一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片及其制備方法，該制備方法包含以下步驟：(1)前期處理：取已死亡動(dòng)物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，無(wú)菌條件下剔除表面脂肪組織和筋膜組織后沖洗；(2)脫細(xì)胞處理：反復(fù)凍融，漂洗，浸入烷基糖苷溶液中，常溫振蕩12～24小時(shí)；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；加入含DNA酶和RNA酶的鹽溶液中，37℃下振蕩24～36小時(shí)，將組織取出沖洗；(3)凍干和消毒，即制得骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片。所制得的生物補(bǔ)片在徹底除去組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，更好地保留了骨骼肌的三維框架微結(jié)構(gòu)，適用于作為生物修復(fù)材料廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種生物補(bǔ)片及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片作為常用的生物修復(fù)材料，來(lái)源于牛、豬、馬、人等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜下層、皮膚、膀胱、心包等這些富含膠原的組織。經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞技術(shù)處理后，保留有正常細(xì)胞外基質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)。生物補(bǔ)片植入到缺損處，能起到很好的支架作用，填補(bǔ)受損部位的缺失組織，并在該材料的誘導(dǎo)下，促進(jìn)宿主細(xì)胞在其三維結(jié)構(gòu)上生長(zhǎng)并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成自身組織并完成在缺損部位的修復(fù)重建，完成器官組織再生的過(guò)程。生物補(bǔ)片憑借其具有的完全可降解性、較好的生物相容性及促進(jìn)宿主組織長(zhǎng)入等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注。
[0003]脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片主要由膠原、糖蛋白、彈性纖維、粘多糖、生長(zhǎng)因子構(gòu)成。膠原成分占細(xì)胞外基質(zhì)干重的90%;肝素、硫酸肝素、軟骨素A和B、透明質(zhì)酸等粘多糖結(jié)合有生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子成分，他們促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)保留水分并維持凝膠狀形態(tài)；VEGF和TGF-β等生長(zhǎng)因子雖然總量不多，但它們?cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖和分化方面具有重要作用。這些脫細(xì)胞基質(zhì)支架植入人體或動(dòng)物體內(nèi)后容易降解，降解后形成單肽類結(jié)構(gòu)物質(zhì)，對(duì)宿主組織和細(xì)胞具有趨化性和促進(jìn)其增殖分化等作用。盡管這些生物補(bǔ)片有的取自異體組織，但由于去除了引起宿主免疫排斥反應(yīng)的成分，只保留有同源性的細(xì)胞外基質(zhì)成分，故組織相容性較好，移植后很少產(chǎn)生排斥反應(yīng)。
[0004]除此之外，ECM還具有傳遞信號(hào)分子的作用，這種信號(hào)分子的傳遞作用表現(xiàn)在ECM支架的降解過(guò)程中。ECM支架除了具有很多生物結(jié)構(gòu)大分子外還含有大量生長(zhǎng)因子等活性成分。同時(shí)，在伴隨支架降解過(guò)程中會(huì)釋放一些可溶性的單肽片段，相應(yīng)支架的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，抑制ECM支架降解的肽類會(huì)被合成和釋放，并啟動(dòng)化學(xué)交聯(lián)過(guò)程，從而調(diào)節(jié)宿主組織對(duì)ECM支架的重塑步驟。
[0005]骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片來(lái)源于肌肉組織，肌肉組織主要由肌細(xì)胞和肌細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)組成。其中骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)不僅具備像其他組織來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性成分和結(jié)構(gòu)，而且由于骨骼肌組織擁有良好的收縮性和豐富的毛細(xì)血管，其細(xì)胞外基質(zhì)成分中I，IV等膠原和生長(zhǎng)因子等活性成分含量非常高。因此骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片是一種具有很好應(yīng)用前景的生物支架。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片及其制備方法，按照該方法制得的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片在徹底除去存在于組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，更好地保留骨骼肌的三維框架微結(jié)構(gòu)。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的實(shí)施方式提供的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，包含以下步驟:
[0008](1)前期處理:取已死亡動(dòng)物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，在無(wú)菌條件下剔除表面的脂肪組織和筋膜組織，再次沖洗；
[0009](2)脫細(xì)胞處理:將上述經(jīng)過(guò)前期處理后的腹直肌組織進(jìn)行反復(fù)凍融，然后漂洗，浸入到質(zhì)量濃度為1?10%的烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12?24小時(shí)；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；再加入含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液中，在37°C下振蕩24?36小時(shí)，將組織取出，沖洗；
[0010](3)凍干和消毒:將上述經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理后的腹直肌組織進(jìn)行凍干處理，然后以Y射線輻射滅菌，即制得骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片。
[0011]本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的方法簡(jiǎn)單、有效、成本低，在徹底除去存在于組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，更好地保留有骨骼肌的三維框架微結(jié)構(gòu)，具有較好的力學(xué)性能和生物活性。
[0012]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道的脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法主要有:酶消化法、醇類溶液法和化學(xué)洗滌劑法等，在制備過(guò)程中多是結(jié)合使用。以上幾種方法要達(dá)到脫細(xì)胞徹底的效果，必然或多或少會(huì)破壞基質(zhì)內(nèi)部的支架結(jié)構(gòu)，引起基質(zhì)內(nèi)部活性蛋白變性，從而在一定程度上影響制備得到的脫細(xì)胞基質(zhì)材料的力學(xué)性能和生物活性。本發(fā)明的實(shí)施方式在保證脫細(xì)胞效果的基礎(chǔ)上，為了減少制備方法對(duì)支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)和活性的影響，采用了烷基糖苷進(jìn)行脫細(xì)胞處理。烷基糖苷是由可再生資源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是一種性能較全面的新型非離子表面活性劑，無(wú)毒，且易于生物降解，對(duì)人體無(wú)害，性能溫和，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)和活性蛋白幾乎沒(méi)有損傷。同時(shí)烷基糖苷還具有高表面活性、良好的生態(tài)安全性和相溶性。為了進(jìn)一步加強(qiáng)烷基糖苷脫細(xì)胞效果，本發(fā)明的實(shí)施方式還結(jié)合了凍融方法和核酸酶溶液共同處理腹壁骨骼肌。經(jīng)體外試驗(yàn)表明，本發(fā)明的方法在保證脫細(xì)胞效果的同時(shí)具備有良好的力學(xué)性能和生物活性成分，證實(shí)本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的方法在骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)材料的制備中有重要的應(yīng)用意義。
[0013]優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式中，步驟(1)取已死亡動(dòng)物的腹直肌肌肉組織時(shí)，供體動(dòng)物優(yōu)為新鮮健康?；蜇i，取材時(shí)間為動(dòng)物死亡后30分鐘內(nèi)。組織和器官的細(xì)胞外基質(zhì)提供了細(xì)胞發(fā)揮功能和維持表型的微環(huán)境，這種微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和成分在不同組織器官具有一定的差異，因此同源性脫細(xì)胞基質(zhì)材料修復(fù)相應(yīng)組織的效果較好。肌肉脫細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源的成分對(duì)于促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化具有重要的影響，因此本發(fā)明的實(shí)施方式采用死亡動(dòng)物的腹直肌肌肉組織作為制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的材料來(lái)源，可使最終制備得到的生物補(bǔ)片更好地適應(yīng)于對(duì)肌肉缺失的生物修復(fù)。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式中，步驟(1)中的兩次沖洗操作所采用的沖洗液為含有鏈霉素和青霉素的去離子水或PBS緩沖液；所述青霉素在所述沖洗液中的濃度為100 μ g/ml、所述鏈霉素在所述沖洗液中的濃度為100yg/ml。采用含有鏈霉素和青霉素雙抗的去離子水或PBS緩沖液作為沖洗液，對(duì)動(dòng)物的腹直肌肌肉組織材料進(jìn)行沖洗，可達(dá)到抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式中，步驟(2)中反復(fù)凍融的方法為:將所述腹直肌組織置于-80°C冰箱3?6小時(shí)，然后取出放在37°C水浴箱中30?60分鐘左右，凍融的次數(shù)為3次。上述步驟(2)中對(duì)腹直肌組織進(jìn)行反復(fù)凍融的作用為:凍融方法可以有效地使組織和器官中的細(xì)胞裂解，單次凍融可以減少免疫排斥反應(yīng)，反復(fù)凍融多用于脫細(xì)胞處理。凍融處理最大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)組織的機(jī)械性能影響不大，因?yàn)槠洳粫?huì)減少細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維的含量。
