本發(fā)明屬于動物模型建立方法領(lǐng)域，具體涉及一種失血性休克動物模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

安全有效的血液代用品是臨床上替代血液的理想選擇，可以解決離體血液貯存時限短(冷凍4℃條件下只能存貯3-6周)，而且貯存期間血液各種成分的理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)都發(fā)生改變；交叉配血試驗，不利于急救時的應(yīng)用；血液污染導致血源性疾病病毒(艾滋病，乙肝，丙肝)等缺點。血液代用品應(yīng)包括人造紅細胞、人造血小板、人造血漿、人造免疫體系等，而如何實現(xiàn)傳輸氧氣、維持血液滲透壓和酸堿平衡及擴充容量的功能是血液代用品研究首要解決的問題。

制備成功的失血性休克模型是開展評價血液代用品的基礎(chǔ)，大鼠由于其較高的失血耐受度成為最常用于制備重度失血性休克模型的實驗動物之一。國內(nèi)現(xiàn)有的建立的大鼠休克模型均是通過心率、平均動脈壓(MAP)、pH、二氧化碳分壓(PCO2)和氧分壓(PO2)作為評價指標。其中動脈血氣分析是評價休克與否的重要指標之一，pH值、PaO₂、PaCO₂是血氣分析中最重要的三項指標，是評價機體酸堿平衡和呼吸狀態(tài)的基礎(chǔ)指標。

這些模型應(yīng)用于傳統(tǒng)輸血評價中較為成功，但在血液代用品中評價的主要功能是傳輸氧氣，為缺氧組織供血，因此，在評價指標中需要引進針對紅細胞數(shù)量的評價指標。

紅細胞比容(Hct)，是指一定量的抗凝全血經(jīng)離心沉淀后，測得下沉的紅細胞占全血的容積比，是一種間接反映紅細胞數(shù)量大小及體積的簡單方法。Hct隨血液稀釋會逐步降低，當Hct降至起始值的1/3時，各組織已處于低氧供應(yīng)狀態(tài)。Hct的變化與失血和缺氧有密切關(guān)系，對于血液代用品的評價該指標更能有效反應(yīng)血液代用品的效果。

對于大鼠模型建立過程中采用的雙階段放血或40％失血策略中，最高失血量為50.6％(付春曉等。一種大鼠失血性休克模型的建立)，但是失血過程不好控制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種失血性休克動物模型的構(gòu)建方法，該方法可達到較高的失血量，且失血過程更為溫和，造成組織器官缺氧狀態(tài)更好。

本發(fā)明提供一種失血性休克動物模型的構(gòu)建方法，該方法包括：

步驟一：麻醉并切口

用麻醉劑向大鼠的腹腔內(nèi)注射，使大鼠麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥位固定于鼠臺上，在大鼠的頸部中線處和腹股溝處分別做3cm縱行切口，尋找并分離左頸總動脈、一側(cè)股動脈和對側(cè)股靜脈；

步驟二：插管并連接生理數(shù)據(jù)采集儀

在大鼠的左頸總動脈插入導管，該導管連接注射器，用于放血；在大鼠的股靜脈插入導管，該導管連接注射器，用于注射樣品；在大鼠的股動脈插入導管，該導管連接壓力傳感器，用于檢測平均動脈壓；

在大鼠的氣管插入導管，該導管連接呼吸流量傳感器，該呼吸流量傳感器連接多導生理記錄儀，用于檢測呼吸指標，將電極夾住大鼠的四肢和胸部皮下，電極與多導生理記錄儀連接，用于記錄心電圖；

步驟三：進行67％血液稀釋階段

在大鼠的左頸總動脈處抽取血液，并同時在在大鼠的股靜脈注射羥乙基淀粉氯化鈉注射液，對大鼠全血進行稀釋，至紅細胞比容值降至初始值的1/3，完成67％血液稀釋，穩(wěn)定5-20min；

步驟四：進行30％的再失血階段

按大鼠體重的7.2％計算，在大鼠的左頸總動脈處抽取30％血液，誘導大鼠致死性出血性休克，完成失血性休克動物模型的構(gòu)建，放血結(jié)束后在大鼠的股靜脈注射等體積復(fù)蘇液，穩(wěn)定5-60min，監(jiān)測生理信號直至復(fù)蘇或死亡。

