本發(fā)明涉及一種生物制劑及其生產(chǎn)工藝，具體地說，涉及一種采用黃芪多糖制備的抗新城疫病毒的生物制劑及其生產(chǎn)工藝，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新城疫是由新城疫病毒感染所得。不同品種和各種年齡的家禽都可感染，發(fā)病率高，死亡率可達(dá)90%以上，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)主要病原之一。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于禽類病毒病的化學(xué)藥物主要是金剛烷胺和利巴韋林制劑，臨床療效不確切，而且存在如殘留、影響蛋禽產(chǎn)蛋率恢復(fù)等毒副作用。業(yè)界近年來一直關(guān)注生物制品對(duì)禽類抗病毒作用的研究；黃芪多糖是目前研究較多的抗病毒成分。
黃芪多糖是從黃芪中提取的有效活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗衰老、抗氧化等多方面的藥理活性。值得注意的是，黃芪多糖的抗病毒作用已被越來越多的研究證實(shí)；研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過誘導(dǎo)動(dòng)物體產(chǎn)生干擾素，使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白而抑制病毒的繁殖，可用于新城疫病毒性傳染病的治療，但療效卻不穩(wěn)定。
目前研究表明：黃芪多糖硫酸化或磷酸化分子修飾后，能提高抵抗新城疫病毒感染的能力。硫酸化修飾常用三種方法：濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法和三氧化硫二甲基甲酰胺法。磷酸化修飾常用三聚磷酸鈉一三偏磷酸鈉法。以上方法是先將一定量的多糖，與硫酸化試劑和磷酸化試劑混合，再按照一定的條件進(jìn)行反應(yīng)，然后加入終止試劑進(jìn)行終止反應(yīng)，最后通過透析、濃縮、醇沉、冷凍干燥后獲得產(chǎn)物；但這種修飾物的改善作用并不顯著。
現(xiàn)有技術(shù)存在以下缺陷：黃芪多糖以及黃芪多糖的修飾物抵抗新城疫病毒的效果均不理想。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)以上不足，本發(fā)明提供一種采用黃芪多糖制備的抗新城疫病毒的生物制劑及其生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)以下發(fā)明目的：
1、采用本發(fā)明工藝，通過發(fā)酵提高黃芪多糖制劑的抗病毒活性；
2、提高本發(fā)明生物制劑抗病毒活性的穩(wěn)定性。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
一種采用黃芪多糖制備的抗新城疫病毒的生物制劑，所述的生物制劑抗病毒活性達(dá)2.89×105～1.05×106 IU/ml。
以下是對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：
一種采用黃芪多糖制備的抗新城疫病毒的生物制劑的生產(chǎn)工藝：
包括菌株活化、種子液的培養(yǎng)、發(fā)酵液的培養(yǎng)、制得生物制劑步驟。
所述的發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括黃芪多糖。
所述的發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：以去離子水為介質(zhì)，黃芪多糖2～8g/L、麥芽糖1～3 g/L、蠶蛹粉5～15g/L和無水氯化鈣1～3g/L。
所述的發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：以去離子水為介質(zhì)，黃芪多糖5 g/L，麥芽糖3 g/L，蠶蛹粉10 g/L，無水氯化鈣1 g/L。
所述的發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟，發(fā)酵溫度為28～34℃，發(fā)酵液PH為6～7.5，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為120～240 r/min，發(fā)酵時(shí)間為16～28 h。
所述的菌株活化：采用的菌種為地衣芽孢桿菌。
所述的種子液的培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為35～38℃，培養(yǎng)時(shí)間為16～20h，振蕩轉(zhuǎn)速為200～220rpm。
所述的制得生物制劑步驟：發(fā)酵液在10000～12000r/min條件下離心分離8～10min，得到的上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾，制得生物制劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明制備的生物制劑，抗病毒活性較黃芪多糖提高了948～3541倍，抗病毒活性達(dá)2.89×105～1.05×106 IU/ml；
2、本發(fā)明制備的生物制劑，抗病毒活性穩(wěn)定性高，存放12個(gè)月后產(chǎn)品抗病毒活性依然沒有減弱；
3、本發(fā)明制備的生物制劑，對(duì)預(yù)防雞新城疫病毒性疾病的有效保護(hù)率達(dá)到100%；
4、本發(fā)明制備的生物制劑，對(duì)治療雞初期新城疫的有效率為95%；
5、本發(fā)明工藝操作簡(jiǎn)單，環(huán)保無毒；
6、本發(fā)明工藝采用的原材料成本低廉，而且全發(fā)酵過程條件可控，不受外部環(huán)境條件限制，適合工業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌菌種，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號(hào)CICC21886。
本發(fā)明所述的黃芪多糖，購(gòu)自四川恒瑞通達(dá)公司。
實(shí)施例1 一種采用黃芪多糖制備抗新城疫病毒的生物制劑的工藝
步驟1、菌株活化
