離心力和剪切力應(yīng)答蛋白1（recs1）在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種離心力和剪切力應(yīng)答蛋白1（RECS1）在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以RECS1基因敲除小鼠和心臟特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)模擬心肌肥厚疾病模型研究RECS1基因的表達(dá)與心肌肥厚之間的關(guān)系，結(jié)果表明RECS1基因敲除顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能；RECS1基因過(guò)表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能，即RECS1基因具有能夠保護(hù)心臟功能和抑制心肌肥厚的作用?；赗ECS1基因的作用，RECS1可用于制備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，為心肌肥厚的治療提供了一條有效的新途徑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】離心力和剪切力應(yīng)答蛋白1 (RECS1)在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種離心力和剪切力應(yīng)答蛋白I(RECSl)在治療心肌肥厚中的功能和應(yīng)用，具體是在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003]心血管系統(tǒng)疾病是目前世界的頭號(hào)殺手之一，在我國(guó)目前心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生率已提高至各種主要疾病的首位。心肌肥厚在當(dāng)今社會(huì)中十分普遍，心肌肥厚是持續(xù)性壓力或者容量負(fù)荷過(guò)重引起的適應(yīng)性變化，是猝死、心肌梗死、充血性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能增加住院率和死亡率。心肌肥厚由多種因素調(diào)節(jié)，且是一種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。研究表明持續(xù)的壓力和/或容量負(fù)荷過(guò)度，可增加室壁應(yīng)力，導(dǎo)致心肌肥厚。其特征大體可見(jiàn)心臟重量明顯增加、心室結(jié)構(gòu)改變；細(xì)胞水平上可見(jiàn)，心肌細(xì)胞長(zhǎng)度和/或?qū)挾仍龃?，肌?jié)數(shù)量增加、排列紊亂，膠原含量增加，纖維組織過(guò)度增生，細(xì)胞排列紊亂松散；分子水平上，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)、血管緊張素II (Angll)、內(nèi)皮素、兒茶酚胺等各種胞外刺激信號(hào)可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)胚胎型基因的表達(dá)，從而促使細(xì)胞發(fā)生肥大表型變化，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。左室肥厚是公認(rèn)的心血管疾病死亡率的危險(xiǎn)因素，如果未經(jīng)治療，其可以導(dǎo)致收縮和舒張功能不全并最終導(dǎo)致心力衰竭。然而，現(xiàn)有的研究并不能完全詮釋心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制。因此，尋找抑制心肌肥厚的特異性分子，對(duì)于進(jìn)一步闡述心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，具有重大的理論意義，可為臨床防治心肌肥厚提供新靶點(diǎn)和新策略。
[0004]RECSI (responsive to centrifugal force and shear stress gene I)是血液剪切力應(yīng)答蛋白，屬于Bax抑制子-1 (B1-1)家族的新成員，即Tmbiml (transmembrane Baxinhibitor motif-containing protein I)。B1-1家族是一組具有抗細(xì)胞凋亡等生物功能的多次跨膜小分子蛋白，主要包括B1-1、Lifeguard、GAAP (高爾基發(fā)病蛋白質(zhì))和RECSl等。層流剪切應(yīng)力使RECSl的表達(dá)增高，以保持血管系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)，避免血管長(zhǎng)期暴露于血流應(yīng)力和各種生物活性物質(zhì)而造成的損傷。Nojima實(shí)驗(yàn)室最早報(bào)道血液剪應(yīng)力誘導(dǎo)RECSl的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并克隆得到RECSl的cDNA和氨基酸序列【I】。人RECSl是I個(gè)有311個(gè)氨基酸的7次跨膜蛋白，與Lifeguard和谷氨酸結(jié)合蛋白具有很高的同源性。在心肌肥厚過(guò)程中，一般伴隨著炎癥和心肌細(xì)胞的凋亡，NF-kB信號(hào)通路主要作為介導(dǎo)炎性反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究證實(shí)NF-K B的激活是心肌細(xì)胞肥大所必需的，最近的研究提示NF- K B信號(hào)通路可能在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用【2，3】；Fas基因是備受關(guān)注的促凋亡基因，劉繼東等發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠早期心肌肥厚時(shí)心肌Fas表達(dá)已經(jīng)升高，可能參與后期心衰的發(fā)生【4】。有報(bào)道表明穩(wěn)定表達(dá)RECSl的小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)TNFR2特異的激動(dòng)性抗體表現(xiàn)出一定的耐受性，顯示RECSl可能參與TNF- α信號(hào)的調(diào)控【5】。RECSl結(jié)合TNFRl，并抑制過(guò)量表達(dá)TNFRl誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子_ κ B (NF- κ B)活化【6】，從而負(fù)調(diào)控TNF-α信號(hào)。RECSl基因敲除的小鼠年老時(shí)易患主動(dòng)脈囊性中層壞死并表現(xiàn)有大動(dòng)脈擴(kuò)張癥，表明RECSl可能參與調(diào)控血管的發(fā)育重塑。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，RECSl基因敲除的小鼠主動(dòng)脈基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的表達(dá)水平明顯提高【7，8】。近期的研究結(jié)果顯示，RECSl可減少細(xì)胞表面Fas的表達(dá)，從而保護(hù)Fas配體(FasL)誘導(dǎo)的凋亡【9】。因此推測(cè)，RECSl可能在心肌肥厚中起到重要作用，為心肌肥厚引起的心臟疾病的治療研究提供的新的思路。