優(yōu)選的是，所述的大鼠為雄性Wistar大鼠，體重為200-300g/只，實驗前安置在恒溫室中飼養(yǎng)一周。

優(yōu)選的是，所述的麻醉劑為10％水合氯醛。

優(yōu)選的是，所述的一側(cè)股動脈為右側(cè)股動脈，對側(cè)股靜脈為左側(cè)股靜脈。

優(yōu)選的是，所述的步驟三中，抽取血液的速度和注射羥乙基淀粉氯化鈉注射液的速度均為0.5-21ml/min。

優(yōu)選的是，所述的步驟三的穩(wěn)定時間為10min。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明提供一種失血性休克動物模型的構(gòu)建方法，是將通過67％血液稀釋30％失血，通過觀察紅細胞比容(Hct)、紅細胞數(shù)量(RBC)、平均動脈壓(MAP)，呼吸頻率(BR)、二氧化碳分壓(PCO₂)，氧分壓(PO₂)和心率(HR)指標評價大鼠休克模型的建立。與現(xiàn)有技術(shù)相對比，本發(fā)明采用67％血液稀釋階段和30％再失血階段，最高失血量為53％以上，達到現(xiàn)有的最高失血量，但失血過程更為溫和，可控，造成組織器官缺氧狀態(tài)更好。同時引進Hct指標，有利于組織器官缺氧狀態(tài)的形成和對于血液代用品的評價，本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡單，易于控制，模型相對穩(wěn)定，大鼠休克模型復(fù)制性良好，能夠反映創(chuàng)傷性休克的的臨床發(fā)病和臨床特征。

附圖說明

圖1為本發(fā)明失血性休克動物模型操作圖；

圖2為本發(fā)明實施例1自體血對失血性休克大鼠模型復(fù)蘇效果圖；

圖3為本發(fā)明實施例2HES對失血性休克大鼠模型復(fù)蘇效果圖；

圖4為本發(fā)明實施例3自制待篩選血液代用品對失血性休克大鼠模型復(fù)蘇效果圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種失血性休克動物模型的構(gòu)建方法，該方法包括：

步驟一：麻醉并切口

用麻醉劑向大鼠的腹腔內(nèi)注射，使大鼠麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥位固定于鼠臺上，在大鼠的頸部中線處和腹股溝處分別做3cm縱行切口，尋找并分離左頸總動脈、一側(cè)股動脈和對側(cè)股靜脈；

步驟二：插管并連接生理數(shù)據(jù)采集儀

在大鼠的左頸總動脈插入導管，該導管連接注射器，用于放血；在大鼠的對側(cè)股靜脈插入導管，該導管連接注射器，用于注射樣品；在大鼠的一側(cè)股動脈插入導管，該導管連接壓力傳感器，用于檢測平均動脈壓；在大鼠的氣管插入導管，該導管連接呼吸流量傳感器，該呼吸流量傳感器連接多導生理記錄儀，用于檢測呼吸指標，將電極夾住大鼠的四肢和胸部皮下，電極與多導生理記錄儀連接，用于記錄心電圖；

步驟三：進行67％血液稀釋階段

在大鼠的左頸總動脈處抽取血液，并同時在在大鼠的對側(cè)股靜脈注射羥乙基淀粉氯化鈉(HES)注射液，對大鼠全血進行稀釋，至紅細胞比容值降至初始值的1/3，完成67％血液稀釋，穩(wěn)定5-20min；

步驟四：進行30％的再失血階段

按大鼠體重的7.2％計算，在大鼠的左頸總動脈處抽取30％血液，誘導大鼠致死性出血性休克，完成失血性休克動物模型的構(gòu)建，放血結(jié)束后在大鼠的股靜脈注射等體積復(fù)蘇液，穩(wěn)定5-60min，監(jiān)測生理信號直至復(fù)蘇或死亡。

按照本發(fā)明，所述的大鼠優(yōu)選為雄性Wistar大鼠，體重為200-300g/只，實驗前安置在恒溫室中飼養(yǎng)一周。所述的麻醉劑優(yōu)選為10％水合氯醛。

按照本發(fā)明，所述的一側(cè)股動脈優(yōu)選為右側(cè)股動脈，對側(cè)股靜脈為左側(cè)股靜脈。

按照本發(fā)明，所述的步驟三中，抽取血液的速度和注射羥乙基淀粉氯化鈉注射液的速度優(yōu)選均為0.5-21ml/min，更優(yōu)選為1ml/min。所述的步驟三的穩(wěn)定時間為10min。

按照本發(fā)明，所述的完全復(fù)蘇判斷指標為存活超過2h以上。

為驗證本發(fā)明構(gòu)建模型的有效性，利用所構(gòu)建的大鼠血液稀釋休克換血模型對大鼠自體血，HES和待篩選血液代用品(mPEG-P(CL-co-LA)-PEG包裹血紅蛋白)進行了篩選和效果評價。證明了大鼠血液稀釋休克換血模型對大鼠自體血和自制待篩選血液代用品的效果。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，實施例中涉及到的原料均為商購獲得。

實施例1

麻醉并切口：10只雄性Wistar大鼠，體重為250±50g，安置在恒溫室中飼養(yǎng)1周。手術(shù)開始前，所有手術(shù)器械經(jīng)醫(yī)用酒精消毒，醫(yī)用導管及接頭充滿肝素鈉溶液(20mg/L,0.9％NaCl)。將大鼠用10％水合氯醛麻醉后，仰臥位固定于鼠臺上，頸部中線處和腹股溝處分別做3cm縱行切口，尋找并分離左頸總動脈、右側(cè)股動脈和左側(cè)股靜脈；

