重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療皮膚組織衰老與創(chuàng)傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8）在制備治療由內(nèi)源性和外源刺激因素引起的與皮膚組織衰老與由外力、運(yùn)動(dòng)、術(shù)后等引起的皮膚創(chuàng)傷藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明分別建立了大鼠皮膚衰老模型與皮膚創(chuàng)傷模型，經(jīng)過(guò)rLZ-8給藥治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在皮膚衰老方面rLZ-8明顯改善皮膚衰老模型生理指標(biāo)；在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)方面rLZ-8能夠促進(jìn)皮膚組織的生長(zhǎng)因子分泌，明顯加速大鼠皮膚組織的創(chuàng)傷愈合；得到rLZ-8能夠有效修復(fù)大鼠皮膚組織衰老與創(chuàng)傷的結(jié)論。
【專利說(shuō)明】重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療皮膚組織衰老與創(chuàng)傷藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，重點(diǎn)涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備皮膚組織衰老與創(chuàng)傷藥物中的應(yīng)用，具體涉及皮膚衰老大鼠模型與皮膚創(chuàng)傷大鼠模型的建立；治療程序的設(shè)計(jì)以及治 療結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，重點(diǎn)涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療皮膚衰老大鼠模型與皮膚創(chuàng)傷大鼠模型中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚衰老，主要由內(nèi)部原因和外部原因引起，其中，內(nèi)在因素:1)皮膚附屬器官功能的自然減退例如皮膚的汗腺、皮膚腺功能降低，分泌物減少，使皮膚的皮膚膜、角質(zhì)層缺乏滋潤(rùn)而干燥，造成干紋、脫皮現(xiàn)象。2)由于皮膚新陳代謝減慢，真皮內(nèi)的保濕因子減少，使得真皮內(nèi)彈力纖維和膠原纖維功能減退，造成皮膚張力，彈力減弱，使皮膚容易出現(xiàn)皺紋。
3)面部的皮膚較身體其他部位皮膚薄。由于皮膚的營(yíng)養(yǎng)障礙，使得皮下脂肪儲(chǔ)存逐漸減少，細(xì)胞和纖維組織營(yíng)養(yǎng)不良，性能下降。4)生物體酶逐漸減少，身體各方面技能減退，使得大量的自由基破壞人體細(xì)胞，使細(xì)胞死亡。外在因素:1)保養(yǎng)不當(dāng)，缺乏對(duì)皮膚的護(hù)理，或不正確的皮膚護(hù)理程序。2)寒冷、干燥的氣候，使得皮膚的各項(xiàng)機(jī)能減退，皮膚缺乏水分。3)過(guò)度暴露在陽(yáng)光下，引起皮膚老化。4)造成皮膚衰老的主要原因是由于毛孔平常受到死亡細(xì)胞的阻塞，影響新陳代謝所致。
[0003]皮膚創(chuàng)傷，最輕度的創(chuàng)傷僅限于皮膚表皮層，可通過(guò)上皮再生愈合。稍重者有皮膚和皮下組織斷裂，并出現(xiàn)傷口 ；嚴(yán)重的創(chuàng)傷可有肌肉、肌鍵、神經(jīng)的斷裂及骨折。皮膚附屬器(毛囊、汗腺及皮脂腺)如遭完全破壞，則不能完全再生，而出現(xiàn)瘢痕修復(fù)。肌腱斷裂后，初期也是瘢痕修復(fù)，但隨著功能鍛煉而不斷改建，膠原纖維可按原來(lái)肌腱纖維方向排列，達(dá)到完全再生。皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程:
1.傷口的早期變化傷口局部有不同程度的組織壞死和血管斷裂出血，數(shù)小時(shí)內(nèi)便出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為充血、漿液滲出及白細(xì)胞游出，故局部紅腫。傷口中的血液和滲出液中的纖維蛋白原很快凝固形成凝塊，有的凝塊表面干燥形成痂皮，凝塊及痂皮起著保護(hù)傷口的作用。
[0004]2.傷口收縮2~3日后邊緣的整層皮膚及皮下組織向中心移動(dòng)，于是傷口迅速縮小，直到14天左右停止。傷口收縮的意義在于縮小創(chuàng)面。
[0005]3.肉芽組織增生和瘢痕形成大約從第3天開(kāi)始從傷口底部及邊緣長(zhǎng)出肉芽組織填平傷口。第5~6天起纖維母細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維，其后一周膠原纖維形成甚為活躍，以后逐漸緩慢下來(lái)。隨著膠原纖維越來(lái)越多，出現(xiàn)瘢痕形成過(guò)程，大約在傷后一個(gè)月瘢痕完全形成。
[0006]4.表皮及其它組織再生創(chuàng)傷發(fā)生24小時(shí)內(nèi)，傷口邊緣的基底細(xì)胞即開(kāi)始增生，并在凝塊下面向傷口中心遷移，形成單層上皮，覆蓋于肉芽組織的表面。當(dāng)這些細(xì)胞彼此相遇時(shí)，則停止遷移，并增生、分化成為鱗狀上皮。健康的肉芽組織對(duì)表皮再生十分重要，因?yàn)樗商峁┥掀ぴ偕璧臓I(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子。如果肉芽組織長(zhǎng)時(shí)間不能將傷口填平并形成瘢痕，則上皮再生將延緩；在另一種情況下，由于異物及感染等刺激而過(guò)度生長(zhǎng)的肉芽組織(Exuberant granulation),高出于皮膚表面,也會(huì)阻止表皮再生，因此臨床常需將其切除。若傷口過(guò)大(一般認(rèn)為直徑超過(guò)20cm時(shí))，則再生表皮很難將傷口完全覆蓋，往往需要植皮。
