一種口服重組融合蛋白tat-map30及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30及制備方法和應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)將穿膜肽TAT和苦瓜素MP30結(jié)合，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了一株可生產(chǎn)TAT-MAP30融合蛋白的基因工程菌，CCTCC?NO:M2013546。獲得的TAT-MAP30融合蛋白具有快速穿過(guò)中腸細(xì)胞膜的能力，能降低機(jī)體生物屏障、物理屏障和化學(xué)屏障對(duì)蛋白的損失，可作為口服藥物用于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物抗細(xì)菌、抗病毒的預(yù)防和治療，該融合蛋白的表達(dá)量高，易純化，具有重要的應(yīng)用前景和實(shí)際意義。
【專利說(shuō)明】—種口服重組融合蛋白TAT-MAP30及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30，還涉及一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30的制備方法，還涉及一種能表達(dá)口服重組融合蛋白TAT-MAP30的基因工程菌株，以及一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30的在抗菌、抗病毒中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]MAP30 蛋白
[0003]MAP30 蛋白(mordtca ant1-HIV protein of 30)共由 286 個(gè)氨基酸組成。其基因組由858個(gè)堿基構(gòu)成，其中，包含一個(gè)獨(dú)立的ORF閱讀框，無(wú)內(nèi)含子。前23個(gè)氨基酸為引導(dǎo)肽，在成熟的發(fā)揮功能的MAP30蛋白中沒(méi)有檢測(cè)到引導(dǎo)肽序列。
[0004]目前，MAP30蛋白能使細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞的核糖體失活的具體機(jī)制尚未得到清晰闡述，但是研究推測(cè)，MAP30蛋白的作用機(jī)制主要是通過(guò)改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而使核糖體失活，比如對(duì)超螺旋DNA的切割作用，將其變?yōu)槿笨诃h(huán)狀及線狀DNA，以阻礙蛋白質(zhì)的合成。
[0005]苦瓜蛋白MAP30的生物學(xué)活性較多，主要包括以下幾方面:抗病毒作用，對(duì)艾滋病毒、流感病毒、乙腦病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、肝炎病毒、柯薩奇病毒等均有抑制作用；抗腫瘤作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，黑色素瘤等均有抑制生長(zhǎng)作用；降血糖作用，苦瓜素對(duì)于自發(fā)性高血糖小鼠，以及誘發(fā)性高血糖大鼠均能夠起到促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖濃度，推遲口服蔗糖后血糖升高時(shí)間和降低血糖最高峰值的作用；抗菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有一定的抑菌效果；抗生育作用；免疫原性等。MAP30蛋白的功效很多，還有待進(jìn)一步探索。
[0006]TAT的研究背景
[0007]近年來(lái)發(fā)現(xiàn)有一些小分子的多肽可以介導(dǎo)外源物質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜，這種小分子多肽被稱之為細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。許多CPP都是來(lái)源于某些直接與宿主細(xì)胞相互作用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transductiondomains, PTD)?，F(xiàn)在研究最多、應(yīng)用范圍最廣的細(xì)胞穿膜肽(Trans-activatingtranscriptional activator, Tat)。Tat蛋白中存在3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,分別是:位于N-端的酸性區(qū)，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之間的DNA結(jié)合區(qū)，該區(qū)域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之間的堿性區(qū)，是主要的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，參與Tat蛋白的細(xì)胞內(nèi)化作用。Schwarze發(fā)現(xiàn)位于Tat蛋白中第47_57位之間的11個(gè)氨基酸YGRKKRRQRRR不僅能夠獨(dú)立穿過(guò)細(xì)胞膜，而且其穿膜效率比全長(zhǎng)的Tat蛋白還要高。這段多肽即是TAT穿膜肽。
[0008]不管是單獨(dú)的TAT穿膜肽，或者是攜帶其他大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸或脂質(zhì)體等，在穿膜時(shí)都可以表現(xiàn)出較高的穿膜活性。在攜帶外源物質(zhì)穿膜時(shí)，TAT介導(dǎo)的穿膜似乎與其要攜帶的分子大小無(wú)關(guān)，100KD的蛋白質(zhì)、40nm大小的納米顆粒、甚至200nm大小的脂質(zhì)體都可以經(jīng)TAT運(yùn)載入細(xì)胞內(nèi)。而且，以這種方式運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體甚至可以在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ih后仍然可保持結(jié)構(gòu)的完整性。相反的，沒(méi)有與TAT穿膜肽連接的物質(zhì)在與細(xì)胞共同孵育時(shí)均不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
