一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)接種用真菌懸液的制備：將真菌接種于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，成熟后刮取培養(yǎng)基表面菌落，移至無菌的PBS，研磨成菌絲段，制備懸液，所述真菌為萬博節(jié)皮菌；(2)動(dòng)物造模：健康兔，背部剪毛，消毒后，用無菌砂紙磨破其背部皮膚，給予糖皮質(zhì)激素處理同時(shí)涂布真菌懸液，然后向腹腔注射地塞米松，地塞米松注射液的用量為7.5mg/kg，每隔日重復(fù)注射1次。本發(fā)明的有益之處在于：提供了一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，此方法具簡單，易于操作和推廣的優(yōu)點(diǎn)；利用本發(fā)明的方法獲得的須癬毛癬菌感染兔模型，其更接近實(shí)際,更準(zhǔn)確，更具有實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，具體涉及一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)是淺部真菌病的最常見病原菌之一，能引起傳染性人畜共患的接觸性皮膚真菌疾病。自Priestley報(bào)告本病以來，世界各地均有陸續(xù)報(bào)道。它主要侵犯皮膚、粘膜及其附屬物(毛、羽毛、爪等)，引起皮膚、毛發(fā)、甲板感染，導(dǎo)致皮屑增多、結(jié)痂、脫毛、滲出、毛囊炎及癢感等癥狀。雖然這種感染很少是致命性的，但常常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是可能感染人，并在人群間傳播。[0003]人和兔、狐貍、貓、狗、馬、牛、羊及雞均可感染須癬毛癬菌，但主要侵害的是兔，在世界范圍內(nèi)須癬毛癬菌是兔等動(dòng)物第一大常見的皮膚癬菌，是人第二大常見的皮膚癬菌。隨著養(yǎng)兔業(yè)轉(zhuǎn)型與升級(jí)，兔須癬毛癬菌的發(fā)生也越來越引起人們的高度重視，據(jù)報(bào)道，在一些發(fā)病兔場(chǎng)，仔兔生長速度下降15%~30%，發(fā)病率達(dá)40%~100%，死亡率達(dá)22%~40%，斷奶后育成率下降20%~50%。國家兔育種委員會(huì)把該病列為三大兔病之一。近年來，該病原菌引起的感染已成為危害社會(huì)公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一大難題，世界上20%~25%的人群受到該病的困擾。因此，該病已受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)學(xué)界的高度重視。
[0004]但由于沒有相應(yīng)的須癬毛癬菌感染動(dòng)物模型，對(duì)于人抗皮膚癬菌藥物的藥敏試驗(yàn)只能在體外進(jìn)行，而以往的皮膚癬菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，體外藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與體內(nèi)給藥后的療效并不一致。
[0005]目前國內(nèi)外多采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠和豚鼠構(gòu)建的須癬毛癬菌感染模型，菌株用須癬毛癬菌昆克變種，雖然這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)研究兔須癬毛癬菌感染有參考價(jià)值，但畢竟小鼠和豚鼠與兔是有很大差異的，以小鼠和豚鼠作為感染模型與實(shí)際還存在一定的差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，更接近實(shí)際，更準(zhǔn)確，更具有實(shí)用價(jià)值。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0008]一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0009](I)接種用真菌懸液的制備:將真菌接種于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，成熟后刮取培養(yǎng)基表面菌落，移至無菌的PBS，研磨成菌絲段，制備懸液，前述真菌為萬博節(jié)皮菌；
[0010](2)動(dòng)物造模:健康兔，背部剪毛，消毒后，用無菌砂紙磨破其背部皮膚，給予糖皮質(zhì)激素處理同時(shí)涂布真菌懸液，然后向腹腔注射地塞米松，地塞米松注射液的用量為
7.5mg/kg,每隔日重復(fù)注射I次。
[0011]前述須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，前述真菌懸液中含有分生孢子。[0012]前述須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，前述真菌懸液的濃度為I X 108/mL。
[0013]前述須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，前述固體培養(yǎng)基為SDA培養(yǎng)基。
[0014]本發(fā)明的有益之處在于:提供了一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，此方法具有造模方法簡單，易于操作和推廣的優(yōu)點(diǎn)；利用本發(fā)明的方法獲得的須癬毛癬菌感染兔模型，其更接近實(shí)際，更準(zhǔn)確，更具有實(shí)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是萬博節(jié)皮菌形成的(白色)菌落；
[0016]圖2是萬博節(jié)皮菌的螺旋菌絲；
[0017]圖3是萬博節(jié)皮菌的大小分生孢子；
[0018]圖4是須 癬毛癬菌感染兔模型的組織病理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]1.實(shí)驗(yàn)菌株:萬博節(jié)皮菌(Arthroderma vanbreuseghemii)。