[0016]優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式中，步驟(2)中所采用的MgCl2溶液的濃度為0.05mol/L，，所述18(:12溶液中含DNA酶的濃度為100?200μ g/ml，含RNA酶的濃度為100?200 μ g/ml。在烷基糖苷處理后，采用含有核酸酶和脫氧核酸酶的MgCl2溶液繼續(xù)對(duì)腹直肌進(jìn)行處理，裂解核酸的序列，可以清除細(xì)胞內(nèi)殘留的核酸物質(zhì)。
[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式中，步驟(3)中，凍干處理的方法為:置于-60?_50°C真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理18?24小時(shí)。通過(guò)該凍干處理步驟，使得殘留在補(bǔ)片內(nèi)的水分去掉，便于將制得的生物補(bǔ)片更好地保存。
[0018]本發(fā)明的實(shí)施方式也提供根據(jù)上述方法制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片。該骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片由于在徹底除去存在于組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，保留有骨骼肌的三維框架微結(jié)構(gòu)，因而具有較好的力學(xué)性能和生物活性，適用于作為生物修復(fù)材料廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，尤其是作為骨骼肌缺損的修復(fù)材料。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是實(shí)施例3中的HE染色結(jié)果對(duì)比示意圖:
[0020]其中，1A為實(shí)施例1制得的生物補(bǔ)片的HE染色結(jié)果圖、IB為實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片的HE染色結(jié)果圖、1C為正常骨骼肌的HE染色結(jié)果圖；
[0021]圖2是實(shí)施例3中的殘留DNA測(cè)定試驗(yàn)的數(shù)據(jù)圖；
[0022]圖3是實(shí)施例3中的組織結(jié)構(gòu)成分檢測(cè)結(jié)果對(duì)比示意圖:
[0023]其中，3A為實(shí)施例1制得的生物補(bǔ)片的Masson染色結(jié)果圖、3B為實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片的Masson染色結(jié)果圖、
[0024]3C為實(shí)施例1制得的生物補(bǔ)片的PAS染色結(jié)果圖、3D為實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片的PAS染色結(jié)果圖、
[0025]3E為實(shí)施例1制得的生物補(bǔ)片的I型膠原免疫組化染色結(jié)果圖、3F為實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片的I型膠原免疫組化染色結(jié)果圖、
[0026]3G為實(shí)施例1制得的生物補(bǔ)片的纖連蛋白免疫組化染色結(jié)果圖、3H為實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片的纖連蛋白免疫組化染色結(jié)果圖；
[0027]圖4是實(shí)施例3中的Elisa定量檢測(cè)活性蛋白含量試驗(yàn)的結(jié)果示意圖:
[0028]其中，4A為總蛋白含量檢測(cè)結(jié)果圖、4B為VEGF蛋白含量檢測(cè)結(jié)果圖、4C為IGF-1蛋白含量檢測(cè)結(jié)果圖；
[0029]圖5是實(shí)施例3中的掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)示意圖:
[0030]其中，5A為實(shí)施例1制得的生物補(bǔ)片的掃描電鏡圖、5B為實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片的掃描電鏡圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的各實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中，為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒(méi)有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方案。
[0032]實(shí)施例1豬源性骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)支架的制備
[0033]本實(shí)施例涉及豬源性骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備實(shí)例:(1)前期處理:從死亡的供體豬的體內(nèi)取出腹直肌，使用0?8°C的去離子水或者ph值為7.4左右的緩沖鹽溶液(PBS)反復(fù)沖洗以除去表面的血凝塊，無(wú)菌條件下剔除表面脂肪組織，筋膜組織后，剪成2X 2cm2大小片狀，繼續(xù)用去離子水或者ph值為7.4左右的緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行沖洗。上述兩次沖洗步驟所使用的去離子水或者緩沖鹽溶液中含有青霉素100 μ g/ml和鏈霉素100 μ g/ml.(2)脫細(xì)胞處理:本部分將凍融法，烷基糖苷和核酸酶溶液相結(jié)合進(jìn)行脫細(xì)胞處理，步驟如下，將上述腹直肌組織置于_80°C冰箱4h，然后取出放在37°C水浴箱中30min，如此反復(fù)凍融3次。無(wú)菌去離子水漂洗30min后，將其浸入到1%烷基糖苷溶液(APG0810)中，常溫下置于搖床中以lOOrpm/min的速度振蕩12h。將烷基糖苷廢液倒掉，去離子水沖洗30min, PBS 溶液沖洗 2 次，每次 30min。然后加入 150 μ g/ml Dnase 和 100 μ g/mlRnase 的
