾器過濾后滅菌、分裝、凍干，得到基因重組超氧化物歧化酶凍干粉。

2、制備溶媒

將透明質(zhì)酸鈉、低分子透明質(zhì)酸鈉、羥乙基纖維素加入磷酸鈉緩沖液中，在50～70℃攪拌均勻，向所得混合液中加入三甲基甘氨酸、乳酸鈉、甘油、山梨醇、EDTA-2Na，攪拌均勻，分裝后121℃滅菌30分鐘，得到溶媒。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明基因重組超氧化物歧化酶面膜具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明采用生物工程技術(shù)改造畢赤酵母，通過大規(guī)模發(fā)酵、表達(dá)及純化制備成基因重組超氧化物歧化酶，其純度高、活性高、完全性好且成本較低。

2、本發(fā)明將基因重組超氧化物歧化酶制備成凍干粉，與溶媒分開保存，保證了基因重組超氧化物歧化酶的活性，克服了活性蛋白在水溶液中長時間保存易于降解失活的不足，且不含防腐劑。采用含甘露醇的磷酸鹽緩沖液可以起到保護(hù)超氧化物歧化酶活性的作用，同時凍干后，可以使凍干粉中超氧化物歧化酶均勻分散，均一性高。

3、本發(fā)明采用的溶媒各組分之間具有協(xié)同效果，在溶解基因重組超氧化物歧化酶凍干粉時更有利于分散溶解，制成面膜之后，在使用時能促進(jìn)皮膚對營養(yǎng)的吸收，并能夠更長時間的保持超氧化物歧化酶的活性。

4、本發(fā)明采用的基因重組超氧化物歧化酶與人體內(nèi)的超氧化物歧化酶是一致的，其生物同源性、生物相容性、生物安全性均較好，且具有抗氧化作用，在皮膚表層能抑制氧自由基的強(qiáng)氧化作用，有效的清除自由基，從而起防止皮膚衰老、抗皺、抗炎的效果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

下面實(shí)施例中所用基因重組超氧化物歧化酶的制備方法為：根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，全基因合成超氧化物歧化酶融合蛋白并在其兩端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)XhoⅠ和EcoRⅠ，其核苷酸序列為：CTCGAGAAAAGAGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGA CAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAAGAATTC，命名為HE-SOD；對載體pPIC9K(載體購于美國Invitrogen公司)、HE-SOD進(jìn)行XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接pPIC9K與HE-SOD，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為pPIC9K-HE-SOD，經(jīng)內(nèi)切酶線性化，與制備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻，電擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)MD板篩選、G418板篩選，獲得高表達(dá)陽性克隆，經(jīng)過進(jìn)一步搖瓶試驗(yàn)篩選出基因重組超氧化物歧化酶高表達(dá)菌株作為種子，經(jīng)過大罐發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵液經(jīng)分離純化后得到有活性的基因重組超氧化物歧化酶，其氨基酸序列為：ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

實(shí)施例1

1、制備基因重組超氧化物歧化酶凍干粉

將3g甘露醇加入100mL pH值是7.0、濃度是5mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，然后在無菌條件下，加入5g基因重組超氧化物歧化酶中，采用孔徑為0.22μm的水相過濾器進(jìn)行過濾，濾液在121℃下滅菌30分鐘，然后分裝到無菌的西林瓶中，每瓶1mL，整個操作過程在超凈臺中無菌完成，分裝完畢后用凍干機(jī)依次在-40℃下預(yù)凍2h、-20℃冷凍干燥8h、-10℃冷凍干燥8h、0℃冷凍干燥8h，然后在10℃干燥8h、20℃干燥8h，得到基因重組超氧化物歧化酶凍干粉。

2、制備溶媒

將0.05g分子量為120萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.04g分子量為20萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.15g羥乙基纖維素加入100mL pH值是7.0、濃度是5mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，在60℃攪拌均勻，向所得混合液中加入0.45g三甲基甘氨酸、4.5mL乳酸鈉、5mL甘油、3.5mL山梨醇、0.045g EDTA-2Na，攪拌均勻，分裝后121℃滅菌30分鐘，得到溶媒，分裝于15mL西林瓶中，每瓶13.5mL，121℃滅菌30分鐘。

使用時，取基因重組超氧化物酶凍干粉一支、溶媒一瓶，用注射器吸取溶媒加入凍干粉中，使凍干粉完全溶解，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜紙上，浸濕面膜紙即可。

實(shí)施例2

1、制備基因重組超氧化物歧化酶凍干粉

將3g甘露醇加入100mL pH值是7.0、濃度是5mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，然后在無菌條件下，加入4g基因重組超氧化物歧化酶中，采用孔徑為0.22μm的水相過濾器進(jìn)行過濾，濾液在121℃下滅菌30分鐘，然后分裝到無菌的西林瓶中，每瓶1mL，整個操作過程在超凈臺中無菌完成，分裝完畢后用凍干機(jī)依次在在-40℃下預(yù)凍2h、-20℃冷凍干燥8h、-10℃冷凍干燥8h、0℃冷凍干燥8h，然后在10℃干燥8h、20℃干燥8h，得到基因重組超氧化物歧化酶凍干粉。

2、制備溶媒

將0.04g分子量為130萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.045g分子量為20萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉、0.18g羥乙基纖維素加入100mLpH值是7.0、濃度是5mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，在60℃攪拌均勻，向所得混合液中加入0.5g三甲基甘氨酸、5mL乳酸鈉、4mL甘油、3mL山梨醇、0.05g EDTA-2Na，攪拌均勻，分裝后121℃滅菌30分鐘，得到溶媒，分裝于15mL西林瓶中，每瓶13.5mL，121℃滅菌30分鐘。

使用時，取基因重組超氧化物酶凍干粉一支、溶媒一瓶，用注射器吸取溶媒加入凍干粉中，使凍干粉完全溶解，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜紙上，浸濕面膜紙即可。

核苷酸或氨基酸序列表

[0001]

序列表

<110> 陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司

<120>一種基因重組超氧化物歧化酶面膜

<160> 2

<210> 1

<211> 480

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CTCGAGAAAA GAGCGACGAA GGCCGTGTGC GTGCTGAAGG GCGACGGCCC 50

AGTGCAGGGC ATCATCAATT TCGAGCAGAA GGAAAGTAAT GGACCAGTGA 100

AGGTGTGGGG AAGCATTAAA GGACTGACTG AAGGCCTGCA TGGATTCCAT 150

GTTCATGAGT TTGGAGATAA TACAGCAGGC TGTACCAGTG CAGGTCCTCA 200

CTTTAATCCT CTATCCAGAA AACACGGTGG GCCAAAGGAT GAAGAGAGGC 250

ATGTTGGAGA CTTGGGCAAT GTGACTGCTG ACAAAGATGG TGTGGCCGAT 300

GTGTCTATTG AAGATTCTGT GATCTCACTC TCAGGAGACC ATTGCATCAT 350

TGGCCGCACA CTGGTGGTCC ATGAAAAAGC AGATGACTTG GGCAAAGGTG 400

GAAATGAAGA AAGTACAAAG ACAGGAAACG CTGGAAGTCG TTTGGCTTGT 450

GGTGTAATTG GGATCGCCCA ATAAGAATTC 480

<210> 2

<211> 153

<212> PRT

<213>人工序列

<400>2

Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys 30

Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe 45

His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala 60

Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys 75

Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp 90

Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser 105

Leu Ser Gly Asp His Cls Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His 120

Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr 135

Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly 150

Ile Ala Gln 153