本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種中藥組合物及其制備方法及其治療結(jié)核病的用途。
背景技術(shù):
:裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.etArn.)為馬鞭草科紫珠屬植物,產(chǎn)自我國海南、廣西、廣東,印度、越南、馬來西亞等地也有分布,其根、葉可入藥,具有收斂止血、消炎解毒等功效。,近兩年對裸花紫珠的抗結(jié)核桿菌的作用有少量研究,如《裸花紫珠對臨床分離結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用》(中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(11):3630-3632)、《裸花紫珠收斂止血及對結(jié)核分枝桿菌的抗菌作用研究》(湖南師范大學(xué),2014年碩士論文),初步研究了對裸花紫珠干浸膏對結(jié)核分枝桿菌的作用,但尚未明晰其物質(zhì)基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供一種來自裸花紫珠的中藥組合物,通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種中藥組合物,其特征在于含有重量份為1份裸花紫珠石油醚萃取有效部位B和2-5份裸花紫珠提取物C,其中所述裸花紫珠石油醚萃取有效部位B的制備方法為:(1)取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入90%-95%乙醇加熱回流提取1-3次,得提取液,過濾后所得濾液濃縮成浸膏A,(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中,加入石油醚萃取,除去溶劑,濃縮,干燥得到石油醚萃取有效部位B,所述裸花紫珠提取物C的制備方法為:(1)取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入6-8倍40%-60%的乙醇回流提取1-2次,提取液濾過,濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.20~1.25(60℃),備用;(2)步驟(1)所得藥渣加6-8倍水煎煮1-2次,煎煮液濾過,濾液濃縮至相對密度1.04-1.06(60℃),加入濃縮液總重4%-6%的1%的殼聚糖醋酸溶液,攪勻,冷卻,靜置16-24小時(shí),濾過,濾液濃縮至相對密度為1.06~1.10(60℃)的清膏,加入活性碳,煮沸,放冷,靜置20-24h,濾過,濾液濃縮至相對密度1.20-1.25(60℃)時(shí),與步驟(1)所得濃縮液合并,濾液濃縮,干燥得裸花紫珠提取物C。作為上述方案的優(yōu)選,所述石油醚萃取有效部位B的制備方法步驟(1)為:取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入95%乙醇加熱回流提取3次,得提取液,過濾后所得濾液減壓濃 縮得浸膏A。作為上述方案的優(yōu)選,所述裸花紫珠提取物C的制備方法步驟(1)中乙醇濃度為50%-55%。本發(fā)明中藥組合物中所述裸花紫珠提取物C的重量份優(yōu)選為3份。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述中藥組合物的制備方法,技術(shù)方案如下:本發(fā)明所述中藥組合物的制備方法包括如下步驟:(1)取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入90%-95%乙醇加熱回流提取1-3次,得提取液,過濾后所得濾液濃縮成浸膏A,(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中,加入石油醚萃取,除去溶劑,濃縮,干燥得到石油醚萃取有效部位B,(3)取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入6-8倍40%-60%的乙醇回流提取1-2次,提取液濾過,濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.20~1.25(60℃),備用,(4)步驟(3)所得藥渣加6-8倍水煎煮1-2次,煎煮液濾過,濾液濃縮至相對密度1.04-1.06(60℃),加入濃縮液總重4%-6%的1%的殼聚糖醋酸溶液,攪勻,冷卻,靜置16-24小時(shí),濾過,濾液濃縮至相對密度為1.06~1.10(60℃)的清膏,加入活性碳,煮沸,放冷,靜置20-24h,濾過,濾液濃縮至相對密度1.20-1.25(60℃)時(shí),與步驟(3)所得濃縮液合并,濾液濃縮,干燥得裸花紫珠提取物C,(5)石油醚萃取有效部位B與裸花紫珠提取物C以1:2-5的重量比例混合,即得。