一株松鼠葡萄球菌、疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一株松鼠葡萄球菌、疫苗及其制備方法，屬生物【技術(shù)領域】。本發(fā)明提供松鼠葡萄球菌（Staphylococcussciuri）NJ1306，保藏號為CCTCC?NO:M2013702。試驗證明松鼠葡萄球菌（Staphylococcussciuri）NJ1306對BALB/c小鼠和仔豬都有致病性。本發(fā)明還提供松鼠葡萄球菌滅活疫苗，含有滅活的NJ1306株。將滅活的松鼠葡萄球菌培養(yǎng)液和佐劑混合均勻，得到松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗。采用本發(fā)明松鼠葡萄球菌NJ1306制成的滅活油乳劑疫苗，可以對BALB/c小鼠提供很好的保護力，說明該菌株具有良好的免疫原性。
【專利說明】一株松鼠葡萄球菌、疫苗及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明屬生物【技術(shù)領域】，具體涉及到一株松鼠葡萄球菌iStaphylococcussciuri)的分離、鑒定，以及該菌在松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗研制中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，葡萄球菌(ste/成Fhcocci)已經(jīng)成為醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，國家細菌耐藥性監(jiān)測中心2002年度的研究發(fā)現(xiàn)，G+菌(革蘭陽性菌)導致的菌血癥所占比例為51.1%，葡萄球菌菌血癥就占了 37%，其中凝固酶陰性葡萄球菌(coagulasenegative staphylococci，CNS)占比例為57.21%,金黃色葡萄球菌占比例為15.28%,血液標本分離的耐苯唑西林的凝固酶陰性葡萄球菌(methici 11 in-resistant coaguIasenegative staphylococci, MRCNS)占凝固酶陰性葡萄球菌的74.7%,凝固酶陰性葡萄球菌的感染愈來愈突出，并且常常為耐藥菌，成為臨床治療的難點，應加強相關研究。
[0003]孟華容收集成都市新都區(qū)人民醫(yī)院2001~2003年484株凝固酶陰性葡萄球菌進行種的鑒定和11種抗生素的耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)在484株葡萄球菌中占前4位的是表皮葡萄球菌165株，木糖葡萄球菌122株，華納氏葡萄球菌78株和松鼠葡萄球菌48株，這些菌對萬古霉素、利復平、呋喃妥因敏感，對氨芐青霉素、紅霉素等耐藥率達80%以上。
[0004]嵇若旭、朱曉東、狄華、單炯從2000年4月到2004年2月，對在上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院住院治療的小兒進行細菌學檢查，同時對發(fā)現(xiàn)的相關菌株進行抗生素敏感性檢測，對所獲得的 陽性結(jié)果作比較分析。他們在8220次細菌學檢測中共發(fā)現(xiàn)1320株陽性細菌，其中202株CNS，占總體檢出率的15.3%(202/1320)，CNS中以溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、模仿葡萄球菌為主要的前5位致病菌。這些陽性菌株中苯唑西林耐藥CNS占86.63%,所有菌株對萬古霉素保持敏感。結(jié)論:CNS感染已經(jīng)成為兒科臨床醫(yī)療工作中的重要問題之一，其中苯唑西林耐藥CNS菌株呈多重耐藥；針對CNS感染，需要在細菌學檢查的基礎上合理使用抗生素，萬古霉素依然是最后的治療手段。
[0005]耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant5taphylococci,MRS)目前已經(jīng)成為院內(nèi)感染的主要病原菌，并逐漸擴展到社區(qū)。當前，耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)在醫(yī)療機構(gòu)和社區(qū)的蔓延已產(chǎn)生十分嚴重的醫(yī)療危機，嚴重威脅著人類的健康。
[0006]松鼠葡萄球菌在1976年第一次被Kloos和他的同事發(fā)現(xiàn)。松鼠葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci, CNS),廣泛存在于自然界中，同時是人類一個重要的病原，主要引起人類的心內(nèi)膜炎、腹膜炎、敗血癥、尿道感染、盆腔炎癥以及手術(shù)中的傷口感染等。
[0007]國內(nèi)趙卿等1995年自I例腦膜炎患兒的腦脊液和血液中同時分離到松鼠葡萄球菌。李立2012年對中國醫(yī)科大學北京市順義醫(yī)院收治的105例新生兒敗血癥的臨床特點及診療等方面進行回顧性分析.105例新生兒敗血癥血培養(yǎng)陽性率100%，分別是表皮葡萄球菌58例(55.24% )，溶血葡萄球菌28例(26.67% )，松鼠葡萄球菌6例(5.7% )，金黃色葡萄球菌5例(4.76% )，人葡萄球菌人亞種及華納氏葡萄球菌各2例(各1.9% )，B群無乳鏈球菌、耳葡萄球菌、糞腸球菌、母雞腸球菌各I例(各0.9% )。105例中以葡萄球菌為主，共102例，占97.1%。李廷軍、董彥金、邱婷婷2013年報道了松鼠葡萄球菌引起敗血癥I例。唐穎2008年報道了松鼠葡萄球菌型燙傷樣皮膚綜合征I例。
[0008]陳世西等從患有滲出性皮炎的豬心包液中分離到一株高致病性松鼠葡萄球菌。張曦、楊增歧、宋長緒將病豬分離獲得的4株松鼠葡萄球菌進行動物回歸試驗，發(fā)現(xiàn)接種了該菌的豬表現(xiàn)為精神沉郁，食欲下降，全身出現(xiàn)薄的、灰棕色的片狀滲出物，隨后陸續(xù)死亡，說明松鼠葡萄球菌對人和動物都有較大的危害。
