一種二氫楊梅素在制備肝再生藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，更具體地，涉及二氫楊梅素在制備治療促進肝再生藥物上的應用。二氫楊梅素作為一種黃酮類化合物，顯示出了較強的抗氧化和促進細胞生長的特性。試驗證明，二氫楊梅素可以有效地緩解急性肝衰竭的肝臟組織壞死，并能促進肝細胞增殖，顯著提高急性肝衰竭模型小鼠的存活率。同時二氫楊梅素能顯著提高組織與血清中超氧化物歧化酶的活性，提高血清白蛋白含量，降低谷草轉(zhuǎn)氨酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶及腫瘤壞死因子alpha的水平。
【專利說明】一種二氫楊梅素在制備肝再生藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及肝再生技術，更具體地，涉及一種二氫楊梅素在制備肝再生藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。引起肝衰竭的主要誘因包括肝炎病毒(主要是乙型肝炎病毒)，藥物及肝毒性物質(zhì)等引起的肝損傷，以及物理性傷害(外傷，肝切除手術等)。
[0003]肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)肝癌患者約60萬，患者死亡率高居世界第三位。在我國70%~80%原發(fā)性肝癌患者都是在病毒性肝癌所致的肝硬化的基礎上產(chǎn)生的。目前治療肝癌最有效的方法仍是手術切除。雖然肝臟具有極強的再生能力，但是當腫瘤較大或者患者肝功能較差時，手術極易誘發(fā)急性肝衰竭。因此，在肝癌患者術后輔以促進肝再生的藥物，可有效降低手術風險，縮短患者術后恢復時間，減輕患者痛苦。
[0004]二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DHM),又名蛇葡萄素(Ampelopsin)。提取自葡萄科蛇葡萄屬植物藤茶的葉中，屬黃酮類化合物，其分子式為C15H1208。有研究證明，DHM可加速乙醇代謝產(chǎn)物乙醛的快速分解，從而降低酒精對肝臟的損害，另外，DHM已被證明的護肝作用還包括改善肝細胞損傷引起的血清乳酸脫氫酶活力增加，抑制肝性M細胞膠原纖維形成等。但目前為止未見有將二氫楊梅素作為抗緩解急性肝衰竭，促進肝再生藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了二氫楊梅素的新作用，提供一種二氫楊梅素在制備肝再生藥物中的應用。
`[0006]所述的肝再生藥物為提高組織與血清中超氧化物歧化酶的活性的藥物。
[0007]所述的肝再生藥物為提高血清白蛋白含量的藥物。
[0008]所述的肝再生藥物為降低谷草轉(zhuǎn)氨酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶及腫瘤壞死因子的藥物。
[0009]所述的肝再生藥物為提高肝細胞分裂能力的藥物。
[0010]所述的肝再生藥物為促進肝損傷后肝再生的藥物。
[0011]所述的肝損傷包括肝物理損傷或肝化學損傷。
[0012]所述的肝物理損傷為肝切除、肝破裂或肝穿刺。
[0013]所述的肝化學損傷為肝毒性損傷、肝硬化、肝衰竭或肝炎。
[0014]所述的二氫楊梅素的用量為5(T500mg每公斤體重。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于，
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了二氫楊梅素的新應用，在抗肝癌的基礎上，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可以促進肝細胞再生長，從而大大的擴大了二氫楊梅素的應用范圍。
[0016]2.二氫楊梅素對肝細胞再生有很強的促進作用，特別是應對肝衰竭患者，在48小時的小鼠生存率超過70%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為DHM給藥后CCl4肝損傷模型小鼠血清指標濃度變化情況示意圖，其中A為小鼠血清ALT濃度變化情況，B為小鼠血清AST濃度變化情況，C為小鼠血清Albumin濃度變化情況。
[0018]圖2為肝組織切片中細胞壞死情況示意圖，其中，A為CCl4 + DHM組處理3 d時肝組織切片中壞死細胞情況為CCl4組處理3 d時肝組織切片中壞死細胞比例情況。
[0019]圖3為肝組織切片中PCAN+細胞數(shù)量示意圖，其中，A為SABC染色顯示CCl4 + DHM組處理3d后肝組織切片中PCAN+細胞數(shù)量；B為SABC染色顯示CCl4組處理3d后肝組織切片中PCAN+細胞數(shù)量；C為兩組切片中PCAN+細胞數(shù)量的統(tǒng)計值。