取1支地衣芽孢桿菌凍干粉加入1ml LB液體培養(yǎng)基中，搖勻后，取菌液進(jìn)行LB培養(yǎng)基平板劃線，活化培養(yǎng)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h；
所述LB液體培養(yǎng)基的組分如下：以去離子水為介質(zhì)，胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L和氯化鈉10 g/L；
所述LB固體培養(yǎng)基的組分如下：以去離子水為介質(zhì)，胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L和瓊脂18 g/L。
步驟2、種子液的培養(yǎng)
將活化后的地衣芽孢桿菌，使用無菌的接種環(huán)挑取單菌落，接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的三角瓶中，
所述三角瓶的規(guī)格為250ml中；即裝液量為三角瓶容量的1/5；
所述種子培養(yǎng)基組成如下：以去離子水為介質(zhì)，胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L和氯化鈉10 g/L；
將三角瓶放入培養(yǎng)箱中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速為200rpm，得到種子液。
步驟3、發(fā)酵液的培養(yǎng)
（1）制備發(fā)酵培養(yǎng)基
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：以去離子水為介質(zhì)，黃芪多糖3 g/L、葡萄糖2 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L和氯化鈉1 g/L。
（2）發(fā)酵
調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為7；
將步驟2得到的種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，種子液接種比為1：10；三角瓶裝液量為70ml；
所述三角瓶的規(guī)格為250ml；
在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液。
步驟4、制得生物制劑
將制得的發(fā)酵液，10000 r/min條件下離心分離10min，得到菌體和上清液。上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾后，得到生物制劑。
對(duì)照組1 未經(jīng)發(fā)酵的黃芪多糖溶液；
對(duì)照組2生物制劑的制備方法與實(shí)施例1相同，只改變發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：
以去離子水為介質(zhì)，葡萄糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L和氯化鈉1 g/L。
經(jīng)試驗(yàn)，制備的生物制劑的抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果見表1；
表1 生物制劑的抗病毒活性
由表1可知，采用本實(shí)施例工藝制備生物制劑的抗病毒活性為2.89×105IU/ml，生物制劑的抗病毒活性較黃芪多糖提高948倍。
本發(fā)明采用細(xì)胞病變抑制法的CEF/VSV系統(tǒng)檢測(cè)生物制劑的抗病毒活性，進(jìn)而計(jì)算出樣品的效價(jià)，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版。
實(shí)施例2 發(fā)酵培養(yǎng)基采用的碳源種類單因素分析實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例1的工藝制備生物制劑，只改變發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中：發(fā)酵培養(yǎng)基采用的碳源種類，進(jìn)行實(shí)施例2-5；
實(shí)施例1采用的發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為3g/L黃芪多糖+2 g/L葡萄糖；
實(shí)施例2-5采用的發(fā)酵培養(yǎng)基碳源見表2；
表2 實(shí)施例2-5采用的發(fā)酵培養(yǎng)基碳源
經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例2-5制備的生物制劑的抗病毒活性見表3；
表3 實(shí)施例2-5制備的生物制劑的抗病毒活性
由表2、3可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源種類優(yōu)選為黃芪多糖和麥芽糖。
實(shí)施例6發(fā)酵培養(yǎng)基采用的氮源種類單因素分析實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例1的工藝制備生物制劑，只改變發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中：發(fā)酵培養(yǎng)基采用的氮源種類，進(jìn)行實(shí)施例6-9；
實(shí)施例1采用的發(fā)酵培養(yǎng)基氮源為蛋白胨；
實(shí)施例6-9采用的發(fā)酵培養(yǎng)基氮源見表4；
表4 實(shí)施例6-9采用的發(fā)酵培養(yǎng)基氮源
經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例6-9制備的生物制劑的抗病毒活性見表5；
表5 實(shí)施例6-9制備的生物制劑的抗病毒活性
由表4、5可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源種類優(yōu)選為蠶蛹粉。
實(shí)施例10發(fā)酵培養(yǎng)基采用的無機(jī)鹽種類單因素分析實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例1的工藝制備生物制劑，只改變發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中：發(fā)酵培養(yǎng)基采用的無機(jī)鹽種類，進(jìn)行實(shí)施例10-16；