[0009]TAT穿膜肽的序列中由于有6個(gè)精氨酸和2個(gè)賴氨酸殘基，因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個(gè)堿性氨基酸殘基都會(huì)使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸殘基時(shí)穿膜活性則不會(huì)發(fā)生改變。這說(shuō)明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測(cè)這些正電荷很可能是能夠與真核細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生強(qiáng)的靜電作用，從而介導(dǎo)了穿膜過(guò)程。對(duì)TAT穿膜肽的親和性分析發(fā)現(xiàn)，它能夠與許多細(xì)胞膜表面的陰離子通過(guò)靜電作用強(qiáng)烈地結(jié)合，與之結(jié)合的細(xì)胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸豐富的多肽可以穿過(guò)細(xì)胞膜，而其他氨基酸如賴氨酸、組氨酸等豐富的多肽卻不具有此功能。然而，由精氨酸組成的支鏈聚合物與直鏈聚合物具有同樣的穿膜效率。此外，研究發(fā)現(xiàn)TAT穿膜肽不會(huì)因?yàn)槭中越Y(jié)構(gòu)的改變而影響其穿膜活性，其手性分子與自然結(jié)構(gòu)具有相同的穿膜活性。這說(shuō)明這種細(xì)胞穿膜肽很可能不依賴于特定的結(jié)合位點(diǎn)。然而，多肽的長(zhǎng)度是影響穿膜效率的重要因素。穿膜效率與精氨酸的個(gè)數(shù)有關(guān)，含有6個(gè)或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5個(gè)精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15個(gè)氨基酸時(shí)，穿膜效率會(huì)隨著多肽大小的增加而增強(qiáng)。大于15個(gè)氨基酸的多肽雖然也可具有穿膜活性，但其效率卻會(huì)明顯減小。
[0010]盡管對(duì)于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比較多，但是到目前為止，關(guān)于TAT穿膜肽進(jìn)入細(xì)胞的分子機(jī)制還沒(méi)有完全研究清楚。早期研究認(rèn)為是通過(guò)直接轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制穿過(guò)細(xì)胞膜，且是不依賴于能量的，但最近的研究也有與這一觀點(diǎn)不同的結(jié)果。盡管其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制還沒(méi)有完全研究透徹，但TAT穿膜肽的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛。
[0011]金黃色葡萄球菌
[0012]金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus)是人類的一種重要病原菌,隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus),是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表,可引起許多嚴(yán)重感染,隨著抗生素的濫用，耐藥菌也越來(lái)越多，開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物迫在眉睫。
[0013]金黃色葡萄球菌毒力較強(qiáng)，可以通過(guò)侵襲性和毒素性兩種方式引起宿主疾病:一是在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散和增殖；二是產(chǎn)生外毒素和其他有害物質(zhì)。金黃色葡萄球菌的毒力因子有表面結(jié)構(gòu)蛋白、酶類和毒素三種。
[0014]金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的侵襲性疾病，主要是引發(fā)機(jī)體局部(一般在皮膚中發(fā)生)或全身性的化膿性感染。局部感染分為兩種:①包括毛囊炎、傷口化膿、癤等病變的皮膚性化膿感染；②包括氣管炎、肺炎、骨髓炎、膿胸等病變的個(gè)別器官感染。全身性感染主要是由于金黃色葡萄球菌及其毒素侵入了血液，導(dǎo)致機(jī)體的膿毒血癥、菌血癥和敗血癥。由其引起的毒素性疾病主要是外毒素造成的，主要包括食物中毒(在夏季高發(fā))、燙傷樣皮膚綜合癥和毒性休克綜合癥。
[0015]金黃色葡萄球菌，屬于革蘭氏染色陽(yáng)性菌，球形，顯微鏡下可見(jiàn)其排列呈葡萄串狀，單個(gè)細(xì)菌較小，直徑約為Ium左右。金黃色葡萄球菌結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，沒(méi)有芽孢和鞭毛，一般情況下無(wú)莢膜，但在體外培養(yǎng)時(shí)有時(shí)可觀察到在菌體外層有粘液物質(zhì)，發(fā)揮著同莢膜同樣的保護(hù)性作用。在陳舊培養(yǎng)物中，在某些化學(xué)物質(zhì)如氨芐西林存在時(shí)，或在細(xì)菌生長(zhǎng)處于衰亡期時(shí)，此時(shí)鏡檢可發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌呈缺壁的L型，沒(méi)有規(guī)則形態(tài)。