[0005]【參考文獻(xiàn)】
1、H.Yoshisue，K.Suzuki, A.Kawabatal，Atherosclerosis 162，323 (Jun，2002).2、Freund C， Schmidt-Ullrich R， Baurand A， et al.Requirement of nuclearfactor-NF-κ B in ang1tensin II and isoproterenol-1nduced cardiac hypertrophyin viv0.Circulat1n, 2005， 111(18):2319-2325.3、YoungDj Popovic ZBj Jones WKj et al.Blockade of NF—kappa B usingI kappa B alpha dominant-negative mice amel1rates cardiac hypertrophy inmyotrophin-overexpressed transgenic mice.J Mol B1l, 2008，381 (3):559-568.4、劉繼東，鹿克風(fēng)，張欣等。自發(fā)性1?血壓大鼠心肌fas基因表達(dá)與左室肥厚關(guān)系探討。高血壓雜志，2003.5、蔡慈峰，吳明江，廖志勇.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)26，36(Jan, 2010)
6、廖志勇.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)27，412(May, 2011).7、ZhaoH，Ito A, Sakai N，Matsuzawa Y，Yamashita S，Nojima H.RECSlis a negative regulator of matrix metalloproteinase-9 product1n and agedRECSl knockout mice are prone to aortic dilat1n.Circulat1n Journal.2006;70(5):615-24.8 λ Zhao Hj Ito A，Kimura SHj Yabuta N，Sakai N，Ikawa M，Okabe M，MatsuzawaYj Yamashita S，Nojima H.RECSl deficiency in mice induces susceptibility tocystic medial degenerat1n.Genes Genet Syst.2006; 81 (I):41-50.9、Shukla S，F(xiàn)ujita K，Xiao Q，Liao Z，Garfield S，Srinivasula SM.A shearstress responsive gene product PP1201 protects against Fas—mediated apoptosisby reducing Fas express1n on the cell surface.Apoptosis.2011;16(2):162-73。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定RECSl的表達(dá)和心肌肥厚的相互關(guān)系，提供一種RECSl在篩選保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用，提供一個(gè)用于保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的靶基因RECSl的新用途。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)確定RECSl表達(dá)與心肌肥厚之間的關(guān)系:
URECSl基因敲除顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能
本發(fā)明選用野生型小鼠、RECSl基因敲除小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動(dòng)脈弓縮窄，然后通過(guò)對(duì)假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進(jìn)行心心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測(cè)定，研究RECSl基因敲除對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明敲除RECSl基因所致的RECSl缺陷顯著惡化心肌肥厚、纖維化及心功能(圖1、圖2、圖3、圖7)。
[0008]2、RECSl基因過(guò)表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能
本發(fā)明選用心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動(dòng)脈弓縮窄，然后通過(guò)對(duì)假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進(jìn)行心心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測(cè)定，研究RECSl基因過(guò)表達(dá)對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)RECSl基因顯著抑制心肌肥厚及纖維化，保護(hù)心功能(圖4、圖5、圖6、圖8)。
[0009]由以上結(jié)果可知RECSl基因缺陷顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能，RECSl基因過(guò)表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護(hù)心功能。因此RECSl基因具有保護(hù)心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是RECSl基因能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān)疾病發(fā)生的作用。