[0020]圖4為CCl4 土 DHM組第f 7 d血清指標濃度變化趨勢示意圖；其中A為血清IL-1 β濃度變化趨勢，B為血清IL-6濃度變化趨勢，C為血清TNF- α濃度變化趨勢。
[0021]圖5為CCl4 土 DHM組肝細胞凋亡檢測結(jié)果。其中A為Caspase 3活性測定結(jié)果；B為Caspase 6活性測定結(jié)果；C為Caspase 8活性測定結(jié)果；D為Caspase 9活性測定結(jié)果；E為CCl4 + DHM組TUNEL染色照片，F(xiàn)為CCl4組TUNEL染色照片，圖中深染的細胞核顯示凋亡細胞，未著色的部分為未發(fā)生凋亡的細胞；G為兩組細胞TUNEL染色陽性細胞數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果。
[0022]圖6為DHM對肝損傷小鼠JNK通路蛋白表達影響示意圖，其中A為JNK通路機制圖；B為CCl4 土 DHM組JNK下游凋亡通路蛋白表達Western Blotting結(jié)果；C為CCl4組；CCl4 + DHM 組；CCl4+ SP600125 組和 CCl4 + SP600125+ DHM 組 JNK, P-JNK, TNF-α 蛋白表達 Western Blotting 結(jié)果。
[0023]圖7為DHM治療對急性肝衰`竭小鼠生存率的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規(guī)市購的試劑、設備和常規(guī)使用的方法。
[0025]四氯化碳(CCl4)是一種常用的誘發(fā)化學性肝損傷模型的劇毒類化學藥物，因其接觸后發(fā)病率高，在動物實驗中重現(xiàn)性好，并能準確反映肝細胞的形態(tài)學變化。因此，CCi4S導的肝損傷與急性肝衰竭模型被廣泛應用于臨床與科學研究。
[0026]實施例1 DHM對小鼠肝再生相關血清學指標的影響 一、急性肝損傷小鼠模型的建立與給藥
本試驗使用的實驗動物為8周齡C57BL/6雄性小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，以lmL/Kg體重腹腔注射CCl4 (Sigma)溶液(CCl4與玉米油1:3混溶)建立急性肝損傷小鼠模型。
[0027]Dihydromyricetin (DHM, Sigma)溶解于 0.5 % 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na, Sigma)水溶液中，終濃度為200mg/mL，在注射0:14后I h，按照150mg/Kg體重的劑量灌胃給藥，對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。每日灌胃DHM溶液2次(每間隔12 h給藥一次)，連續(xù)處理7日。[0028]二、血清學檢驗
在CCl4處理后0.5 d, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d和7 d分別采集小鼠血液并分離血清，分別使用谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase, ALT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Transaminase,AST)和白蛋白(Albumin)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，檢測血清中ALT，AST和Albumin 含量。
[0029]結(jié)果顯示，在CCl4處理后1 d，血清中的ALT和AST濃度快速提升至最高值，然后出現(xiàn)緩慢下降的趨勢，但在CCl4處理后f 5 d, DHM均可有效地抑制血清ALT和AST濃度升高(圖1-A，B);在肝損傷治療過程中，血清中Albumin水平升高被認為是肝臟功能恢復的經(jīng)典指征之一,在本試驗中,DHM給藥組小鼠血清中Albumin水平在CCl4處理后顯著高于對照組(P < 0.05，圖1-C)，提示DHM在肝損傷過程中不僅能起到降低損傷程度的作用，同時在肝臟恢復的過程中也能起到積極作用。
[0030]實施例2 DHM對肝損傷小鼠肝細胞形態(tài)學的影響 一、急性肝損傷小鼠模型的建立與給藥
本試驗使用的實驗動物為8周齡C57BL/6雄性小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，以lmL/Kg體重腹腔注射CCl4 (Sigma)溶液(CCl4與玉米油1:3混溶)建立急性肝損傷小鼠模型。
[0031]DHM (Sigma)溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC_Na，Sigma)水溶液中，終濃度為200 mg/mL,在注射CCl4后I h,按照150 mg/Kg體重的劑量灌胃給藥,對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。每日灌胃DHM溶液2次海間隔12 h給藥一次)，連續(xù)處理7日。