[0016]金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)境的抵抗能力較強(qiáng)，可以承受一定的干燥、高熱和鹽度。有實(shí)驗(yàn)表明，在干燥的濃汁中保存了 2—3月的細(xì)菌仍然有活性。利用高溫的方法殺死金黃色葡萄球菌，必須使其在60°C中保持I小時(shí)，或80°C中保持30分鐘。金黃色葡萄球菌有一定的滲透壓抵抗力，可以在NaCL濃度為100— 150g/L的培養(yǎng)基中繁殖。
[0017]正因?yàn)橐陨咸攸c(diǎn)，金黃色葡萄球菌感染和污染已經(jīng)成為了一個(gè)世界性的難題。尤其是目前抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥菌株越來(lái)越多，金黃色葡萄球菌中已經(jīng)出現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MARSA)，又名Il超級(jí)細(xì)菌一，一般抗生素(除了萬(wàn)古霉素)對(duì)此種菌株都無(wú)效果。因此，開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物勢(shì)在必行。
[0018]對(duì)蝦白班綜合征病毒(WSSV)
[0019]20世紀(jì)80年代以來(lái),世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展，隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；纳a(chǎn)，以及環(huán)境的日益破壞，其病害問(wèn)題越來(lái)越突出，已經(jīng)成為阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。我國(guó)已經(jīng)成為對(duì)蝦和小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)大國(guó)。1993-1994年我國(guó)對(duì)蝦病毒爆發(fā)流行,產(chǎn)量急劇減少，給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成數(shù)十億元的經(jīng)濟(jì)損失。其中主要包括以下幾種病毒:對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV);桃拉綜合癥病毒(TSV)和黃頭癥病毒(YHV)。其中WSSV是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重的病原體之一。
[0020]蟲(chóng)下白斑綜合癥病毒(WhiteSpot Syndrome Virus，WSSV)自1992年首次在臺(tái)灣爆發(fā)以來(lái)，先后分別在日本、東南亞、北美等國(guó)家爆發(fā)，在全球范圍內(nèi)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。19 95年，聯(lián)合國(guó)糧油組織(FA0)，國(guó)際獸藥局(OIE)以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心(NACA)將其列為需要報(bào)告的水生動(dòng)物病毒性疫病之一。為了進(jìn)一步控制該病原生物的感染，近年來(lái)各國(guó)專家學(xué)者們對(duì)白斑綜合癥病毒進(jìn)行了深入研究，探討了其形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組成、分類學(xué)、感染宿主以及與病毒感染相關(guān)的蛋白。為防治WSSV感染提供了重要的理論依據(jù)。
[0021]WSSV是一種有囊膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其形態(tài)學(xué)與桿狀病毒相似，呈長(zhǎng)桿狀，具有雙層囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣殼及病毒核心三部分。病毒經(jīng)負(fù)染后在電子顯微鏡下可以觀察到在囊膜一端延伸出尾狀結(jié)構(gòu)。在不同的分離株中，有囊膜包裹的病毒其長(zhǎng)度約210-380nm，直徑約70_167nm。除去囊膜的核衣殼部分，其長(zhǎng)度約180_420nm，直徑約54-85nm。自WSSV在全世界范圍內(nèi)爆發(fā)以來(lái)，ICTV現(xiàn)將WSSV列為新建的線頭病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒屬(Whispovirus)的代表種。
[0022]WSSV有較廣的宿主范圍，除了可以感染蝦、蟹類等甲殼動(dòng)物外，橈足類及部分節(jié)肢動(dòng)物也可以成為該病毒的傳播者及攜帶者。許多十足目的甲殼動(dòng)物都是WSSV的感染宿主。VP28蛋白最早是由van Hulten發(fā)現(xiàn)的，對(duì)VP28蛋白的結(jié)構(gòu)分析可以發(fā)現(xiàn)，VP28蛋白的結(jié)構(gòu)中存在5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)及9個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)。同時(shí)，在蛋白的N-端存在強(qiáng)疏水區(qū)，且這個(gè)區(qū)域中包含一個(gè)理論上的跨膜結(jié)構(gòu)域。van Hulten第一次利用VP28蛋白的抗體中和實(shí)驗(yàn)證明了該蛋白與WSSV感染的早期過(guò)程有關(guān)(van Hulten, M.C.ff., ffitteveldt, J., Snippe, Μ., Vlak, J.M..White spot syndromevirus envelope protein VP28is involved in the systemic infection of shrimp[J].Virology, 2001b, 285:228 - 233.)