[0010]一種RECSl在心肌肥厚中的功能，主要體現(xiàn)在RECSl基因具有保護(hù)心功能和抑制心肌肥厚的作用，特別是RECSl基因能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚發(fā)生的作用。
[0011]針對(duì)RECSl的上述功能，提供一種RECSl的應(yīng)用，主要體現(xiàn)為RECSl在保護(hù)心臟和治療心肌肥厚中的應(yīng)用，特別是RECSl在制備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。
[0012]一種保護(hù)心臟功能的藥物，包含RECSl。
[0013]一種預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，包含RECS1。
[0014]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(I)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)RECSl基因的新功能，即RECSl基因具有能夠保護(hù)心臟功能和抑制心肌肥厚的作用。
[0015](2)基于RECSl在保護(hù)心臟功能和抑制心肌肥厚疾病中的作用，其可以用于制備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是WT和RECSl-KO小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示 RECSl 敲除顯著促進(jìn) HW/BW、LW/BW 及 HW/TL (*:p < 0.05 vs WT Sham 組，#:p
<0.05 vs WT AB 組)。
[0017]圖2是WT和RECSl-KO小鼠AB模型4周后心臟組織HE染色及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示RECSl敲除顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大(*:p < 0.05 vs WT Sham組，#:P < 0.05 vs WT AB 組)。
[0018]圖3是WT和RECSl-KO小鼠AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示RECSl敲除顯著促進(jìn)心臟的纖維化。
[0019]圖4是NTG和TG小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示 RECSl 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL (*:p < 0.05 vs NTG Sham 組，#:p < 0.05vs NTG AB 組)。
[0020]圖5是NTG和TG小鼠AB模型4周后心臟組織HE染色及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示RECSl過(guò)表達(dá)會(huì)抑制心肌細(xì)胞肥大(*:p < 0.05 vs NTG Sham組，#:p
<0.05 vs NTG AB 組)。
[0021]圖6是NTG和TG小鼠AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示RECSl過(guò)表達(dá)會(huì)抑制心臟的纖維化。
[0022]圖7是WT和RECSl-KO小鼠AB模型4周后超聲檢測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示RECSl敲除顯著惡化心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期內(nèi)徑、EF為射血分?jǐn)?shù)、FS為短軸縮短率(*:p < 0.05 vs WT Sham組，#:p < 0.05 vs WTAB 組)。
[0023]圖8是NTG和TG小鼠AB模型4周后超聲檢測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示RECSl過(guò)表達(dá)顯著保護(hù)心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期內(nèi)徑、EF為射血分?jǐn)?shù)、FS為短軸縮短率(*:p < 0.05 vs NTG Sham組，#:p < 0.05 vs NTGAB 組)。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0025]實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用8-10周齡、體重在23.5-27.5g，雄性，心臟特異性Cre小鼠(a -MHC-Cre (命名 WT)，背景為 C57BL/6，購(gòu)自 Jackson Laboratory，貨號(hào) 005650)、RECSl基因敲除小鼠(RECS1-K0，購(gòu)自日本RIKEN公司，貨號(hào):RIKEN01772)、心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠(TG，心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠由武漢大學(xué)心血管病研究所李紅良教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)及非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG，同齡同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
[0026]心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建:
用引物(上游引物:GTTGTCGACGCCACCATGTCCAATCCCAGTGCCCC ;下游引物:GCCAAGCTTAGTCTCTACTTCCTACGAGC)擴(kuò)增小鼠 RECSl 全長(zhǎng)基因(NCBI，Gene ID -.69660,NM_027154)，把擴(kuò)增的RECSl全長(zhǎng)基因連接于心肌肌球蛋白重鏈(a -MHC)啟動(dòng)子下游，將構(gòu)建的序列通過(guò)顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因老鼠。(上述的轉(zhuǎn)基因小鼠參照下述文獻(xiàn)制備:Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM,Liu Y，Zhang R et al.Role of interferon regulatory factor 4 in the regulat1nof pathological cardiac hypertrophy.Hypertens1n 2013; 61:1193-1202.)
