本發(fā)明屬于醫(yī)用材料技術領域，具體涉及一種含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料及制備與應用。

背景技術：

組織工程是一個結(jié)合了細胞生物學、工程學、材料科學和外科學等學科的新興研究領域，它能夠通過移植帶有活細胞的支架材料，促使受損的組織再生，或者替換病變和缺失的器官，因此成為最近幾年的研究熱點，相關的研究人員也呈現(xiàn)指數(shù)增長。

對于組織工程應用而言，所涉及到的關鍵技術主要包括如下三個方面：細胞技術、支架結(jié)構設計及控制，以及體內(nèi)整合技術。支架結(jié)構的設計與控制是組織工程中最為重要的一環(huán)，它通過設計和制造一個合適的三維網(wǎng)狀結(jié)構，模擬人體內(nèi)部組織和器官環(huán)境，為細胞繁殖和生長提供良好的基體。對于組織工程支架而言，有一些基本要求需要滿足：1)支架材料需要有比較高的孔隙率，并且孔徑尺寸大小適中，分布均勻。2)高比表面積。3)作用支架的材料需要能夠生物降解，而且降解的速度要與天然組織形成速度相匹配。4)支架材料必須有結(jié)構完整性和良好的力學性能，防止支架的孔洞在天然組織形成的過程中塌陷。5)支架需要使用有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化。

目前組織工程常用的生物材料有高分子聚合物、金屬、陶瓷和天然生物材料及復合材料等，而高分子聚合物由于優(yōu)良的物理機械性能、可控的結(jié)構與分子量、可變的材料性能，因此被廣泛應用；同時，由于這種材料能夠在短時間內(nèi)獲得大量所需的材料，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，故備受重視。

作為使用最為廣泛的生物可降解吸收高分子聚合物，脂肪族聚酯不但能與生物體良好相容，還能調(diào)節(jié)其分解速率。這類材料制成的支架材料在生物體內(nèi)會慢慢分解，并隨組織長大而消失。主要的脂肪族聚酯包括聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等，其中PLA的研究最多，也是應用較廣的一種生物降解材料。它能夠用作骨折內(nèi)部的固定、組織修復材料和藥物控制體系以及外科縫合線，軟骨組織培養(yǎng)支架和人工真皮等，也能與其他聚合物配合使用，提高其綜合使用性能。

在長期的科研探索中，聚己內(nèi)酯(PCL)生物支架材料已經(jīng)得到了越來越廣泛的應用。作為一理想的組織工程支架材料，PCL具備有以下幾個特點：1)具有生物可降解性。在所使用的生物支架聚合物有能被水解的不穩(wěn)定鍵合，其降解產(chǎn)物應是沒有毒性，并能通過新陳代謝方式除去。降解速率也能根據(jù)細胞類型、組織類型進行調(diào)整；2)具有良好的生物相容性，在植入體內(nèi)后，不會引發(fā)有炎癥反應或其他的不良后果；3)具有合理的三維外形、孔隙結(jié)構和構造，孔隙連通性好，孔隙率高，孔徑適當，為細胞的生長提供足夠的空間，利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換運輸；4)良好的力學穩(wěn)定性，且力學性能與相應的組織匹配；5)良好的表面相容性和高表面積，材料表面有利于種子細胞的粘附與生長。

海藻酸鈉(SA)是由兩種單體β-D-1,4-甘露糖醛酸(M單元)和α-L-1,4-古羅糖醛酸(G單元)組成，是一種線性無支鏈的無規(guī)共聚物。SA由于良好的抗菌性能、親水性和生物相容性，使其在環(huán)境保護、臨床應用和生物制藥等領域有各種各樣的應用。海藻酸鈉通過離子交換形成海藻酸鈣的過程一般被形容為“egg-box”模型，在這個模型中Ca²⁺與古羅糖醛酸單體通過海藻酸根分子鏈的G序列在空穴中相互作用，這種凝膠廣泛用于傷口創(chuàng)傷、牙齒印模材料、藥物緩釋系統(tǒng)和活細胞的密封保存等醫(yī)用領域。

