一種番鴨細(xì)小病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種番鴨細(xì)小病毒，為YBMDV株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.8504。本發(fā)明篩選的番鴨細(xì)小病毒具有毒性小，且免疫原性高的特點(diǎn)，用番鴨細(xì)小病毒YBMDP株接種番鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。能提高種番鴨的抗體，保證其子代母源抗體水平，預(yù)防番鴨細(xì)小病毒引起的雛鴨細(xì)小病毒感染，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種番鴨細(xì)小病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家禽病源微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種番鴨細(xì)小病毒及其在制備疫苗、抗體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]番鴨細(xì)小病毒病是侵害雛番鴨的一種急性或亞急性傳染病，是以喘氣、腹瀉及胰臟壞死和出血為主要特征的傳染病；具有高度傳染性，且發(fā)病率和死亡率都很高，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要發(fā)生于1~3周齡的雛番鴨，尤其是10日齡左右的雛番鴨，而當(dāng)達(dá)到3周齡以上就基本不發(fā)病了。本病最早于20世紀(jì)80年代中后期出現(xiàn)于中國(guó)福建和法國(guó)西部Brittany地區(qū)，20世紀(jì)90年代初才認(rèn)識(shí)到它是不同于小鵝瘟的獨(dú)立疾病。如果對(duì)死亡的番鴨處理不當(dāng)，往往造成病毒的蔓延，產(chǎn)生更大的危害。因此，就需要篩選出效價(jià)高、免疫原性好的番鴨細(xì)小病毒來(lái)制備疫苗。而且，由于病毒變異導(dǎo)致使用的疫苗效價(jià)降低，也需要篩選出變異的病毒株來(lái)制備療效更高的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種篩選出的番鴨細(xì)小病毒，及其在制備疫苗中的應(yīng)用；用該病毒制備的疫苗具有高效、安全性好、保護(hù)率高的優(yōu)點(diǎn)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明首先提供一種番鴨細(xì)小病毒，為YBMDV株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8504。
[0005]本發(fā)明的番鴨細(xì)小病毒用于制備滅活疫苗；
[0006]本發(fā)明的番鴨細(xì)小病毒還用于制備免疫抗體。
[0007]本發(fā)明篩選的番鴨細(xì)小病毒具有毒性小，且免疫原性高的特點(diǎn)，用番鴨細(xì)小病毒YBMDP株接種番鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。能提高種番鴨的抗體，保證其子代母源抗體水平，預(yù)防番鴨細(xì)小病毒引起的雛鴨細(xì)小病毒感染，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0009]一、YBMDV 株的篩選
[0010]2011年浙江省某鴨場(chǎng)爆發(fā)了急性的番鴨細(xì)小病毒病，取病死鴨的胰臟及腸道，將胰臟及腸道組織用無(wú)生理鹽水勻漿制成20%懸液，3000r/min離心15min，取上清除菌后經(jīng)尿囊腔分別接種13日齡番鴨胚，孵化120小時(shí)，收集尿囊液及胚體組織，經(jīng)勻漿后，反復(fù)凍融3次，取上清液凍存。收獲的病毒液經(jīng)純化后進(jìn)行了病毒含量、免疫原性、特異性及純凈性等方面的病毒特性的分析檢測(cè)，結(jié)果表明該毒株病毒含量為105_7ELD5(l/0.2ml,最小免疫劑量為102_°ELD5(i/0.2ml，該病毒僅與番鴨細(xì)小病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，無(wú)細(xì)菌、支原體及外源病毒污染，適合作為制苗用毒株。將篩選YBMDV株于2013年11月08日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8504。
[0011]對(duì)于本發(fā)明篩選的毒株的性狀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該株病毒屬細(xì)小病毒，圓形無(wú)囊膜，直徑在20μ m左右、對(duì)乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，對(duì)紅細(xì)胞無(wú)凝集現(xiàn)象。該病毒可引起雛番鴨發(fā)生以出血性腸炎為特征的急性敗血性傳染病。該毒株制備的疫苗免疫成年番鴨后，能保護(hù)免疫4個(gè)月內(nèi)番鴨所產(chǎn)子代免受流行毒株的攻擊。該毒株作100倍稀釋后，與等量雛番鴨細(xì)小病毒病抗血清中和，接種13日齡番鴨胚，結(jié)果表明，中和組番鴨胚全部健活，而病毒對(duì)照組番鴨胚全部死亡。
[0012]對(duì)篩選的YBMDV株的結(jié)構(gòu)基因VP進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果VP全長(zhǎng)為2199bp，編碼732個(gè)氨基酸；NCBI的blast序列分析表明，YBMDV株的結(jié)構(gòu)基因VP與已公開的番鴨細(xì)小病毒的VP存在差異位點(diǎn)，同源性為97.7%~98.3% (即存在著9_16個(gè)氨基酸的差異)。
[0013]為了檢測(cè)上述氨基酸的差異對(duì)YBMDV株抗原性的影響，用YBMDV株來(lái)制備抗原來(lái)檢測(cè)其免疫原性。
[0014]二、制苗用抗原的制備
[0015]1.制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種YBMDV株，尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚，每胚0.2ml，36~37°C孵育，每日2次照胚檢查。選擇接種后48~120小時(shí)內(nèi)死亡，且胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨毛尿膜有輕度水腫的胚，取其尿囊液及胚體放入組織搗碎機(jī)中粉碎，取粉碎后的組織按1:2加入生理鹽水混合；置2~8°C 4~12小時(shí)，收取尿囊 液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2~8°C保存。
[0016]2.滅活將YBMDV株病毒液置于滅活瓶?jī)?nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.2%。加甲醛溶液后倒入另一滅活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)后取出，置2~8°C保存。
[0017]3.半成品檢驗(yàn)
[0018](I)無(wú)菌檢驗(yàn)取滅活的胚液，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。