飼養(yǎng)環(huán)境:所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF級(jí)大小鼠飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件:室溫在22-24°C之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0027]實(shí)施例1心肌肥厚(AB)模型獲得
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:雄性背景C57BL/6野生型小鼠(WT)、RECSl基因敲除小鼠(RECS1-K0)及心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)和非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG)，通過(guò)主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立心肌肥厚模型。隨機(jī)分為8組，分組如下:C57BL/6背景野生型小鼠假手術(shù)組(WT Sham)及AB術(shù)組(WT AB)、RECSl基因敲除小鼠假手術(shù)組(RECS1-K0 Sham)及AB術(shù)組(RECS1-KO AB)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(NTG Sham)及AB術(shù)組(NTG AB)、心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(TG Sham)及AB術(shù)組(TG AB)。
[0028]2.心肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，模型操作流程:
2.1術(shù)前準(zhǔn)備
(I)麻醉:先給小鼠稱(chēng)重，按照90mg/kg體重計(jì)算所需麻藥(3%戊巴比妥鈉)量，通過(guò)腹腔注射，并記錄注射時(shí)間點(diǎn)。夾尾、夾趾無(wú)明顯反應(yīng)且小鼠狀態(tài)良好為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)(一般注射后約1min無(wú)明顯反應(yīng)，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應(yīng),麻醉后30min左右為最佳手術(shù)時(shí)間)。
[0029](2)術(shù)區(qū)準(zhǔn)備:將小鼠左胸部、左側(cè)胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗布擦拭術(shù)區(qū)去除鼠毛，以不影響手術(shù)視野為宜。
[0030](3)氣管插管:用橡皮筋將小鼠上門(mén)齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經(jīng)聲門(mén)準(zhǔn)確插入氣管內(nèi)，隨后右側(cè)臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預(yù)熱)，然后將氣管插管與呼吸機(jī)連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致，說(shuō)明氣管插管成功。
[0031]2.2主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù)
取右側(cè)臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫(yī)用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分?jǐn)?shù)為75%酒精對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。左手持眼科鑷將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開(kāi)皮膚約1cm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水平打開(kāi)胸腔，用棉簽稍撥開(kāi)左肺，游離主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)縫線穿過(guò)血管，并在血管上方平行放置一段26G (25.0-27.5g小鼠)或者27G (23.5-25.0g)注射器針頭，將血管及針頭一起結(jié)扎好，再抽出針頭即可達(dá)到相應(yīng)程度的血管縮窄。結(jié)扎完畢后依次縫合，關(guān)閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出Icc氣體以恢復(fù)胸腔內(nèi)負(fù)壓，拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。假手術(shù)組(Sham)在游離出主動(dòng)脈降支后只穿線不結(jié)扎，其余步驟同心肌肥厚(AB)模型組。
[0032]2.3術(shù)后護(hù)理
主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù)后，待小鼠出現(xiàn)自主呼吸、夾趾出現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)，拔出氣管插管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過(guò)的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。RECSl基因敲除小鼠及野生型小鼠術(shù)后4周、非轉(zhuǎn)基因小鼠及心臟特異性RECSl轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后4周分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。
[0033]實(shí)施例2小鼠心肌肥厚(AB)模型心肌肥厚及纖維化檢測(cè)
1.取材
(I)前期工作:預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的體積分?jǐn)?shù)10%甲醛的尿杯，并貼好標(biāo)簽(小鼠編號(hào)、組別、手術(shù)類(lèi)型及取材日期)。將倒?jié)M質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KCl溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開(kāi)分析天平，調(diào)零備用。再稱(chēng)重處死小鼠。
[0034](2)取材:眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KCl溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后，稱(chēng)重并記錄，將心臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定48h后用于病理學(xué)檢測(cè)。
[0035](3)相關(guān)測(cè)量及計(jì)算:取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱(chēng)重并記錄。剪開(kāi)小鼠后肢脛骨處皮膚，測(cè)量并記錄脛骨長(zhǎng)度。計(jì)算心重與體重的比值(HW/BW)，肺重與體重的比值(Lff/Bff)以及心重與脛骨長(zhǎng)度的比值(HW/TL)。
[0036]2.病理學(xué)檢測(cè)
2.1制備石臘標(biāo)本切片
主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0037]2.2蘇木精-伊紅(HE)染色
主要步驟為:55 °C烘烤30min — 二甲苯5min，3次一100%酒精I(xiàn)min — 95%酒精I(xiàn)min — 70%酒精I(xiàn)min —雙蒸水Imin —蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min —水洗Imin — 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻)l_3s —水洗Imin — Scott液(碳酸氫鈉0.35g,七水硫酸鎂2g,兩者溶于10mL蒸懼水)Imin —水洗Imin —伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024) 3_5min —蒸懼水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s — 95%酒精I(xiàn)s — 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0038]HE染色圖片統(tǒng)計(jì):每張圖片選擇3個(gè)以上邊界清楚，核大致位于中央的細(xì)胞，用Image-Pro Plus 6.0軟件圈細(xì)胞面積。
[0039]2.3天狼星紅(PSR)染色