[0007]靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(FungalImmunomodulatory Protein of Ganodermalucidium, LZ_8)是1989年Kino等從靈芝菌絲體提取物中分離到第一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。以往研究表明，LZ-8具有抑制小鼠系統(tǒng)性過(guò)敏反應(yīng)，刺激人類外周血淋巴細(xì)胞增殖和IL-2、TNF-a和IFN-Y等細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫學(xué)活性。利用已構(gòu)建的畢赤酵母GS115菌株重組表達(dá)rLZ-8及相應(yīng)的中試純化工藝獲得重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)。rLZ-8作為重組蛋白免疫調(diào)節(jié)制劑，具有多種免疫功能，它可避免化療在發(fā)揮抗癌、抑癌作用的同時(shí)所帶來(lái)的一系列毒副反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的是提供重點(diǎn)涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備皮膚修復(fù)藥物中的應(yīng)用，重點(diǎn)考察了皮膚衰老大鼠模型與皮膚創(chuàng)傷大鼠模型治療效果的影響，建立了皮膚衰老大鼠模型與皮膚創(chuàng)傷大鼠模型，采用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)處理，得出rLZ-8在皮膚衰老大鼠模型與皮膚創(chuàng)傷大鼠模型治療中具有顯著療效。具體
【發(fā)明內(nèi)容】
如下: 皮膚修復(fù)模型建立:1)皮膚衰老大鼠模型:選用健康的雌性Wistar大鼠，頸背部皮下注射D-半乳糖造模，連續(xù)注射數(shù)周。顯微鏡觀察模型建立情況。2)皮膚創(chuàng)傷大鼠模型:選用健康的雌性SD大鼠，體 重240-290克之間，大鼠用5%的Na2S背部脫毛，于背部造成I個(gè)全厚皮缺損創(chuàng)面，直徑為1.5cm，深達(dá)肌層。
[0009]實(shí)驗(yàn)分組和給藥方式:1)皮膚衰老大鼠:78只雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為6組(n=13):正常對(duì)照組、衰老模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組；正常對(duì)照組與衰老模型組注射生理鹽水(0.1ml),陽(yáng)性對(duì)照組注射維生素E (80mg/kg/d), rLZ-8 低劑量組(8ug/kg/d), rLZ-8 中劑量組(16ug/kg/d), rLZ-8 高劑量組(32ug/kg/d)。連續(xù)注射14天。2)皮膚創(chuàng)傷大鼠模型:創(chuàng)傷對(duì)照組采用等量的生理鹽水，治療組大鼠傷口進(jìn)行直接給藥治療(將藥物直接涂抹于大鼠創(chuàng)傷傷口處，rLZ-8給藥濃度為125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)、外周4點(diǎn)給藥治療(取大鼠傷口外周4點(diǎn)進(jìn)行給藥治療，rLZ_8給藥濃度為 125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)和灌胃給藥,rLZ-8 給藥濃度為 125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg,各組均采用獨(dú)立飼養(yǎng)模式,每天給藥I次,持續(xù)2周。
[0010]檢測(cè)項(xiàng)目和方法:1)皮膚衰老模型:主要檢測(cè)項(xiàng)目為皮膚含水率、皮膚中羥脯氨酸含量、皮膚中透明質(zhì)酸含量、體內(nèi)SOD含量、體內(nèi)MDA含量、體內(nèi)脂褐素(LF)含量以及HE染色皮膚組織鏡下觀察病理變化等。其中采用超氧化物歧化酶(SOD)，ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D公司)測(cè)定大鼠血漿及皮膚組織中的SOD含量，按照SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作；利用ELISA試劑盒(R&D公司)測(cè)定大鼠血漿及皮膚組織中的HA含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作；使用考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定皮膚蛋白含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作；利用羥脯氨酸(Hyp) ELISA試劑盒(R&D公司)測(cè)定大鼠血漿及皮膚組織中的Hyp含量；以丙二醛(MDA) ELISA試劑盒(R&D公司)測(cè)定大鼠血漿及皮膚組織中的MDA含量。2)皮膚創(chuàng)傷模型:主要檢測(cè)項(xiàng)目為大鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、大鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)生長(zhǎng)因子以及肉芽組織的羥普氨酸含量等。其中FGF、EGF、VEGF等項(xiàng)目采用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫法測(cè)定，肉芽組織的羥脯氨酸含量利用羥脯氨酸(Hyp) ELISA試劑盒(R&D公司)測(cè)定。