[0009]隨著抗菌藥物在動物和人群中的大量使用，葡萄球菌的耐藥也越來越嚴重，耐藥松鼠葡萄球菌菌株的出現(xiàn)也越來越多，耐藥性細菌的產(chǎn)生使得一些常用藥物的療效下降甚至失去療效，如青霉素類、四環(huán)素類、氨基糖甙類、磺胺類等藥物在畜禽中已大量產(chǎn)生抗藥性，臨床效果越來越差。隨著獸用抗菌藥物應用范圍和種類的日益擴大，細菌耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)呈現(xiàn)激增趨勢，將來很可能出現(xiàn)對主要抗生素耐藥的“超級細菌”。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的首要目的是提供一株松鼠葡萄球菌iStaphylococcus sciuri ) NJ1306,該菌株對BALB/c小鼠和仔豬都有致病性。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供松鼠葡萄球菌滅活疫苗，可以對免疫動物提供良好的保護力，避免了抗生素的濫用，以防“超級細菌”出現(xiàn)。
[0012]本發(fā)明的再一目的在于提供松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，該方法簡單，成本低。
[0013]本發(fā)明的目的采用下述技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0014]本發(fā)明提供松鼠葡萄球菌sciari)NJ1306,保藏號為CCTCC NO:M 2013702。
[0015]本發(fā)明還提供松鼠葡萄球菌滅活疫苗，含有滅活的所述松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJl 306。
[0016]在本發(fā)明中，所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗為油乳劑。
[0017]在本發(fā)明中，所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗的佐劑為MONTANIDE ISA 760 VG。
[0018]本發(fā)明還提供松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，包含以下步驟:
(I)將所述松鼠葡萄球菌iStaphylococcus sciuri ) NJ1306的培養(yǎng)液,采用甲醒滅活，得到滅活的松鼠葡萄球菌培養(yǎng)液。
[0019](2)將滅活的松鼠葡萄球菌培養(yǎng)液和佐劑混合均勻，得到松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗。
[0020]優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(1)中所述甲醛的加入量為松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri ) NJ1306 培養(yǎng)液體積的 0.4-0.6%。
[0021]在本發(fā)明中，步驟(1)中所述松鼠葡萄球菌sciari) NJ1306培養(yǎng)液的制備方法如下:將松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri ) NJ1306接種于THB液體培養(yǎng)基，36-38 °C培養(yǎng)20-28h，得到所述培養(yǎng)液。
[0022]優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(1)中所述采用甲醛滅活的條件為在36_38°C條件下滅活45-50h。優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)中所述的佐劑為MONTANIDE ISA 760 VG。[0023]本發(fā)明經(jīng)過聚合酶鏈式反應、生化試驗、革蘭氏染色、形態(tài)學觀察證實所分離的葡萄球菌為松鼠葡萄球菌，命名該菌為松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri) NJ1306。
[0024]經(jīng)過BALB/c小鼠、新西蘭兔、長白仔豬的動物實驗:BALB/c小鼠6只，腹腔注射
2X IO9 CFU/只，24h內(nèi)死亡5只，48h內(nèi)死亡I只；2公斤新西蘭兔3只，耳靜脈注射5 X IO9CFU/只，存活；5日齡長白仔豬2頭，肌肉注射IXIOki CFU/頭，2頭都發(fā)病(皮膚形成灰褐色形狀不整的紅斑和結(jié)痂)，皮膚與血液都培養(yǎng)出相同的細菌。證實該菌對BALB/c小鼠和仔豬都有致病性。
[0025]將該菌制備成松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗，免疫5只7周齡BALB/c小鼠，
0.2mL/只，免疫14天后，用該菌24h培養(yǎng)的活菌攻毒，2X IO9CFU/只，4只存活，I只死亡。未免疫對照5只用相同劑量攻毒全部死亡。BALB/c小鼠免疫對比的重復試驗:取12只7周齡BALB/c小鼠，隨機選取6只作為油乳劑疫苗組，剩余的小鼠作為對照組。油乳劑疫苗組小鼠免疫松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗，0.2mL/只；對照組不免疫。免疫14天后，用該菌24h培養(yǎng)的活菌對兩組小鼠進行攻毒，2 X IO9CFU/只。油乳劑疫苗組的6只BALB/c小鼠存活，對照組中的6只小鼠全部死亡。上述結(jié)果說明松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗對BALB/c小鼠能夠提供良好的免疫力，通過免疫對比試驗，證明該菌具有良好的免疫原性。