0.05M MgCl2溶液中，以100rpm/min的速度在37°C搖床中振蕩24h。最后將組織取出，PBS沖洗2次，每次30min，去離子水沖洗2次，每次30min。(3)凍干和消毒:將脫細(xì)胞后的腹直肌組織置于-50°C真空冷凍干燥機(jī)行凍干處理18h，然后γ射線輻射滅菌，無(wú)菌環(huán)境下保存于-80°C冰箱備用。
[0034]實(shí)施例2對(duì)比制備實(shí)驗(yàn)例(Badylak制備方法)
[0035]根據(jù)Badylak提供的標(biāo)準(zhǔn)骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片:前期處理和凍干消毒步驟與本發(fā)明實(shí)施例1相同，脫細(xì)胞處理步驟如下:將胰酶，洗滌劑，醇類和螯合劑相結(jié)合進(jìn)行脫細(xì)胞處理。首先將經(jīng)過(guò)前期處理后的腹直肌組織在配有0.2%胰蛋白酶/0.2% EDTA的燒瓶中，燒瓶放入37°C恒溫振蕩箱2?4h，然后將燒瓶里廢液棄掉，去離子水沖洗30min，PBS沖洗2次，每次30min。加入2%脫氧膽酸鈉溶液，常溫下振蕩箱5?7h，將廢液棄掉，去離子水沖洗30min，PBS沖洗2次，每次30min。加入新鮮2%脫氧膽酸鈉溶液，繼續(xù)常溫下振蕩箱14?16min,廢液棄掉，加入1% TritonX-ΙΟΟΙ?3h,去離子水沖洗30min后，加入0.1 %過(guò)氧乙酸/4%乙醇溶液2h，PBS沖洗2次，每次30min，去離子水沖洗2次，每次30min后，將其行凍干和消毒，最后保存在_80°C冰箱備用。
[0036]實(shí)施例3體外試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果對(duì)比
[0037]將上述實(shí)施例1和實(shí)施例2兩種制備方案得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片進(jìn)行體外試驗(yàn)測(cè)定比較，證實(shí)本發(fā)明得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)材料生物活性較好，結(jié)果如下:
[0038](1)脫細(xì)胞程度測(cè)定:兩種支架材料經(jīng)石蠟包埋后切片行蘇木素-伊紅染色(HE染色)，證實(shí)無(wú)明顯細(xì)胞核殘留，正常骨骼肌HE染色后細(xì)胞核有表達(dá)(圖1A顯示實(shí)施例1制備的生物補(bǔ)片無(wú)明顯細(xì)胞核殘留，圖1B顯示實(shí)施例2制備的生物補(bǔ)片無(wú)明顯細(xì)胞核殘留，圖1C示正常骨骼肌的細(xì)胞核)。結(jié)合PicoGreen assay試劑盒進(jìn)行殘留DNA測(cè)定發(fā)現(xiàn)(圖2顯示殘留DNA測(cè)定結(jié)果)，本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片中DNA含量為68.59± 10.lng/mg,實(shí)施例2制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片中DNA含量為81.35±8.5ng/mg，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，正常骨骼肌DNA含量為838.7±57.94ng/mg，相對(duì)于脫細(xì)胞基質(zhì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0039](2)組織結(jié)構(gòu)成分:通過(guò)馬森染色(Masson染色)發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例1制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片(圖3A)和實(shí)施例2制備得到的脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片(圖3B)中的膠原纖維排列整齊，呈波浪狀平行排列，無(wú)明顯斷裂。PAS染色主要用來(lái)檢測(cè)組織中的糖類成分，實(shí)施例1制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片(圖3C)和實(shí)施例2制備得到的脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片(圖3D)中的糖類成分也被保留下來(lái)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證脫細(xì)胞處理后的細(xì)胞外基質(zhì)成分是否改變，我們選擇細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)比較廣泛的兩類蛋白，I型膠原(圖3E顯示實(shí)施例1制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片、圖3F顯示實(shí)施例2制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片)和纖連蛋白(圖3G顯示實(shí)施例1制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片、圖3H顯示實(shí)施例2制備得到的脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片)，進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們同樣在兩類骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片上有陽(yáng)性表達(dá)。