實(shí)施例1采用的發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽為1 g/L磷酸氫二鉀+1 g/L氯化鈉；
實(shí)施例10-16采用的發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽見表6；
表6 實(shí)施例10-16采用的發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽
經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例10-16制備的生物制劑的抗病毒活性見表7；
表7 實(shí)施例10-16制備的生物制劑的抗病毒活性
由表6、7可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的無機(jī)鹽種類優(yōu)選為無水氯化鈣。
實(shí)施例17 一種采用黃芪多糖制備抗新城疫病毒的生物制劑的工藝
步驟1、菌株活化
步驟2、種子液的培養(yǎng)
步驟1、2與實(shí)施例1的操作方法相同。
步驟3、發(fā)酵液的培養(yǎng)
（1）制備發(fā)酵培養(yǎng)基
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：以去離子水為介質(zhì)，黃芪多糖3 g/L、麥芽糖2 g/L、蠶蛹粉10 g/L和無水氯化鈣2 g/L。
（2）發(fā)酵
調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為7；
將步驟2得到的種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，種子液接種比為1：10；三角瓶裝液量為70ml；
所述三角瓶的規(guī)格為250ml；
在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液。
步驟4、制得生物制劑
將制得的發(fā)酵液，10000 r/min條件下離心分離10min，得到菌體和上清液。上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾后，得到生物制劑。
經(jīng)檢測(cè)，生物制劑產(chǎn)品的抗病毒活性為5.78×105 IU/ml。
實(shí)施例18發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量的正交試驗(yàn)
采用實(shí)施例17的工藝制備抗病毒生物制劑，只改變發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的含量，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表8，正交試驗(yàn)結(jié)果見表9；
表8 正交試驗(yàn)因素水平表
表9正交試驗(yàn)結(jié)果與分析
從表8和表9可以看出，影響因素A-D中，對(duì)生物制劑活性影響程度由大到小為黃芪多糖＞麥芽糖＞蠶蛹粉＞無水氯化鈣；
經(jīng)試驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量?jī)?yōu)選為：黃芪多糖5 g/L，麥芽糖3 g/L，蠶蛹粉10 g/L，無水氯化鈣1 g/L。
在此條件下制備的生物制劑，抗病毒活性為8.16×106 IU/ml。
實(shí)施例19發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中的發(fā)酵條件正交試驗(yàn)
采用實(shí)施例17的工藝制備抗病毒生物制劑，只改變發(fā)酵液的培養(yǎng)步驟中的發(fā)酵條件，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表10，正交試驗(yàn)結(jié)果見表11；
表10 正交試驗(yàn)因素水平表
表11 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析
從表10和表11可以看出，影響因素A-E中，對(duì)生物制劑活性影響程度由大到小為裝液量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵液PH＞發(fā)酵轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵時(shí)間；
經(jīng)試驗(yàn)，發(fā)酵條件優(yōu)選為發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵液PH 6，轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間28 h，裝液量70 ml；
在此條件下制備生物制劑的效果為：活性為9.78×105IU/ml
實(shí)施例20 一種采用黃芪多糖制備抗新城疫病毒的生物制劑的工藝
步驟1、菌株活化
步驟2、種子液的培養(yǎng)
步驟1、2與實(shí)施例1的操作方法相同。
步驟3、發(fā)酵液的培養(yǎng)
（1）制備發(fā)酵培養(yǎng)基
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：以去離子水為介質(zhì)，黃芪多糖5 g/L，麥芽糖3 g/L，蠶蛹粉10 g/L，無水氯化鈣1 g/L。
（2）發(fā)酵
調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6；
將步驟2得到的種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，所述三角瓶的規(guī)格為250ml；
種子液接種比為1：10；三角瓶裝液量為70ml，即三角瓶容量的7/25；
在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速160rpm條件下培養(yǎng)28h，得到發(fā)酵液。
步驟4、制得生物制劑
將制得的發(fā)酵液，10000 r/min條件下離心分離10min，得到菌體和上清液。上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾后，得到生物制劑。