。在 van Hulten 的研究基礎(chǔ)上，Yi 進(jìn)一步研究了 VP28蛋白在WSSV感染過(guò)程中的具體作用，通過(guò)抗體中和實(shí)驗(yàn)、VP28蛋白的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、VP28蛋白及WSSV與對(duì)蝦血細(xì)胞結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)ELISA等，進(jìn)一步證明了 VP28蛋白參與WSSV對(duì)蝦細(xì)胞的吸附及侵入過(guò)程(Yi, G., Wang, Z., Qi, Y., Yao, L., Qian, J., Hu, L..VP28of whitespot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimpcells [J].J.Biochem.Mol.Biol, 2004，37:726 - 734.) ?近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)能夠與 VP28 蛋白相互作用的宿主細(xì)胞表面蛋白主要有PmRab7、HSP70 (heat shock cognate protein70)、STAT(signal transducer and activator of transcription)。近年來(lái)各國(guó)學(xué)者一直致力于對(duì)WSSV流行病學(xué)及致病機(jī)理的研究，以尋找防治WSSV感染的措施和方法。目前防治方法主要有利用免疫增強(qiáng)劑來(lái)調(diào)節(jié)增加對(duì)蝦的抗病毒感染能力、利用中和抗體中和作用來(lái)阻斷WSSV的感染、利用RNA干擾使特定基因沉默以減弱WSSV的感染、利用疫苗使對(duì)蝦體內(nèi)產(chǎn)生抗病的免疫效應(yīng)。目前已經(jīng)研究證明能夠增強(qiáng)對(duì)蝦抗WSSV感染能力的免疫增強(qiáng)劑主要有脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、葡聚糖(Glucan)、肽聚糖(Peptidoglycan，PG)等。Westenberg研究了序列特異性及非特異性的siRNA對(duì)斑節(jié)對(duì)奸(Penaeus monodon)抗 WSSV 感染的保護(hù)作用(Westenberg, M.，Heinhuisj B.，Zuidemaj D.，Vlakj J.M.siRNAinjection induces sequence-1ndependent protection in Penaeus monodon againstwhite spot syndrome virus[J].Virus Res，2009，114:133 - 139)。Namikoshi 的研究中以福爾馬林作為滅活劑制備滅活疫苗，在肌肉注射福爾馬林滅活的WSSV病毒10天后，進(jìn)行病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滅活的WSSV可以在蝦體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)作用，這表明一些囊膜蛋白能夠在蝦體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答并保護(hù)蝦抵抗WSSV的感染(Namikoshi A, WuJLjYamashita TjNishizawa TjNishioka TjArmoto Mj et al.Vaccination trialswith Penaeus japonicus to induce resistance to white spot syndrome virus[J].Aquaculture, 2004, 229:25 - 35) 0然而這種作用十分有限，在注射滅活WSSV病毒20天后就完全失去了保護(hù)作用。Zhu研究的滅活疫苗是以二乙烯亞胺(Binary ethylenimine,ΒΕΙ)作為滅活劑的。BEI是由2-氯乙胺鹽酸鹽經(jīng)環(huán)化作用而形成的，它可以使核苷酸烷基化，但是在較低的濃度(lmmol/L)下不會(huì)使蛋白分子受到破壞，因而以BEI作為滅活劑時(shí)WSSV的囊膜蛋白可以保持完整，能夠在蝦體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答并保護(hù)蝦抵抗WSSV 的感染(Fei Zhuj Huahua Duj Zh1-Guo Miaoj Ha1-Zhi Quanj Z1-Rong Xu.Protectionof Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using inactivatedWSSV[J].Fish&Shellfish Immunology.2009，26:685 - 690)。Witteveldt 利用原核表達(dá)載體在大腸桿菌中分別對(duì)VP28及VP19蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，且重組蛋白N-端與麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)融合表達(dá)。分別將純化的VP28及VP19蛋白通過(guò)肌肉注射到對(duì)蝦體內(nèi)，同時(shí)分別以只注射MBP和生理鹽水的對(duì)蝦組作為對(duì)照。在肌肉注射后第2天及第25天分別進(jìn)行病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，VP28及VP19蛋白注射組存在較高的相對(duì)存活率。因此認(rèn)為對(duì)蝦對(duì)WSSV的結(jié)構(gòu)蛋白存在一定的免疫應(yīng)答，可以提高對(duì)蟲(chóng)下抗 WSSV 感染的能力(Jeroen Witteveldtj Just M.Vlakj Marielle C.W., van Hulten.Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSVsubunit vaccine [J].Fis h&Shellf ish Immunology.2004，16:571-579) ? Du 利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)重組的VP28蛋白，重組蛋白經(jīng)肌肉注射進(jìn)入鰲蝦體內(nèi)。并注射后第10天進(jìn)行病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白對(duì)鰲蝦有較好的保護(hù)作用，與對(duì)照組相比，其相對(duì)致死率已經(jīng)達(dá)到了 92% (Huahua Duj Zirong Xuj Xiaofeng Wuj Weifen Li, WeiDa1.1ncreased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii byinjection of envelope protein VP28expressed using recombinantbaculovirus [J].Aquaculture.2006, 260:39 - 43)。Xu利用桿狀病毒(HyNPV)表達(dá)系統(tǒng)在家蠶體內(nèi)分別表達(dá)重組的VP28及VP19蛋白，并將帶有重組蛋白的家蠶勻漿液包裹蝦飼料，連續(xù)投喂克氏原鰲蝦30天。投喂結(jié)束后即進(jìn)行病毒攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，VP28蛋白組及VP19蛋白組的相對(duì)存活率分別為94.7%和89.5%。這說(shuō)明與肌肉注射相比，口服的亞單位疫苗同樣可以對(duì)克氏原鰲奸產(chǎn)生保護(hù)作用(Zirong Xu a, Huahua Du, YaxiangXu,Jianyi Sun, Jian Shen.Crayfish Procambarus clarkii protected against whitespot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed insilkworms [J].Aquaculture.2006:253, 179 - 183)。Xu 利用畢赤酵母(Pichia pastoris)對(duì)VP28及VP19蛋白進(jìn)行真核表達(dá)，并將表達(dá)的重組蛋白經(jīng)蝦飼料包裹后投喂克氏原鰲蝦。連續(xù)投喂25天后，分別在結(jié)束投喂后的第3天及第21天進(jìn)行病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，VP28及VP19蛋白投喂組存在較高的相對(duì)存活率。Fu利用枯草芽孢桿菌高效地分泌表達(dá)重組的VP28蛋白，并將表達(dá)的重組蛋白經(jīng)蝦飼料包裹后投喂中國(guó)對(duì)蝦，連續(xù)投喂20天后，分別于第3天、14天、28天進(jìn)行病毒攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，蛋白投喂組的相對(duì)存活率達(dá)到了 83.3%。近年來(lái)開(kāi)始有學(xué)者致力于研究口服的DNA疫苗。Rajesh (S.Rajesh Kumar, C.Venkatesan, M.Sarathi, V.Sarathbabu, John Thomas, Κ.Anver Basha, A.S.Sahul Hameed.0ral delivery of DNA construct using chitosannanoparticles to protect the shrimp from white spot syndrome virus (WSSV)[J].Fish&Shellfish Immunology.2009, 26:6429 - 437.)以殼聚糖納米顆粒作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將帶有vp28基因的DNA疫苗包裹在其中，并通過(guò)口服的方式免疫對(duì)蝦。在免疫后第7、
15、30天分別進(jìn)行病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，并得到了較好的保護(hù)效果，相對(duì)存活率分別為85%、65%、50%。Ning (Jian-Fang Ning, Wei Zhu,Jin-Ping Xu,Cong-Yi Zheng, Xiao-Lin Meng.0ral delivery of DNA vaccine encoding VP28against white spot syndrome virus incrayfish by attenuated Salmonella typhimurium.Vaccine[J].2009, 27:1127 - 1135)以減毒的沙門(mén)氏菌作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將帶有vp28基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)化入減毒的沙門(mén)氏菌中，并將重組菌以口服的方式免疫克氏原鰲蝦。在免疫后第7、15、25天分別進(jìn)行病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到的相對(duì)存活率分別為88.3%,66.7%和56.7%。
[0023]綜上所述，關(guān)于利用苦瓜素抗醫(yī)學(xué)病毒的研究已有許多報(bào)道，但利用TAT攜帶MAP30跨膜進(jìn)入體內(nèi)抗病毒還未見(jiàn)報(bào)道，若MAP30不能進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，也就很難達(dá)到控制和治療動(dòng)物病毒病的目的。而通過(guò)注射的方法，尤其是像水產(chǎn)動(dòng)物，要想達(dá)到群體預(yù)防和治療的目的，注射的方法顯然是不可能實(shí)現(xiàn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]本發(fā)明的目的是提供了一種TAT-MAP30融合蛋白，其序列為SEQ ID N0.2所示。將TAT與MAP30融合表達(dá)，獲得的TAT-MAP30融合蛋白快速穿過(guò)中腸細(xì)胞膜，減少機(jī)體生物屏障、物理屏障和化學(xué)屏障對(duì)蛋白的損失.可作為口服藥物用于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物抗細(xì)菌、抗病毒的預(yù)防和治療。