[0040](3)生長(zhǎng)因子和活性蛋白含量:Elisa定量檢測(cè)(圖4A)發(fā)現(xiàn):盡管實(shí)施例1制備得到的脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片中總蛋白含量要比實(shí)施例2制備得到的生物補(bǔ)片中總蛋白含量高(33.89±4.139mg/g vs 27.27±2.096mg/g)，但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中VEGF蛋白含量(圖4B)和IGF-1蛋白含量(圖4C)也是實(shí)施例1所制得的脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片中較高，VEGF蛋白在實(shí)施例1制備的補(bǔ)片中含量為1.228±0.04571ng/mg，在實(shí)施例2制得的補(bǔ)片中含量為0.7806±0.01773ng/mg, VEGF蛋白含量之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IGF-1蛋白在實(shí)施例1制備的補(bǔ)片中含量為47.23±9.495ng/mg，在實(shí)施例2制得的生物補(bǔ)片中含量為18.78±4.625ng/mg, IGF-1蛋白含量之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0041](4)超微結(jié)構(gòu):掃描電鏡(SEM)顯示實(shí)施例1制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片(圖5A)和實(shí)施例2制備得到的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)(圖5B)均保留了天然骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)排列的周期性條索狀肌膜微結(jié)構(gòu)，其中看不到無(wú)明顯的細(xì)胞成分。
[0042]綜上所述，本發(fā)明提供的改良方法簡(jiǎn)單，原料來(lái)源成本低，所用試劑無(wú)毒，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)活性成分影響小，有較好的力學(xué)性能和生物活性，并能有效的去除組織內(nèi)部的細(xì)胞成分，是一種具有良好應(yīng)用前景的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料。
[0043]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體實(shí)施例，而在實(shí)際應(yīng)用中，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)前期處理:取已死亡動(dòng)物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，在無(wú)菌條件下剔除表面的脂肪組織和筋膜組織，再次沖洗； (2)脫細(xì)胞處理:將上述經(jīng)過(guò)前期處理后的腹直肌肌肉組織進(jìn)行反復(fù)凍融，然后漂洗，浸入到質(zhì)量濃度為1?10%的烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12?24小時(shí)；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；再加入含0嫩酶和謂\酶的1甙12溶液中，在371下振蕩24?36小時(shí)，將組織取出，沖洗； (3)凍干和消毒:將上述經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理后的腹直肌肌肉組織進(jìn)行凍干處理，然后以V射線輻射滅菌，即制得骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中取已死亡動(dòng)物的腹直肌肌肉組織時(shí)，供體動(dòng)物為?；蜇i，取材時(shí)間為動(dòng)物死亡后30分鐘內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的兩次沖洗操作所采用的沖洗液為含有鏈霉素和青霉素的去離子水或？83緩沖液；所述青霉素在所述沖洗液中的濃度為1009 8加1、所述鏈霉素在所述沖洗液中的濃度為 100 9 。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中反復(fù)凍融的方法為:將所述腹直肌肌肉組織置于-801冰箱3?6小時(shí)，然后取出放在371水浴箱中30?60分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中反復(fù)凍融的次數(shù)為3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的兩次振蕩操作均在搖床中進(jìn)行，搖床的轉(zhuǎn)速為100?15011)111/111111。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的1甙12溶液的濃度為0.0511101/1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述1^12溶液中含0嫩酶的濃度為100?200 ^ 8加1，含觀八酶的濃度為100?200 ^ 8加1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中凍干處理的方法為:置于-60?-501真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干18?24小時(shí)。
10.一種骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片，所述骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法制備得到。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK104383601SQ201410604161
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】顧巖, 楊志, 楊建軍, 宋致成, 聶鑫, 王恵春, 劉正尼 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院