主要步驟為:55 V烘烤30min — 二甲苯2min，3次一100%酒精I(xiàn)min — 95%酒精I(xiàn)min — 70%酒精I(xiàn)min —流水沖洗1min —雙蒸水Imin —質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上,濕盒中染色90min —去除殘液一0.0lN鹽酸4s — 70%酒精I(xiàn)次一90%酒精I(xiàn)次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片,顯微鏡拍照。
[0040]心肌組織由心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細(xì)胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細(xì)胞反應(yīng)，只能是單個(gè)細(xì)胞的體積增大而不能在數(shù)量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過(guò)程中，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，肌節(jié)數(shù)量增多，細(xì)胞排列紊亂，心臟間質(zhì)改變包括心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，膠原纖維密度增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調(diào)等。
[0041]WT和RECSl-KO小鼠AB模型后的表型結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。Sham (假手術(shù))組中WT小鼠和RECSl-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；WT小鼠AB術(shù)后 4 周的 HW/BW、LW/BW、HW/TL 高于其 Sham 組；AB 術(shù)后 4 周，RECSl-KO 小鼠的 HW/BW、LW/BW及HW/TL均較WT小鼠升高(圖1)。HE染色切片可觀察到=Sham組心臟無(wú)明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，RECSl-KO小鼠的心臟明顯大于WT組小鼠；Sham組心肌肌原纖維細(xì)胞排列整齊、致密，形態(tài)完整，胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；AB組肌絲排列紊亂、松散，心肌細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，RECSl-KO組則比WT組細(xì)胞肥大明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。PSR染色后，發(fā)現(xiàn)AB組心室心肌間質(zhì)膠原含量較Sham組增加，動(dòng)脈血管周?chē)z原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊亂成網(wǎng)絡(luò)狀；AB術(shù)后RECSl-KO小鼠膠原含量及血管周?chē)z原含量大于WT組小鼠(圖3)。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)AB模型后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，RECSl-KO小鼠的心肌肥厚程度大于WT小鼠。
[0042]圖4、圖5、圖6是NTG和RECSl-TG小鼠AB模型后的表型結(jié)果。同樣NTG小鼠AB術(shù)后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明顯小于NTG小鼠(圖4)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術(shù)后TG小鼠心臟增大的程度遠(yuǎn)小于NTG小鼠。HE染色切片可觀察到:TG小鼠AB術(shù)后心肌細(xì)胞橫截面積大于Sham組，顯著小于NTG小鼠AB組(圖5)。PSR染色可見(jiàn)，TG小鼠AB術(shù)后心肌間質(zhì)膠原含量及血管周?chē)z原含量均小于NTG小鼠AB組(圖6)。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)AB模型后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，RECSl-TG小鼠的心肌肥厚程度小于NTG小鼠。
[0043]實(shí)施例3心肌肥厚(AB)模型小鼠超聲檢測(cè)心功能 I前期準(zhǔn)備
(O麻醉機(jī)準(zhǔn)備:先連接氧氣瓶和麻醉機(jī)上的進(jìn)氣接口，再擰開(kāi)麻醉機(jī)上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開(kāi)氧氣瓶上總閥門(mén)，調(diào)整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。
[0044](2)待測(cè)小鼠準(zhǔn)備:待檢測(cè)小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區(qū)剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1.5-2.0%異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。
[0045]2心功能檢測(cè)
小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，并在剃毛區(qū)均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司)。采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS)。
[0046]本實(shí)施例運(yùn)用M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)價(jià)心肌肥厚和心功能。圖7是WT和RECSl-KO小鼠AB模型后心功能檢測(cè)結(jié)果圖。與WT Sham組相比，WT小鼠AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標(biāo)LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指標(biāo)EF、FS則下降。AB術(shù)后4周，RECSl-KO小鼠心肌肥厚的指標(biāo)增大的程度及反映心功能的指標(biāo)下降的程度比WT小鼠明顯。說(shuō)明RECSl-KO小鼠的心功能更顯著惡化、心肌肥厚程度更嚴(yán)重，這些結(jié)果均與RECSl-KO小鼠心肌肥厚更為顯著的結(jié)果一致。
[0047]圖8是NTG和RECSl-TG小鼠AB模型后的超聲檢測(cè)結(jié)果。與NTG Sham組相比，NTG小鼠AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標(biāo)LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指標(biāo)EF、FS則下降。AB術(shù)后4周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指標(biāo)增大的程度及反反映心功能的指標(biāo)下降的程度則小于NTG組。這些結(jié)果與TG小鼠心肌肥厚被抑制的結(jié)果一致。
[0048]由以上結(jié)果可知，在主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，RECSl基因缺陷顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能，RECSl基因過(guò)表達(dá)顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護(hù)心功能。因此RECSl基因具有保護(hù)心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是RECSl基因能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān)疾病發(fā)生的作用。
[0049]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.RECSl在制備保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。
2.一種保護(hù)心臟功能的藥物，其特征在于:包含RECS1。
3.RECSl在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。
4.一種預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，其特征在于:包含RECSl。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK104174011SQ201410379192
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】李紅良, 趙輝, 蔣曦, 張曉東 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)