[0032]二、組織學損傷分級
在CCl4處理的2 d處死小鼠，取肝臟組織，福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋，4 μπι切片，蘇木精-伊紅染色觀察急性肝損傷后肝細胞炎癥及壞死情況，計數(shù)炎癥及壞死細胞。
[0033]結(jié)果顯示，CC14+DHM組肝組織切片(圖2-A)中炎癥及壞死細胞的比例顯著低于CCl4組(圖2-B)，CCl4組肝細胞的壞死情況非常明顯，但CCl4 + DHM組肝組織幾乎未見壞死。提示DHM具有一定的抗肝毒素作用。
[0034]實施例3 DHM對肝細胞增殖的影響
增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一種 DNA 聚合酶δ的輔助蛋白，因其只存在于增殖細胞核內(nèi)，是反映細胞增殖狀況的良好指標。本試驗通過對PCNA+細胞染色，檢驗DHM對肝損傷小鼠肝細胞增殖能力的影響。
[0035]一、急性肝損傷小鼠模型的建立與給藥
本試驗使用的實驗動物為8周齡C57BL/6雄性小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，以lmL/Kg體重腹腔注射CCl4 (Sigma)溶液(CCl4與玉米油1:3混溶)建立急性肝損傷小鼠模型。
[0036]DHM (Sigma)溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC_Na，Sigma)水溶液中，終濃度為200 mg/mL,在注射CCl4后I h,按照150 mg/Kg體重的劑量灌胃給藥,對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。每日灌胃DHM溶液2次海間隔12 h給藥一次)，連續(xù)處理7日。
[0037]二、PCNA 檢測在CCl4處理2 d后處死小鼠，取肝臟組織，中性福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋，4μ m切片，使用小鼠抗PCNA單克隆抗體進行免疫組化染色，SABC法顯色(PCNA抗體及SABC染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司)，計數(shù)12 mm2切片面積下PCNA+細胞數(shù)。
[0038]結(jié)果顯示，在CCl4處理后2 d，CCl4 + DHM組(圖3_A)的PCNA+細胞數(shù)顯著高于CCl4組(圖3-B)提示DHM能夠快速地啟動肝細胞增殖(圖3-C)，在肝組織受損時有效促進肝再生。
[0039]實施例4 DHM對血清IL-1 β，TNF- α，和IL-6含量的影響
血清IL-1 β，TNF- α，和IL_6通常被認為是機體炎性反應的生物標志物，因此，檢測上述因子在血清中的表達量可有效地說明肝損傷的恢復程度。
[0040]一、急性肝損傷小鼠模型的建立與給藥
本試驗使用的實驗動物為8周齡C57BL/6雄性小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，以lmL/Kg體重腹腔注射CCl4 (Sigma)溶液(CCl4與玉米油1:3混溶)建立急性肝損傷小鼠模型。
[0041]DHM (Sigma)溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC_Na，Sigma)水溶液中，終濃度為200 mg/mL,在注射CCl4后I h,按照150 mg/Kg體重的劑量灌胃給藥,對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。每日灌胃DHM溶液2次海間隔12 h給藥一次)，連續(xù)處理7曰。
[0042]二、血清 IL-1 β, TNF-a, IL-6 和 IL-lRa 含量檢測
在CC14± DHM處理的0.5 d, Id, 2d，3d，5 d和7 d分別采集小鼠外周血并分離血清，檢測ELISA法對血清中IL-1 β，TNF- α和IL-6的含量，檢測方法按ELISA試劑盒說明書進行。`
[0043]結(jié)果顯示，IL-1 β在CCl4處理后廣2 d逐步提升至一個較高的水平，但隨著時間的推移，IL-1 β的表達量會逐步下降。與CCl4組相比，CCl4 + DHM組的IL-1 β表達量的變化趨勢會更為平穩(wěn)溫和(圖4-A)。TNF- α在CCl4處理2 d后的濃度會迅速達到最高值，隨后其表達量會逐漸降低，但CCl4 + DHM組TNF-α的峰值相較CCl4組有顯著降低，也更早恢復正常水平。(圖4-Β)。與CCl4組相比，CCl4 + DHM組在處理后血清IL-6含量雖然均會在I d達到峰值，但CCl4 + DHM組的峰值顯著低于CCl4組。(圖4-C)。