在此條件下制備生物制劑的效果為：活性為1.08×106IU/ml，生物制劑的抗病毒活性較未發(fā)酵的黃芪多糖提高3541倍。
對(duì)生物制劑抗病毒穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，取生物制劑樣品分別存放3、6、9、12個(gè)月，并檢測(cè)其抗病毒活性，檢測(cè)結(jié)果見表12；
表12 存放一定時(shí)間后生物制劑的抗病毒活性
從表12可見，本發(fā)明方法制備的生物制劑不但具備較強(qiáng)的抗病毒活性，而且穩(wěn)定性好，存放12個(gè)月后生物制劑效價(jià)仍能達(dá)到為1.05×106 IU/ml。
生物制劑在預(yù)防新城疫中的應(yīng)用：
選擇13日齡、健康的不帶病原體的雞，隨機(jī)分成三組，即對(duì)照組A、對(duì)照組B、試驗(yàn)組C；每組30只，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)組；
對(duì)照組A：給予正常的飲用水，不加生物制劑，連續(xù)飲用7天；
對(duì)照組B：給予含黃芪多糖的飲用水，將濃度為0.5%的黃芪多糖與水按1：20的體積比混合；現(xiàn)配現(xiàn)用，在0.5h～1.5h內(nèi)飲完，連續(xù)飲用7天；
試驗(yàn)組C：給予含生物制劑的飲用水，將本發(fā)明生物制劑與水按1：20的體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，最好控制在0.5h～1.5h內(nèi)飲完，連續(xù)飲用7天；
三組雞在同一條件下飼養(yǎng)，控制雞舍溫度28-31℃，雞舍濕度58-62%。每
日向各個(gè)雞舍提供等量的足量飼料和水；
飼養(yǎng)第3天開始，三組動(dòng)物統(tǒng)一投喂等量含新城疫病毒的飼料，含病毒飼料的投喂量占飼料總量的1/2；三組動(dòng)物的飲水方式如上述進(jìn)行，每天記錄每組雞發(fā)病情況，具體見表13；
表13 每組雞的發(fā)病情況
如表13所示，對(duì)照組A雞的發(fā)病率為100%，累計(jì)死亡率為80%，對(duì)照組B雞的發(fā)病率為53.3%，累計(jì)死亡率為33.3%；而實(shí)驗(yàn)組C雞沒有發(fā)病和死亡，說明本發(fā)明生物制劑對(duì)預(yù)防雞新城疫病毒性疾病的有效保護(hù)率達(dá)到100%。
生物制劑在治療新城疫中的應(yīng)用：
選擇5日齡、患有初期（感染1天內(nèi)）新城疫的雞，隨機(jī)分成三組，分別為對(duì)照組1、對(duì)照組2、試驗(yàn)組3；每組20只，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)組；
對(duì)照組1：給予正常的飲用水，不加生物制劑；
對(duì)照組2：給予含黃芪多糖的飲用水，將濃度為0.5%的黃芪多糖與水按1：20的體積比混合；現(xiàn)配現(xiàn)用，在0.5h～1.5h內(nèi)飲完，連續(xù)飲用7天；
試驗(yàn)組3：給予含生物制劑的飲用水，將本發(fā)明生物制劑與水按1：20的體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，最好控制在0.5h～1.5h內(nèi)飲完，連續(xù)飲用7天。
三組動(dòng)物在同一條件下飼養(yǎng)，控制雞舍溫度28-31℃，雞舍濕度58-62%。每日向各個(gè)雞舍提供等量的足量飼料和水；
三組動(dòng)物的飲水方式如上述進(jìn)行，每天記錄每組雞發(fā)病情況，具體見表14；
表14 每組雞的發(fā)病情況
如表14所示，對(duì)照組1和對(duì)照組2雞的累計(jì)死亡率分別達(dá)到95%和45%，實(shí)驗(yàn)組3的累計(jì)死亡率約為5%，表明本發(fā)明生物制劑具有較強(qiáng)的抗病毒治療作用，有效的降低死亡率，對(duì)治療雞初期新城疫的有效率為95%。
實(shí)施例21 一種采用黃芪多糖制備抗新城疫病毒的生物制劑的工藝
步驟1、菌株活化
步驟2、種子液的培養(yǎng)
步驟1、2與實(shí)施例1的操作方法相同。
步驟3、發(fā)酵液的培養(yǎng)
（1）制備發(fā)酵培養(yǎng)基
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：以去離子水為介質(zhì)，黃芪多糖5 g/L，麥芽糖3 g/L，蠶蛹粉10 g/L，無水氯化鈣1 g/L，維生素B7 0.5 g/L，賴氨酸 0.5 g/L。
（2）發(fā)酵
調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6；
將步驟2得到的種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，所述三角瓶的規(guī)格為250ml；
種子液接種比為1：10；三角瓶裝液量為70ml，即三角瓶容量的7/25；
在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速160rpm條件下培養(yǎng)28h，得到發(fā)酵液。
步驟4、制得生物制劑
將制得的發(fā)酵液，10000 r/min條件下離心分離10min，得到菌體和上清液。上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾后，得到生物制劑。
在此條件下制備生物制劑的效果為：活性為1.08×106IU/ml，生物制劑的抗病毒活性較未發(fā)酵的黃芪多糖提高3541倍。
對(duì)生物制劑抗病毒穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，取生物制劑樣品分別存放3、6、9、12個(gè)月，并檢測(cè)其抗病毒活性，檢測(cè)結(jié)果見表15；
表15 存放一定時(shí)間后生物制劑的抗病毒活性
從表15可見，本發(fā)明方法制備的生物制劑不但具備較強(qiáng)的抗病毒活性，而且穩(wěn)定性好，存放12個(gè)月后生物制劑效價(jià)能達(dá)到為1.09×106 IU/ml。
經(jīng)試驗(yàn)，本發(fā)明生物制劑對(duì)禽類無任何副作用。
除特殊說明的外，本發(fā)明所述的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。