[0011]實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì):本發(fā)明主要通過(guò)皮膚含水率、皮膚中羥脯氨酸含量、皮膚中透明質(zhì)酸含量、體內(nèi)SOD含量、體內(nèi)MDA含量、體內(nèi)脂褐素(LF)含量以及HE染色皮膚組織鏡下觀察病理變化等指標(biāo)考察rLZ-8大鼠皮膚衰老模型的治療效果的影響，通過(guò)大鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、大鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)生長(zhǎng)因子以及肉芽組織的羥普氨酸含量的檢測(cè)考察rLZ-8對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)傷模型的治療效果。以上述指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)各治療組間進(jìn)行分析檢驗(yàn)得出統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)rLZ-8在皮膚修復(fù)藥物中的應(yīng)用。 [0012]皮膚衰老方面:rLZ-8可以提高皮膚組織中透明質(zhì)酸的含量，抑制由于衰老所導(dǎo)致的皮膚組織含水率的降低；rLZ-8可以提高皮膚組織的重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原的含量，從而改善皮膚的彈性，降低皮膚組織中脂褐素水平，減緩衰老；rLZ-8可以增強(qiáng)大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的水平，減少過(guò)氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平，說(shuō)明rLZ-8可以有效地拮抗D-半乳糖所致皮膚細(xì)胞的衰老。
[0013]皮膚創(chuàng)傷方面:三種給藥途徑都能在同一時(shí)間點(diǎn)達(dá)到一致的治療效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠創(chuàng)傷后，rLZ-8能夠在7天內(nèi)顯著調(diào)節(jié)大鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、大鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，同時(shí)穩(wěn)步提高肉芽組織的羥脯氨酸含量，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量間接反應(yīng)膠原的含量，了解創(chuàng)面愈合過(guò)程中膠原代謝狀況。隨著膠原合成的不斷增加，缺損組織得以逐漸填補(bǔ)，創(chuàng)面縮小，進(jìn)而愈合。
[0014]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1 40倍放大下各組大鼠模型皮膚組織HE染色照片對(duì)比 圖2 200倍放大下各組大鼠模型皮膚組織HE染色照片對(duì)比
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例1 rLZ-8對(duì)大鼠皮膚衰老的治療作用
1.1實(shí)驗(yàn)方法
1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料:
rLZ-8、維生素E、生理鹽水、D-半乳糖、蒸餾水、ImL一次性注射器、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA) ELISA試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、羥脯氨酸(Hyp) ELISA試劑盒、HA ELISA試劑盒(R&D公司)
1.1.2儀器設(shè)備:
分析天平、立式壓力蒸汽滅菌器、離心機(jī)、雙人超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、4°C冰箱、低溫冰箱(_80°C)、普通酶標(biāo)儀。
[0015]1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
健康成年Wistar大鼠，雌性，體重240-260克，SPF級(jí)。在吉林大學(xué)SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間控制室溫在(20±2) °C，12小時(shí)交替照明，小鼠自由飲水、取食。
[0016]1.1.4實(shí)驗(yàn)分組與給藥程序:78只雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為6組(n=13):正常對(duì)照組、衰老模型組、維生素E陽(yáng)性對(duì)照組、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ_8高劑量組；正常對(duì)照組每天頸背部皮下注射生理鹽水0.lml/10g BW，其余各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg(相當(dāng)于注射容量為0.lml/10g Bff)造模，共7周。建立大鼠亞急性衰老模型。給藥組同時(shí)灌胃給予維生素E或腹腔注射rLZ-8，正常對(duì)照組和衰老模型組給予等體積生理鹽水。藥物劑量如下表所示:
表1皮膚衰老大鼠模型治療分組與給藥程序
【權(quán)利要求】
1.重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療皮膚組織衰老與創(chuàng)傷藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的皮膚衰老，其特征在于該癥狀包括內(nèi)源性和外源刺激因素引起的皮膚衰老。
3.如權(quán)利要求1所述的皮膚創(chuàng)傷，其特征在于該癥狀包括外力、運(yùn)動(dòng)、術(shù)后等引起的皮膚創(chuàng)傷。
4.如權(quán)利要求1所述藥物，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權(quán)利要求1所述的融合蛋白和任選的藥學(xué)可接受的 輔劑組成。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物制劑給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103933547SQ201410151953
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】孫非, 梁重陽(yáng), 張喜田 申請(qǐng)人:張喜田, 孫非