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述中藥組合物在制備具有抗結(jié)核桿菌作用藥物中的用途和在制備治療結(jié)核病藥物中的用途。本發(fā)明所述的中藥組合物,可以含有有效量的上述任一項(xiàng)所述中藥組合物和藥學(xué)上可接受的輔料,制備成藥物制劑。裸花紫珠的化學(xué)成分有黃酮及苷類、三萜及苷類、二萜、苯乙醇苷類、酚酸類、甾體類、揮發(fā)油等,目前已從中分離得到100余個(gè)化合物。然而現(xiàn)有的對裸花紫珠成分與抗結(jié)核分枝桿菌作用的研究相對薄弱,已有研究結(jié)論推測主要作用成分是黃酮類。眾所周知,中藥成分復(fù)雜,一般通過多組分、多靶點(diǎn)、整體協(xié)同作用發(fā)揮抗結(jié)核作用,多重耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)使得控制結(jié)核病仍然是一個(gè)急需解決的全球性難題。發(fā)明人在前期研究基礎(chǔ)上,對抗結(jié)核桿菌活性成分群做了深入的研究,通過采用溶劑(水、甲醇、乙醇、丙酮等)提取,結(jié)合大孔樹脂或活性碳或陶瓷膜或萃取等等分離方法,聯(lián)合質(zhì)譜、液相等分析技術(shù),最終得出本發(fā)明的技術(shù)方案,其實(shí)驗(yàn)效果與對比例、陽性對照藥等對比見具體實(shí)施方式。發(fā)明人在前期研究基礎(chǔ)上,深入研究后,石油醚部位和特定工藝所得裸花紫珠提取物以 特定的比例所得混合物的抗結(jié)核桿菌作用更強(qiáng),這與殼聚糖醋酸溶液和活性炭通過吸附、聚合、沉淀、分離等方式,將裸花紫珠經(jīng)醇提后藥渣的水提物中粘液質(zhì)、多糖、色素等非活性成分和可能對抗結(jié)核作用起拮抗作用的成分除去,另一方面進(jìn)一步富集和純化活性成分,聯(lián)合裸花紫珠石油醚萃取有效部位,從而大大提高單位中藥組合物的生物活性,為后續(xù)新產(chǎn)品的研究和開發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果:(1)獲得抗結(jié)核分枝桿菌作用較強(qiáng)的中藥組合物,(2)制備方法操作簡便。具體實(shí)施方式以下將進(jìn)一步通過舉例詳細(xì)說明,發(fā)明人通過不同制備工藝得到相應(yīng)的實(shí)施例和對比例,并測得實(shí)施例、對比例、陽性對照藥的MIC值,詳見表1。發(fā)明人通過如下工藝制得實(shí)施例:1、裸花紫珠石油醚萃取有效部位B的制備:(1)取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入90%-95%乙醇加熱回流提取1-3次,得提取液,過濾后所得濾液濃縮成浸膏A,(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中,加入石油醚萃取,除去溶劑,濃縮,干燥得到石油醚萃取有效部位B,2、裸花紫珠提取物C的制備:(1)取裸花紫珠藥材,粉碎成粗粉,加入6-8倍40%-60%的乙醇回流提取1-2次,提取液濾過,濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.20~1.25(60℃),備用;(2)步驟(1)所得藥渣加6-8倍水煎煮1-2次,煎煮液濾過,濾液濃縮至相對密度1.04-1.06(60℃),加入濃縮液總重4%-6%的1%的殼聚糖醋酸溶液,攪勻,冷卻,靜置16-24小時(shí),濾過,濾液濃縮至相對密度為1.06~1.10(60℃)的清膏,加入活性碳,煮沸,放冷,靜置20-24h,濾過,濾液濃縮至相對密度1.20-1.25(60℃)時(shí),與步驟(1)所得濃縮液合并,濾液濃縮,干燥得裸花紫珠提取物C。3、將裸花紫珠石油醚萃取有效部位B與裸花紫珠提取物C以1:2-5的重量比混合即得。各實(shí)施例、對比例、陽性對照藥對抑制結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)方法如下:1.材料1.1菌株:結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MTBH37Rv(湖南省結(jié)核病防治所提供)1.2培養(yǎng)基及抗菌藥物基礎(chǔ)培養(yǎng)基為改良羅氏培養(yǎng)基;抗菌藥物為各實(shí)施例、對比例、陽性對照藥。1.3試劑:Middlebrook7H9肉湯OADC增菌液購自BDDifco公司;陽性對照藥異煙肼、利福平、乙胺丁醇購自sigma公司;DMSO去離子水、吐溫-80購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為化學(xué)分析純;96微孔板(Corning,美國);Alamarblue(Serotec,英國);7H9(Difco,美國);OADC(BD,美國)。2.實(shí)驗(yàn)和方法2.1菌落的準(zhǔn)備:依照改良羅氏法配制出基礎(chǔ)液將結(jié)核桿菌接種培養(yǎng);2.2原液濃度的配制:取約16g本發(fā)明所得中藥組合物用DMSO溶解,充分溶解后以0.22um濾膜過濾,除菌,備用。