[0025]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種TAT-MAP30融合蛋白的制備方法，大腸埃希氏菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-TAT-MAP30, F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3)工程菌大量表達(dá)該融合蛋白，并使用鎳柱純化，方法簡(jiǎn)單，易行，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。[0026]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株，大腸埃希氏菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-TAT-MAP30,F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3)(以下簡(jiǎn)稱為大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3) - pET28a-TAT-MAP30)；CCTCC N0:M2013546。該菌株可以表達(dá)TAT-MAP30融合蛋白。表達(dá)量大且可溶，易于工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，安全性好。
[0027]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供了一種TAT-MAP30融合蛋白在制備抑制金黃色葡萄糖球菌生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，TAT-MAP30重組蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，可有效避免金黃色葡萄糖球菌在臨床上的耐藥性。
[0028]本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供了一種TAT-MAP30融合蛋白在制備抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒藥物中的應(yīng)用。
[0029]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0030]一種TAT-MAP30融合蛋白的制備方法:其步驟是:
[0031 ] 1.MAP30基因和TAT序列的制備:
[0032]人工合成MAP30基因和TAT序列，MAP30的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示，TAT核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示。
[0033]2.TAT-MAP30融合基因的制備:
[0034]利用融合PCR 技術(shù)，在MAP30基因序列的3 ‘端加入TAT序列，實(shí)現(xiàn)了兩段基因序列的融合。
[0035]3.TAT-MAP30融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0036]用EcoR I和XhoI對(duì)TAT-MAP30序列和質(zhì)粒pET28a(+)進(jìn)行雙酶切，并用T4連接酶連接，得到重組質(zhì)粒TAT-MAP30-pET28a(+)
[0037]4.大腸桿菌基因工程菌的制備:
[0038]重組質(zhì)粒TAT-MAP30-pET28a (+)經(jīng) CaCl2 化學(xué)方法轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)，經(jīng) PCR 鑒定，獲得了基因工程表達(dá)菌 Escherichia coli BL21(DE3) - pET28a-TAT_MAP30。
[0039] 申請(qǐng)人:于2013年11月4日將該菌送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，分類命名:大腸埃希氏菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30, F^ompT hsdSBgal dcm(DE3)，CCTCC N0:M2013546。
[0040]通過(guò)上述方法獲得了一種大腸桿菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30。它具有如下特征:最適生長(zhǎng)溫度為37°C，菌落邊緣整齊，表面有光澤、呈灰色。Escherichia coli BL21(DE3)以T7RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)受控于λ噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，該區(qū)域整合于BL21的染色體上。
[0041]5.基因工程融合蛋白的制備:
[0042]5.1 發(fā)酵
[0043]①接種50ul Escherichia coli BL21 (DE3) - pET28a-TAT_MAP30 甘油菌種于20mlLB液體培養(yǎng)基中(Kan抗性)，37°C 200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