透明質(zhì)酸(HA)是結(jié)構最為簡單的氨基聚糖，大多存在于脊椎動物的組織、關節(jié)滑液和軟骨中。由于HA處于水溶液時分子表面有大量親水基團，能結(jié)合很多水分子，故在體液中起到潤滑作用；另外，HA含水，結(jié)構疏松多孔，因此適于細胞的遷移和增殖，并能阻止細胞過早進行分化；同時，HA的免疫惰性使得它廣泛應用于細胞體外培養(yǎng)的基質(zhì)。Fidia公司新開發(fā)的細胞釋放系統(tǒng)，就是用HA作為細胞載體，使成纖維細胞、軟骨細胞在HA形成的三維支架有效地進行增值。

膠原是細胞外最重要的水不溶性纖維蛋白，是動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占人體蛋白質(zhì)總量的30％以上。其結(jié)構是由三條α－肽鏈組成的纖維狀蛋白質(zhì)，相互擰成三股螺旋狀構型。明膠是膠原蛋白部分水解的產(chǎn)物，它們一級結(jié)構上都同時含有酸性的羧基和堿性的氨基，是既帶正電荷又帶負電荷的兩性電解質(zhì)，具有良好的生物相容性，也具有無抗原性和可參與組織愈合過程等特點，因此廣泛應用于醫(yī)學領域。膠原廣泛用于止血、傷口愈合以及組織再生引導或誘導材料、燒傷創(chuàng)面敷料和骨移植替代材料等方面。而膠原與其它材料復合可構成新型的復合材料用于骨組織工程等領域。

殼聚糖帶正電荷，具有無毒無刺激、可降解、良好的機械性能、良好的生物相容性和生物活性以及無免疫原性等特點，具有消炎，止痛以及促經(jīng)傷口愈合等生物活性。此外，殼聚糖還可與其他材料復合，廣泛用于抗凝血材料、骨修復材料、人工皮膚、可吸收手術縫合線、藥物載體系統(tǒng)、人造生物膜等醫(yī)學領域。

靜電紡絲是一種簡單、靈活的制備纖維直徑為幾十到幾百納米的紡絲方法，其基本原理是：毛細管出口的聚合物溶液或熔體在高壓靜電場的作用下，變形成為泰勒錐，當靜電排斥力超過液滴的表面張力時，泰勒錐的頂端處就會形成細流，并在電場的運動中得到進一步拉伸，同時隨著溶劑揮發(fā)(或者熔體冷卻)，得到納米纖維。靜電紡絲有以下幾個明顯的優(yōu)勢：1、高孔隙率；2、高比表面積；3、靜電紡絲纖維的直徑與結(jié)構與細胞外基質(zhì)具有很好的相似性。同軸靜電紡絲法制備復合結(jié)構納米纖維材料雖只是近幾年才起步，但其發(fā)展速度相當快。同軸靜電紡絲使用不同的皮層組分和芯層組分，并在傳統(tǒng)靜電紡絲的裝置上對紡絲頭進行改進，紡出具有特殊結(jié)構和功能的復合納米纖維。結(jié)構多層次納米纖維應用較為廣泛。同軸靜電紡絲法主要用以制備中空納米纖維(納-微米管)，芯-殼結(jié)構納米纖維等，其強大優(yōu)勢在于能夠充分整合纖維中芯層和殼層的優(yōu)良性能，所制備出的納米纖維在生物醫(yī)用材料、過濾、催化、能源、光電等領域發(fā)揮著巨大作用。

技術實現(xiàn)要素：

基于以上現(xiàn)有技術，本發(fā)明的首要目的在于提供一種含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過上述方法制備得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料作為組織工程修復材料的應用。

本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料的制備方法，包括如下制備步驟：

(1)皮層組分的制備：將不可水溶高分子聚合物溶解于有機溶劑中，配置成質(zhì)量分數(shù)為5～40％的溶液，得到皮層組分；或?qū)⒉豢伤芨叻肿泳酆衔锶芙庥谟袡C溶劑中得到有機溶液，將水溶性高分子溶解于水中得到水溶液，然后將有機溶液和水溶液混合，經(jīng)均質(zhì)或乳化劑乳化，配置成質(zhì)量分數(shù)為5％～40％的懸浮液或乳液，得到皮層組分；

(2)芯層組分的制備：將小分子藥物或水溶性高分子溶解于水中，配置成質(zhì)量分數(shù)為1～30％的溶液，得到芯層組分；或直接采用空氣或去離子水作為芯層組分；