[0026]有益效果
I)本發(fā)明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri ) NJ1306對BALB/c小鼠和仔豬都有致病性。
[0027]2)本發(fā)明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJ1306米用PCR鑒定為耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococci，MRS),含 mecA 基因，此基因編碼青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)與β _內(nèi)酰胺類抗生素親和力較低，因此對這類抗生素不敏感，，使其表現(xiàn)出耐藥性。
[0028]3)米用本發(fā)明松鼠葡萄球菌(5?<3/成r/ococciAs sciari)NJ1306 和 MONTANIDE ISA760 VG制成的滅活油乳劑疫苗，免疫后攻毒，可以對BALB/c小鼠提供很好的保護力，說明本發(fā)明松鼠葡萄球菌iStaphylococcus sciuri ) NJ1306具有良好的免疫原性,可以作為疫苗用菌株。采用本發(fā)明疫苗可以預防感染松鼠葡萄球菌，避免了抗生素的濫用，以防出現(xiàn)“超級細菌”。
[0029]4)本發(fā)明首次提供了一種免疫效果較好的松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗。該松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗的制備方法簡單，成本低。試驗證明該疫苗有免疫保護作用，可以用于動物預防。目前針對松鼠葡萄球菌病，尚無理想的適合動物和人群的疫苗，所以預防松鼠葡萄球菌病，不僅僅是對動物的保護，更是對人的保障。因此，本發(fā)明所述的松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗的市場前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是PCR檢測葡萄球菌屬特異性16S rRNA (Staph 16S rRNA)、殺白細胞素基因(PVL)及耐藥基因Qneck)的電泳圖，其中泳道M為Marker ;泳道I為葡萄球菌屬特異16SrRNA、PVL和基因的多重PCR擴增產(chǎn)物，泳道2為葡萄球菌屬特異性16S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物，泳道3為殺白細胞素基因(PVL)的PCR擴增產(chǎn)物，泳道4為耐藥基因ipwck)的PCR擴增產(chǎn)物。[0031]圖 2 PCR 檢測 23S rDNA、Exh-A, Exh-B, Exh-C, Exh-D 基因的電泳圖，其中泳道M: Marker ;泳道I為23S rDNA擴增產(chǎn)物；泳道2-5分別為脫皮毒A、B、C、D的擴增產(chǎn)物，23S rDNA的產(chǎn)物為此PCR的陽性對照，此基因的成功擴增證實所提取的基因組質(zhì)量和含量均沒有問題。
[0032]圖3是菌株的革蘭氏染色后的顯微鏡照片。
[0033]圖4是本發(fā)明菌株對長白仔豬致病力試驗的圖片。
[0034]圖5顯示了感染不同劑量松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri )NJ1306的小鼠存活情況。
[0035]圖6顯示了 BALB/c小鼠免疫對比實驗中各組小鼠攻毒后存活率隨時間的變化。
[0036]圖7顯示了 BALB/c小鼠免疫對比的重復試驗中各組小鼠攻毒后存活率隨時間的變化。
【具體實施方式】
[0037]材料:
PCR Mix:廣州東盛生物科技有限公司；
DNA膠回收試劑盒:Axygen公司；
葡萄球菌 屬TH-16S細菌生化編碼鑒定管:杭州天和微生物試劑有限公司；
Bacto? Todd Hewitt Broth (THB)培養(yǎng)基:BD 公司；
THB液體培養(yǎng)基:稱取30g THB培養(yǎng)基，用去離子水溶解后定容至1000mL，121°C高壓滅菌20分鐘；
THB固體培養(yǎng)基:每1000mL THB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉，121°C高壓滅菌20分鐘，適量傾入平皿中凝固；
商品油乳佐劑MONTANIDE ISA 760 VG:法國SEPPIC公司。
[0038]實施例1松鼠葡萄球菌(5?<3/成r/ococciAs sciuri ) NJ1306的分離和鑒定 從江蘇省南京市某豬場采集發(fā)病仔豬皮膚結(jié)痂樣品和心包積液，分離到了松鼠葡萄球
菌{Staphylococcus sciuri ) NJl 306。
[0039](I)增菌培養(yǎng):
將發(fā)病仔豬皮膚結(jié)痂樣品和心包積液，放入5mL THB液體培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)16~18h，收獲培養(yǎng)物，備用。
[0040](2)細菌的純培養(yǎng):
將步驟(1)中所述培養(yǎng)物采用劃線法接種至THB固體培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種THB液體培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)24h，得到單菌的增殖菌液。
[0041](3)細菌的基因鑒定:
將步驟(2)所述增殖菌液進行離心，采用常規(guī)方法提取菌體的總DNA作為模板，以StaphF和StaphR為引物擴增16S rRNA基因片段，然后測序，序列如SEQ ID N0:1所示。