[0019](2)病毒含量測(cè)定將病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_2、10_3、10_4、10_54個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚，每胚0.2ml,同時(shí)設(shè)接種生理鹽水對(duì)照5枚，每胚0.2ml。置36~37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計(jì)算ELD5Q。
[0020](3)滅活檢驗(yàn)將YBMDV株滅活后的病毒液尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚10枚，每胚0.2ml，置36~37°C繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察168小時(shí)。
[0021]三、滅活疫苗的制備:經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計(jì))。
[0022](I)油相制備取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加司本一 805份，至溫度達(dá)到115°C時(shí)，維持30min，冷卻后備用。
[0023](2)水相制備將滅活檢驗(yàn)合格的YBMDV株病毒液適當(dāng)比例混合，使每0.2ml水相中含YBMDV株病毒含量不低于104_°ELD5(i。取滅菌后的吐溫-805份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液95份，開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20~30min，使吐溫-80完全溶解。
[0024](3)乳化取油相2份放于高速剪切機(jī)內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相1份，以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后,取IOml,以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過(guò)0.5ml。
[0025]四、疫苗成品檢驗(yàn)
[0026]( I)性狀
[0027]外觀疫苗應(yīng)為乳白色乳劑，無(wú)雜質(zhì)并且外包裝應(yīng)合格。
[0028]劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。
[0029]穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過(guò)0.5ml。
[0030]黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
[0031](2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
[0032](3)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
[0033](4)安全檢驗(yàn)用21日齡番鴨10只，每只頸部皮下注射疫苗2.0ml,同時(shí)設(shè)對(duì)照5只，在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)雞采食、飲水及臨床情況。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0034](5)效力檢驗(yàn)
[0035]①血清學(xué)方法用21~35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日齡雞不免疫作對(duì)照，免后21日，采血分離血清，分別測(cè)定番鴨細(xì)小病毒瓊擴(kuò)抗體。免疫組AGP抗體效價(jià)，應(yīng)不低于1:4，對(duì)照組應(yīng)均為陰性。
[0036]②子代母源抗體與攻毒保護(hù)的關(guān)系90日齡種番鴨20只，每只頸部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日齡種番鴨不免疫作對(duì)照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次，收集開產(chǎn)后4月時(shí)所產(chǎn)種蛋孵化出雛，于雛番鴨7日齡時(shí)，免疫組子代取10只，對(duì)照組子代取10只，攻毒YBMDP株，每只肌肉注射0.5ml。免疫組子代保護(hù)率應(yīng)不低于8只，對(duì)照組發(fā)病率應(yīng)不低于9只。
[0037]③對(duì)地方流行毒株的攻毒保護(hù)(毒株的篩選)將各地方流行毒株分別制備滅活疫苗，取90日齡種番鴨20只，每只頸部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日齡種番鴨不免疫作對(duì)照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次，收集開產(chǎn)I個(gè)月內(nèi)所產(chǎn)種蛋孵化出雛，于雛番鴨7日齡時(shí)，免疫組子代取10只，對(duì)照組子代取10只，攻毒6株各地方分離株，每只肌肉注射0.5ml。觀察攻毒保護(hù)情況。
[0038]實(shí)施例1
[0039]一、制苗用抗原的制備
[0040]1.制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種YBMDV株，尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚，每胚0.2ml，36~37°C孵育，每日2次照胚檢查。選擇接種后48~120小時(shí)內(nèi)死亡，且胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨毛尿囊膜有輕度水腫的番鴨胚，取其尿囊液及番鴨胚體放入組織搗碎機(jī)中粉碎，取粉碎后的組織按I: 2加入生理鹽水混合；置2~80C 4~12小時(shí)，收取尿囊液 、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2~8°C保存。(參見表1)。[0041]表1毒液的制備
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種番鴨細(xì)小病毒，其特征在于，所述的番鴨細(xì)小病毒為YBMDV株。
2.如權(quán)利要求1所述的番鴨細(xì)小病毒，其特征在于，所述的番鴨細(xì)小病毒于2013年11月08日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8504。
3.如權(quán)利要求1所述的番鴨細(xì)小病毒，其特征在于，所述的番鴨細(xì)小病毒為圓形無(wú)囊膜，直徑為20μ m左右、對(duì)乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，對(duì)紅細(xì)胞無(wú)凝集現(xiàn)象。
4.權(quán)利要求1所述的番鴨細(xì)小病毒用于制備滅活疫苗。
5.權(quán)利要求 1所述的番鴨細(xì)小病毒用于制備免疫抗體。
【文檔編號(hào)】A61K39/23GK103820397SQ201410082767
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】宮曉, 鄒敏, 朱艷梅, 徐保娟, 李陸梅, 郭偉偉 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司