[0020]2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康兔12只，由河北工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，平均體重3±0.2kg,雌雄各半。
[0021]3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:按體重、性別隨機(jī)分為2組，每組6只，A組為實(shí)驗(yàn)組，B組為空白對(duì)照。
[0022]4.接種用真菌懸液的制備:將萬博節(jié)皮菌，接種于SDA固體培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)。10天后成熟，輕輕刮取培養(yǎng)基表面菌落，移至無菌的PBS，研磨成菌絲段(含分生飽子)懸液，調(diào)整濃度為lX108/mL。
[0023]5.動(dòng)物造模:選用健康兔，背部剪毛，常規(guī)消毒后，用無菌的粗砂紙輕輕磨破兔背部皮膚，以觀察到點(diǎn)狀滲血為宜；A組給予糖皮質(zhì)激素處理同時(shí)涂布真菌懸液，B組給予糖皮質(zhì)激素處理同時(shí)涂布無菌生理鹽水；然后，向A組和B組實(shí)驗(yàn)兔的腹腔注射地塞米松，地塞米松注射液的用量為7.5mg/kg，每隔日重復(fù)注射I次；每日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種處皮膚紅斑、脫屑、結(jié)癡和毛發(fā)生長變化。
[0024]6.觀察結(jié)果:A組接種后第5天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開始表現(xiàn)瘙癢癥狀，第10天患部開始出現(xiàn)斷毛或脫毛，皮膚紅腫；B組未見病變。
[0025]7.結(jié)論:須癬毛癬菌感染兔模型構(gòu)建成功。
[0026]8.進(jìn)一步確認(rèn)模型構(gòu)建成功與否:取材進(jìn)行直接鏡檢，分離培養(yǎng)，組織病理學(xué)檢查確認(rèn)模型構(gòu)建成功與否。
[0027](I)真菌鏡檢及分離培養(yǎng):接種后第4天開始刮取少許動(dòng)物背部接種處皮屑進(jìn)行10% KOH常規(guī)鏡檢，后隔日進(jìn)行一次，直至處死動(dòng)物；于接種后第10天處死動(dòng)物，刮取皮屑并剪除接種處皮膚表面毛發(fā)進(jìn)行直接鏡檢，同時(shí)接種于含氯霉素和放線菌酮的SDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0028](2)組織病理檢查:動(dòng)物處死后，剪取接種處全層皮膚組織，中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色。[0029]9.直接鏡檢，分離培養(yǎng)，組織病理學(xué)檢查結(jié)果:
[0030](I)直接鏡檢:病料用KOH方法處理后，顯微鏡觀察，無論在角化細(xì)胞，還是脫落的毛發(fā)中，均可觀察到萬博節(jié)皮菌的菌絲和孢子。
[0031](2)分離培養(yǎng):在含氯霉素和放線菌酮的SDA培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，可觀察到萬博節(jié)皮菌的生長，菌落為白色，如圖1所示；顯微鏡觀察，可見典型的螺旋菌絲，如圖2所示；另外，顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)圓形小分生孢子較多，呈葡萄狀，大分生孢子較少，呈棒狀，有分隔，如圖3所示；培養(yǎng)菌株進(jìn)行尿素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陽性；培養(yǎng)菌株進(jìn)行ITS區(qū)測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果確認(rèn)其為萬博節(jié)皮菌。
[0032](3)組織病理:顯微鏡觀察，皮膚毛細(xì)血管增加，血管內(nèi)充滿血細(xì)胞，毛囊數(shù)量增多，表皮角質(zhì)細(xì)胞大量脫落，在毛囊內(nèi)可見大量的孢子樣菌絲段，毛囊結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞，如圖4所示。
[0033](4) 綜上所述:通過直接鏡檢，分離培養(yǎng)，組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步確認(rèn)了該須癬毛癬菌感染兔模型構(gòu)建成功。
【權(quán)利要求】
1.一種須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)接種用真菌懸液的制備:將真菌接種于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，成熟后刮取培養(yǎng)基表面菌落，移至無菌的PBS，研磨成菌絲段，制備懸液，所述真菌為萬博節(jié)皮菌； (2)動(dòng)物造模:健康兔，背部剪毛，消毒后，用無菌砂紙磨破其背部皮膚，給予糖皮質(zhì)激素處理同時(shí)涂布真菌懸液，然后向腹腔注射地塞米松，地塞米松注射液的用量為7.5mg/kg,每隔日重復(fù)注射I次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述真菌懸液中含有分生孢子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述真菌懸液的濃度為lX108/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的須癬毛癬菌感染兔模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為SDA 培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】A61K36/06GK103948639SQ201410205461
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】劉彥威, 劉娜, 劉利強(qiáng), 杜鵑, 石玉祥, 張永英, 王慧真 申請(qǐng)人:河北工程大學(xué)