(3)將皮層組分和芯層組分通過同軸靜電紡絲，并通過動態(tài)凝固浴接收裝置進行收集，得到具有豐富微孔結(jié)構的纖維集合體，然后通過冷凍干燥、非溶劑致相分離-冷凍干燥、熱致相分離或固液相分離法進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料。

所述不可水溶高分子聚合物優(yōu)選聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基丁酸酯(PHB)、聚羥基戊酸酯(PHBV)、聚酯酰胺(PEA)等。

所述水溶性高分子優(yōu)選聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、膠原、明膠、絲膠、甲殼素、殼聚糖等。

所述凝固浴成分包括但不限于鈣離子溶液、醇類溶液、醛類溶液、京尼平溶液、蛋白酶溶液、植物酚酸溶液等。

一種含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料，通過上述方法制備得到。

優(yōu)選地，所述含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑為20～2000nm，纖維之間孔徑大小在0.5～5μm之間，纖維表面微孔大小在10～1000nm之間，纖維芯層孔洞大小在5～850nm之間。

上述含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料作為組織工程修復材料的應用。

本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明所得含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中皮層組分作為主體支架材料，芯層組分作為支架材料的復合結(jié)構，為纖維狀或膜狀或顆粒狀，與支架材料形成復合層狀結(jié)構、互穿結(jié)構和包覆結(jié)構，該結(jié)構可改善普通支架材料與有機組織的親和性；

(2)本發(fā)明所得含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中皮層組分為支架材料提供良好的力學性能，能夠防止支架在天然組織形成的過程中塌陷，并通過控制皮層組分成分控制降解時間，適用于組織工程修復創(chuàng)傷；

(3)本發(fā)明采用同軸靜電紡絲得到的納米纖維，并在動態(tài)凝固浴溶液中形成三維立體結(jié)構，并通過后處理方法制備多級孔結(jié)構，多級孔結(jié)構在纖維之間、纖維表面以及纖維內(nèi)部均有分布，而且該三維立體支架材料孔隙率高，孔徑尺寸可控，比表面積高且密度小；

(4)本發(fā)明的制備方法得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料其纖維直徑為20～2000nm，纖維之間孔徑大小在0.5～5μm之間，纖維表面微孔大小在10～1000nm之間，纖維芯層孔洞大小在5～850nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

聚乳酸(PLA，M_w＝3×10⁵g/mol)采用三氯甲烷作為溶劑，常溫下磁力攪拌4h，得到質(zhì)量分數(shù)為5％的PLA溶液；海藻酸鈉(SA,M_w＝2×10⁵g/mol)采用去離子水作為作為溶劑，常溫下磁力攪拌12h，得到質(zhì)量分數(shù)為1％的海藻酸鈉溶液；將兩種溶液混合，采用司盤80作為乳化劑，7000r/min高速乳化10分鐘后，得到均勻的乳液。將配好的乳液作為皮層組分，將去離子水作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用CaCl₂溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約5cm，在10kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過冷凍干燥進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PLA/海藻酸鹽三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在20-500nm之間，纖維之間孔徑大小在0.5～2μm之間，纖維表面微孔大小在10～300nm之間，纖維芯層孔洞大小在5～200nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

實施例2

聚己內(nèi)酯(PCL，M_w＝2×10⁴g/mol)采用二氯甲烷作為溶劑，常溫下磁力攪拌6h，得到質(zhì)量分數(shù)為40％的PCL溶液；聚乙烯吡咯烷酮(PVP,M_w＝4×10⁵g/mol)采用去離子水作為作為溶劑，常溫下磁力攪拌12h，得到質(zhì)量分數(shù)為8％的PVP溶液；將兩種溶液混合，2000r/min高速均質(zhì)10分鐘后，得到均勻的懸浮液。將配好的懸浮液作為皮層組分，將質(zhì)量分數(shù)為30％的透明質(zhì)酸水溶液作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用乙醇溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約7cm，在12kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過非溶劑致相分離-冷凍干燥進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PLA/PVP/透明質(zhì)酸三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在400-2000nm之間，纖維之間孔徑大小在1～5μm之間，纖維表面微孔大小在250～1000nm之間，纖維芯層孔洞大小在180～800nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