對比例所得樣品同此法配制。異煙肼5g,乙胺丁醇5g分別用水充分溶解后以0.22um濾膜過濾,除菌,備用。利福平5g用DMSO溶解后以0.22um濾膜過濾,除菌,備用。2.3實(shí)驗(yàn)將200ul的無菌去離子水加入到所有無菌的96孔板的外周界的孔,以盡量減少孵育期間在測試孔中的介質(zhì)的蒸發(fā)。以無菌Middlebrook7H9肉湯稀釋裸花紫珠原液和其他三種陽性藥物4倍最大期望最終檢測濃度(裸花紫珠為32mg/ml,異煙肼為1.6μg/ml,乙胺丁醇為40μg/ml,利福平為8μg/ml)加入檢測孔中100ul,然后對藥物進(jìn)行2倍系列稀釋分別稀釋至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64。每個(gè)藥物部分濃度重復(fù)2孔。選取羅氏培養(yǎng)基上生長2-3周的新鮮菌落,用玻璃珠磨菌,稀釋至1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?McFarland1,相當(dāng)于(3-6)×107CFU/ml」,再以1:25稀釋后向微孔板加入100ul菌液,菌液的終濃度約為106CFU/ml。每個(gè)菌株設(shè)1個(gè)不含藥物的生長對照孔(陽性對照)和只含有7H9不含藥物和菌液的無菌對照孔(陰性對照),各菌株平行進(jìn)行3次測試。96孔板于37℃孵育5d后在生長對照孔加入20ulAlamarblue和50ulTweerr80(5%)的混合液,37℃孵育24h,如果顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵?,則在各實(shí)驗(yàn)藥物孔內(nèi)加入上述量的Alamarblue和Tweerr80混合液,37℃孵育24h記錄各孔的顏色,藍(lán)色孔為無生長,粉紅色孔為有生長。如出現(xiàn)紫紅色孔,則繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24h,如果不變?yōu)榉奂t色且其相連的藍(lán)色孔仍為藍(lán)色,則記錄為有生長。MIC定義為阻止顏色變化(從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色)的最低藥物濃度。上述方法平行試驗(yàn),應(yīng)用相同的菌液和濃度以及藥物在同日內(nèi)操作,進(jìn)行3次。報(bào)告的MIC結(jié)果為2次及2次以上相同的MIC值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表1。表1各實(shí)施例、空白對照組、陽性對照藥組的止血作用的實(shí)驗(yàn)方法如下:將90只健康昆明小白鼠隨機(jī)分9組(每組10只,雌雄各半),分為實(shí)驗(yàn)組(實(shí)施例1-7)、陽性對照藥組(云南白藥組)、空白對照組,連續(xù)給藥7天,實(shí)驗(yàn)組和陽性對照藥組的劑量0.5g/kg,灌胃體積0.2mL/10g體重,空白對照組給予等體積生理鹽水,最后一天給藥45min后,用剪尾法測定小鼠出血時(shí)間(BT),用毛細(xì)玻管法測凝血時(shí)間(CT),評價(jià)藥物止血效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表2。表2本發(fā)明組合物對小鼠止血作用的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,N=10)組別劑量BT(秒)CT(秒)空白對照組20.56±2.3266.91±4.85實(shí)施例10.5g/kg14.42±1.46**44.61±3.59**實(shí)施例20.5g/kg13.85±1.51**45.36±3.28**實(shí)施例30.5g/kg13.74±1.39**43.27±3.84**實(shí)施例40.5g/kg14.05±1.63**44.78±4.16**實(shí)施例50.5g/kg14.26±1.34**43.86±3.91**實(shí)施例60.5g/kg13.17±1.45**42.71±4.03**實(shí)施例70.5g/kg13.92±1.27**42.35±3.65**云南白藥組0.5g/kg13.98±2.03**46.15±3.87***P<0.05,**P<0.01與空白對照組比較。表1表明本發(fā)明所得中藥組合物的抗結(jié)核桿菌作用較強(qiáng),與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有顯著差異,可用于制備抗結(jié)核桿菌作用的藥物中,而且所得中藥組合物具有收斂止血作用(見表2),可充分發(fā)揮收斂止血和抗結(jié)核桿菌的綜合作用,用于治療結(jié)核病。當(dāng)前第1頁1 2 3