插管并連接生理數(shù)據(jù)采集儀：在大鼠的左頸總動脈插入PE50導管(Smith Medical，UK)連接注射器用于放血，左側(cè)股靜脈插入PE10導管用于注射樣品，右側(cè)股動脈插入PE10導管連接壓力傳感器(YP200型)用于監(jiān)測MAP，氣管插管連接呼吸流量傳感器(HX200型)用于檢測呼吸指標，傳感器連接多導生理記錄儀(MedLab-U/4C501H,南京美易)經(jīng)信號放大轉(zhuǎn)化后實時觀察，將與生理記錄儀導聯(lián)線相連的電極夾住四肢和胸部皮下以記錄心電圖，如圖1所示，待信號穩(wěn)定后進行下一步實驗；

67％血液稀釋階段：在大鼠的左頸總動脈抽取血液和左側(cè)股靜脈注射HES，速度均為1ml/min，對大鼠全血進行稀釋，至Hct降至初始值的1/3，穩(wěn)定10min。

30％再失血階段：在大鼠的左頸總動脈處抽取30％血液(全血量按大鼠體重的7.2％計算)誘導致死性出血性休克，放血結(jié)束立即經(jīng)靜脈導管注射等體積樣品自體血(S.S.B.)回輸，監(jiān)測生理信號直至復(fù)蘇或死亡。

實驗結(jié)果表明：實施例1構(gòu)建的失血性休克大鼠模型在30％再失血后，對模型大鼠進行自體血(S.S.B.)回輸，80％的大鼠存活超過2h。圖2為本發(fā)明實施例1自體血對失血性休克大鼠模型復(fù)蘇效果圖，從圖中可以看出，MAP在放血降至極值，隨液體灌輸血量恢復(fù)，血壓有所升高(圖2A)。HR隨血容量恢復(fù)，得以降低，之后變化趨勢不明顯(圖2B)。隨血液稀釋進行，BR增加以增加供氧量，而30％放血后大鼠處于休克狀態(tài)，自身已不能正常調(diào)節(jié)各器官運轉(zhuǎn)，BR降低，之后灌輸液體的變化趨勢與MAP相同(圖2C)。復(fù)蘇階段30min后，Hct和RBC含量有上升的趨勢(圖2D,E)。血液中PCO₂和PO₂在換血階段表現(xiàn)出較顯著的變化。放血時PCO₂降低，PO₂升。S.S.B輸血后血容量恢復(fù)，血液循環(huán)功能也部分恢復(fù)，表現(xiàn)為PCO₂升高(圖2F)，而PO₂降低(圖2G)。說明自體血能夠有效復(fù)蘇休克大鼠。

實施例2

步驟與實施例1相同，不同之處在于，30％再失血后，對模型大鼠用HES進行復(fù)蘇。

圖3為本發(fā)明實施例2HES對失血性休克大鼠模型復(fù)蘇效果圖，從圖中可以看出，MAP在放血降至極值，血壓未升高(圖3A)。HR隨血容量恢復(fù)，有所降低，之后升高(圖3B)。隨血液稀釋進行，BR增加以增加供氧量，大鼠處于休克狀態(tài)，BR降低，未升高(圖3C)。復(fù)蘇階段30min后，Hct和RBC含量變化不明顯(圖3D,E)。血液中PCO₂和PO₂在換血階段表現(xiàn)出較顯著的變化。放血時PCO₂降低，PO₂升。代血漿輸血后后血容量恢復(fù)，但血液循環(huán)功能未恢復(fù)，表現(xiàn)為PCO₂降低和PO₂降低(圖3F,G)。說明HES未能有效復(fù)蘇休克大鼠。

實施例3

步驟與實施例1相同，不同之處在于，30％再失血后，對模型大鼠用待篩選血液代用品(mPEG-P(CL-co-LA)-PEG包裹血紅蛋白)進行復(fù)蘇。

圖4為本發(fā)明實施例3待篩選血液代用品對失血性休克大鼠模型復(fù)蘇效果圖，從圖中可以看出，3MAP在放血降至極值，隨液體灌輸血量恢復(fù)，血壓有所升高(圖4A)。HR隨血容量恢復(fù)，得以降低，之后變化趨勢不明顯(圖4B)。隨血液稀釋進行，BR增加以增加供氧量，而30％放血后大鼠處于休克狀態(tài)，BR降低，之后灌輸液體的變化趨勢與MAP相同(圖4C)。復(fù)蘇階段30min后，Hct和RBC含量有上升的趨勢(圖4D,E)。血液中PCO₂和PO₂在換血階段表現(xiàn)出較顯著的變化。放血時PCO₂降低，PO₂升。HBV輸血后血容量恢復(fù)，血液循環(huán)功能也部分恢復(fù)，表現(xiàn)為PCO2降低(圖4F)，PO2不變(圖4G)。說明待篩選血液代用品能夠有效復(fù)蘇休克大鼠。