實施例3

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，M_w＝8×10⁴g/mol)采用六氟異丙醇作為溶劑，常溫下磁力攪拌8h，得到質(zhì)量分數(shù)為20％的PLGA溶液；殼聚糖(CS,M_w＝2×10⁵g/mol)采用去離子水作為作為溶劑，常溫下磁力攪拌24h，得到質(zhì)量分數(shù)為1％的殼聚糖溶液；將兩種溶液混合，采用PVA溶液作為乳化劑，4000r/min高速均質(zhì)10分鐘后，得到均勻的乳液。將配好的乳液作為皮層組分，將空氣作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用戊二醛溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約4cm，在20kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過熱致相分離進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PLGA/CS三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在100-800nm之間，纖維之間孔徑大小在0.8～3μm之間，纖維表面微孔大小在60～500nm之間，纖維芯層孔洞大小在40～350nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

實施例4

聚羥基乙酸(PGA，M_w＝1×10⁶g/mol)采用三氯甲烷作為溶劑，常溫下磁力攪拌8h，得到質(zhì)量分數(shù)為15％的PGA溶液；聚環(huán)氧乙烷(PEO,M_w＝8×10⁵g/mol)采用去離子水作為溶劑，常溫下磁力攪拌12h，得到質(zhì)量分數(shù)為14％的PEO溶液。將配好的PGA溶液作為皮層組分，將PEO溶液作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用戊二醛溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約5cm，在15kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過固液相分離進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PGA/PEO三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在500-1200nm之間，纖維之間孔徑大小在0.8～4μm之間，纖維表面微孔大小在300～800nm之間，纖維芯層孔洞大小在200～600nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

實施例5

聚羥基丁酸酯(PHB，M_w＝5×10⁴g/mol)采用二氯甲烷作為溶劑，常溫下磁力攪拌6h，得到質(zhì)量分數(shù)為20％的PHB溶液；膠原(M_w＝2×10⁶g/mol)采用去離子水作為作為溶劑，常溫下磁力攪拌12h，得到質(zhì)量分數(shù)為5％的膠原溶液。將配好的PHB溶液作為皮層組分，將膠原溶液作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用京尼平溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約6cm，在17kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過冷凍干燥進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PHB/膠原三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在600-1400nm之間，纖維之間孔徑大小在1.5～4μm之間，纖維表面微孔大小在350～800nm之間，纖維芯層孔洞大小在250～600nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

實施例6

聚羥基戊酸酯(PHBV，M_w＝1×10⁶g/mol)采用二氯甲烷作為溶劑，常溫下磁力攪拌8h，得到質(zhì)量分數(shù)為8％的PHB溶液；明膠(M_w＝6×10⁴g/mol)采用去離子水作為作為溶劑，常溫下磁力攪拌12h，得到質(zhì)量分數(shù)為25％的明膠溶液。將配好的PHBV溶液作為皮層組分，將明膠溶液作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用蛋白酶溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約5cm，在12kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過熱致相分離進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PHBV/明膠三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在800-1600nm之間，纖維之間孔徑大小在2～4.5μm之間，纖維表面微孔大小在500～1000nm之間，纖維芯層孔洞大小在350～850nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

實施例7

聚酯酰胺(PEA，M_w＝4×10⁴g/mol)采用三氯甲烷作為溶劑，常溫下磁力攪拌5h，得到質(zhì)量分數(shù)為30％的PEA溶液；絲膠(M_w＝3×10⁵g/mol)采用去離子水作為作為溶劑，常溫下磁力攪拌10h，得到質(zhì)量分數(shù)為15％的絲膠溶液。將配好的PEA溶液作為皮層組分，將絲膠溶液作為芯層組分，采用同軸靜電紡絲加工成型，采用植物酚酸溶液作為凝固浴，并輔以磁力攪拌作為動態(tài)接收裝置，接收裝置與針頭之間的距離約8cm，在14kV電壓下紡絲成型。把成型后復合支架材料通過冷凍干燥進行后處理，得到含多級孔結(jié)構的PEA/絲膠三維立體支架材料。

本實施例得到的含多級孔結(jié)構的三維立體支架材料中纖維直徑在400-900nm之間，纖維之間孔徑大小在1～2.5μm之間，纖維表面微孔大小在250～500nm之間，纖維芯層孔洞大小在200～400nm之間，能夠在形貌與尺寸上很好地模擬天然的細胞外基質(zhì)，而且具有良好生物相容性并且對細胞沒有毒性，在與細胞相互接觸的過程當中能夠促進細胞粘附、增殖、遷移和分化，適用于組織工程修復創(chuàng)傷。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。