[0044]②第二天，按照4%的比例，即4ml發(fā)酵液于100ml培養(yǎng)基中(加IOOul濃度為Imol/ml的Kan)，于37°C 200rpm的條件下培養(yǎng)大約2小時(shí)左右。
[0045]③當(dāng)菌液0D600約為0.6時(shí)，取出三角瓶冰浴10分鐘，再加入20ul濃度為Imol/ml的IPTG，于18°C 200rpm的條件下誘導(dǎo)發(fā)酵20~24小時(shí)。
[0046]2.2提取可溶性重組融合蛋白
[0047]①將200mL Escherichia coli BL21 (DE3) - pET28a-TAT_MAP30 發(fā)酵液于室溫8000rpm離心40分鐘，收集濕菌體。
[0048]②用80mL Lysis Buffer重懸菌體,并將菌液轉(zhuǎn)移至破碎杯中
[0049]③在低溫高速離心機(jī)中，以4°C 1000Ormp的條件，將破碎液離心20分鐘。
[0050]④收集上清，棄掉沉淀。
[0051]經(jīng)鎳柱純化，透析，濃縮后即得一種TAT-MAP30融合蛋白，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0052]一種TAT-MAP30融合蛋白在制備抑制金黃色葡萄糖球菌生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是:
[0053]濾紙片法抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定基因工程融合蛋白抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的情況以及MTT法測(cè)定TAT-MAP30對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值。
[0054]一種TAT-MAP30融合蛋白在制備抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是:
[0055]水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)健康鰲蝦(體重30g左右)，實(shí)驗(yàn)設(shè)有陽(yáng)性對(duì)照，病毒自孵育陰性對(duì)照組和TAT-MAP30共孵育組3組處理，每組處理各設(shè)三個(gè)重復(fù)。各處理養(yǎng)殖盒貼上相應(yīng)標(biāo)簽，具體實(shí)施方法如下:
[0056]第一組(陽(yáng)性對(duì)照):每日分兩餐喂食飼料，每盒每天共喂食4g飼料。兩周后直接注射WSSV病毒
[0057]第二組(病毒自孵育陰性對(duì)照組):每日分兩餐喂食飼料，每盒每天共喂食4g飼料。兩周后每只螯蝦注射于28°C水浴鍋中孵育I小時(shí)的病毒懸液。
[0058]第三組(病毒與TAT-MAP30重組蛋白共孵育組):每日分兩餐喂食飼料，每盒每天共喂食4g飼料。兩周后每只螯蝦注射病毒與TAT-MAP30重組蛋白共孵育于28°C水浴鍋中I小時(shí)的病毒懸液。
[0059]檢測(cè)鰲蝦發(fā)病情況。
[0060]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0061]1.利用大腸桿菌表達(dá)TAT跨膜域和苦瓜蛋白MAP30的融合蛋白，意在治療類似金黃色葡萄球菌等抗性菌感染以及病毒感染、肥胖癥、糖尿病等等。該工程蛋白不僅可用于無(wú)脊椎動(dòng)物而且還可用于脊椎動(dòng)物。
[0062]2.利用TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，引導(dǎo)苦瓜蛋白MAP30快速跨過(guò)腸細(xì)胞膜，減少機(jī)體生物屏障、物理屏障和化學(xué)屏障對(duì)蛋白的損失，快速進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過(guò)經(jīng)口給藥的方式代替注射給藥，使此工程蛋白不僅可用于無(wú)脊椎動(dòng)物(如水產(chǎn)動(dòng)物)而且還可用于脊椎動(dòng)物(如家禽、豬馬牛羊及人藥)。
[0063]3.本發(fā)明制得的融合重組蛋白在克氏螯蝦上的急性毒性實(shí)驗(yàn)和慢性毒性實(shí)驗(yàn)，證明此蛋白對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物是安全的。
[0064]4.TAT穿膜肽目前還沒(méi)有直接應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但其獨(dú)特的穿膜效率十分具有吸引力。解決了使藥物不經(jīng)肌肉注射而直接進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中，使其具有實(shí)際操作的可行性。本發(fā)明公開(kāi)了 TAT攜帶MAP30跨腸膜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，為其應(yīng)用打下了理論基礎(chǔ)，而且基因工程菌株的構(gòu)建方法可以應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡(jiǎn)單，成本低。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0065]圖1為一種重組質(zhì)粒TAT-MAP30-pET_28a(+)構(gòu)建過(guò)程示意圖。
[0066]圖2為一種TAT-MAP30PCR結(jié)果示意圖。
[0067]圖3為一種重組質(zhì)粒TAT-MAP30_pET28a(+)雙酶切鑒定圖。
[0068]圖4為一種重組蛋白TAT-MAP30誘導(dǎo)表達(dá)示意圖。
[0069]泳道1:蛋白 Marker
[0070]泳道2: IPTG 誘導(dǎo)前的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液上清[0071 ]泳道 3: IPTG 誘導(dǎo)前的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0072]泳道4 =IPTG 誘導(dǎo)后的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液上清