[0042]StaphF 的序列為:AACTCTGTTATTAGGGAAGAACA ; StaphR 的序列為:CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC。
[0043]將測序結(jié)果與GenBank上的已知序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該菌與松鼠葡萄球菌DSM20345的核酸序列同源性達到99.6%，確定分離到的菌株為松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri )，命名為松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri) NJ1306。
[0044]以松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJ1306的總DNA為模板，米用PCR鑒定其是否含殺白細胞基因(Panton-Valentine leukocidin, PVL)、耐藥性mecA基因，結(jié)果如圖1所示。以Luk-PVF和Luk-PVR為引物，沒有擴增到PVL基因，說明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri) NJl306不含殺白細胞基因。以MecAF和MecAR為引物，擴增到了 310 bp 的 MecA 基因，說明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJ1306 含 mecA 基因，此基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)與β _內(nèi)酰胺類抗生素親和力較低，因此對這類抗生素不敏感，因此，松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri)NJ1306為耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistantMRS)。
[0045]從圖2中，可以看出以松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri )NJ1306的總DNA為模板，可以擴增到662 bp的23S ri)NA (陽性對照)，但是不能擴增到脫皮毒素基因(Exh-A，Exh-Bj Exh-Cj Exh-D),說明松鼠葡萄球菌 iStaphylococcus sciuri) NJ1306 不含脫皮毒素基因(Exh-A，Exh-Bj Exh-Cj Exh-D)0
[0046]上述PCR中擴增各基因的引物及目的產(chǎn)物如表1和2所示。
[0047]表1 PCR檢測葡萄球菌屬特異性16S rRNA、殺白細胞素基因及耐藥基因的引物序列
【權(quán)利要求】
1.松鼠葡萄球菌(泣sciari)NJ1306，保藏號為CCTCC NO: M 2013702。
2.松鼠葡萄球菌滅活疫苗，其特征在于含有滅活的權(quán)利要求1所述松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciari ) NJ1306。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗，其特征在于所述疫苗為油乳劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗，其特征在于所述油乳劑疫苗的佐劑為MONTANIDE ISA 760 VG。
5.松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于包含以下步驟: (1)將權(quán)利要求1所述松鼠葡萄球菌sciuri) NJ1306的培養(yǎng)液,采用甲醛滅活，得到滅活的松鼠葡萄球菌培養(yǎng)液； (2)將滅活的松鼠葡萄球菌培養(yǎng)液和佐劑混合均勻，得到松鼠葡萄球菌滅活油乳劑疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述甲醒的加入量為松鼠葡萄球菌(taphylococcus sciuri ) NJ1306培養(yǎng)液體積的0.4-0.6%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述松鼠葡萄球菌sciuri) NJ1306培養(yǎng)液的制備方法如下:將松鼠葡萄球舊(Staphylococcus)NJ1306 接種于 THB 液體培養(yǎng)基，36_38°C培養(yǎng) 20_28h，得到所述培養(yǎng)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7之一所述松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于:步驟Cl)中采用甲醛滅活的條件為在36-38°C條件下滅活45-50h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的松鼠葡萄球菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的佐劑為MONTANIDE ISA 760 VG。
【文檔編號】A61K39/085GK103865859SQ201410130127
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】呂立新, 何孔旺, 倪艷秀, 俞正玉, 茅愛華, 周俊明, 張雪寒, 郭容利, 李彬, 溫立斌, 王小敏, 汪偉 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院