[0073]泳道5 =IPTG 誘導(dǎo)后的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0074]泳道6 =IPTG誘導(dǎo)后的pET28a_BL21 (DE3)破碎液上清
[0075]泳道7 =IPTG誘導(dǎo)后的pET28a_BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0076]泳道8:蛋白 Marker
[0077]泳道9:乳糖自動(dòng)誘導(dǎo)TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液上清
[0078]泳道10:乳糖自動(dòng)誘導(dǎo)TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0079]圖5為一種TAT-MAP30重組蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。
[0080]圖6為一種MTT法測(cè)重組蛋白TAT-MAP30對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度。
[0081]圖7為一種ELISA檢測(cè)螯蝦血淋巴中TAT-MAP30重組蛋白示意圖。
[0082]圖8為一種重組融合蛋白TAT-MAP30抗WSSV的作用示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0083]本實(shí)驗(yàn)所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請(qǐng)參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。
[0084]實(shí)施例1:
[0085]工程菌大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3) pET-28a-TAT_MAP30 的制備
[0086]1.MAP30基因和TAT序列的獲得
[0087]人工合成MAP30基因的序列，其序列為SEQ ID N0.3所示。
[0088]TAT 序列根據(jù)根據(jù) Dietz GP et al.Application of ablood-brain-barrier-penetrating form of GDNF in a mouse model for Parkinson'sdisease.Brain Res.2006Aprl2; 1082 (I):61-6.文獻(xiàn)報(bào)道，委托生物公司合成TAT基因的全序列，并保存到T載體上，TAT序列為SEQ ID N0.4所示。
[0089]2.TAT-MAP30融合基因的獲得
[0090]利用融合PCR技術(shù)，在MAP30基因序列的3 ‘端加入TAT序列，實(shí)現(xiàn)了兩段基因序列的融合。為了通過(guò)重疊PCR技術(shù)，在MAP305 ‘端加入TAT，現(xiàn)設(shè)計(jì)引物如下:
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種合成的基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQID N0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的基因工程菌:大腸桿菌coliBL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30 ,Y— ompT hsdSB(rBmB) gal dcm (DE3) ； CCTCC NO: M2013546。
4.權(quán)利要求2所述蛋白的制備方法，其步驟為: 1)誘導(dǎo) ①接種50ul重組基因工程菌于20mlKan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)過(guò)夜； ②第二天，按照4%的比例，即4ml發(fā)酵液于100ml培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中加有IOOul濃度為lmol/ml的Kan,于37°C 200rpm的條件下培養(yǎng)2小時(shí)； ③當(dāng)菌液0D600約為0.6時(shí)，取出三角瓶冰浴10分鐘，再加入20ul濃度為lmol/ml的IPTG，于18°C 200rpm的條件下誘導(dǎo)發(fā)酵20~24小時(shí)； 2)提取可溶性重組融合蛋白 ①將200mL重組基因工程菌發(fā)酵液于室溫SOOOrpm離心40分鐘，收集濕菌體； ②用80mLLysis Buffer重懸菌體,并將菌液轉(zhuǎn)移至破碎杯中； ③在低溫高速離心機(jī)中，以4°C1000Ormp的條件，將破碎液離心20分鐘； ④收集上清，棄掉沉淀； 經(jīng)鎳柱純化，透析，濃縮后即得一種TAT-MAP30融合蛋白，其序列為SEQ ID N0.2所示； 所述的重組基因工程菌為:大腸埃希氏菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30, F- ompT hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3) ；CCTCC NO: M2013546。
5.權(quán)利要求1所述的基因或權(quán)利要求2所述蛋白在制備抑制金黃色葡萄糖球菌生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的基因或權(quán)利要求2所述蛋白在制備抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103789333SQ201410077176
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】孟小林, 徐進(jìn)平, 孟明翔, 王健, 潘娟 申請(qǐng)人:湖北肽洋紅生物工程有限公司