[0044]以上數(shù)據(jù)充分說明在遭受肝損傷后，通過給以DHM處理的小鼠，其肝臟恢復及再生的速度顯著高于未經(jīng)處理的對照組。說明DHM可有效地減輕肝臟損傷并促進肝再生。
[0045]實施例5 DHM對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟細胞凋亡的影響 一、急性肝損傷小鼠模型的建立與給藥
本試驗使用的實驗動物為8周齡C57BL/6雄性小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，以lmL/Kg體重腹腔注射CCl4 (Sigma)溶液(CCl4與玉米油1:3混溶)建立急性肝損傷小鼠模型。
[0046]DHM (Sigma)溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC_Na，Sigma)水溶液中，終濃度為200 mg/mL,在注射CCl4后I h,按照150 mg/Kg體重的劑量灌胃給藥,對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。每日灌胃DHM溶液2次海間隔12 h給藥一次)，連續(xù)處理7曰。
[0047]二、肝組織內(nèi)Caspase3, 6，8，9活性測定半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)在細胞在細胞內(nèi)充當著凋亡起始者和執(zhí)行者的角色，因此當細胞內(nèi)的Caspases家族活性增高時，即代表著組織與細胞發(fā)生了壞死及凋亡。
[0048]在CCl4處理2 d后處死小鼠，分離肝組織，ELISA法檢測肝組織內(nèi)Caspase3，6，8，9的活性。結(jié)果顯示，CCl4 + DHM組肝細胞中Caspases活性顯著低于CCl4組，說明CCl4 +DHM組肝臟中凋亡細胞細胞少于CCl4組(圖5-A，B, C，D)。
[0049]三、TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況
細胞在發(fā)生凋亡時，會激活某些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上突光素(FITC)標記的 dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理
結(jié)果顯示，在肝組織石蠟切片中，CCl4+ DHM組的凋亡細胞總是顯著低于CCl4組(圖5-E, F，G)。
[0050]以上結(jié)果表明DHM可有效減少受損肝臟的細胞凋亡，從而發(fā)揮護肝作用。
[0051 ] 實施例6 DHM對肝損傷小鼠JNK通路蛋白表達的影響
一、急性肝損傷小鼠模型的建立與給藥
本試驗使用的實驗動物為8周齡C57BL/6雄性小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，以lmL/Kg體重腹腔注射CCl4 (Sigma)溶液(CCl4與玉米油1:3混溶)建立急性肝損傷小鼠模型。
[0052]DHM (Sigma)溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC_Na，Sigma)水溶液中，終濃度為200 mg/mL,在注射CCl4后I h,按照150 mg/Kg體重的劑量灌胃給藥,對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。每日灌胃DHM溶液2次海間隔12 h給藥一次)，連續(xù)處理7曰。
[0053]JNK抑制劑SP600125以50 mg/kg體重的劑量，于DHM處理前I h腹腔注射小鼠。
[0054]本實驗共分4 組，分別為=CCl4 組；CC14 + DHM 組；CC14 + SP600125 組和 CCl4 +SP600125+ DHM 組。
[0055]二、JNK通路相關蛋白表達檢測
在注射0:14后2 d處死小鼠，分離各組小鼠肝臟組織提取蛋白，Western Blotting法對肝組織總蛋白中的JNK, P-JNK, TNF-alpha, Cytochrome C和Bax表達進行相對定量，比較并分析使用DHM治療對小鼠肝臟中上述蛋白表達量變化的影響(本段所提及的蛋白之間相互關系見圖6-A)。
[0056]結(jié)果顯示，DHM治療能夠顯著提高小鼠肝臟中JNK蛋白的表達量，并能提高該蛋白活化狀態(tài)P-JNK的含量，同時DHM治療還能降低肝細胞中腫瘤壞死因子TNF-alpha，及JNK下游促凋亡蛋白Bax和Cytochrome C的表達量(圖6_B，C)，但注射過SP600125的小鼠，無論是否使用DHM治療，其細胞內(nèi)JNK及P-JNK水平不再升高，且TNF-alpha水平表達量也不會降低(圖6-C)。
[0057]本實施例可有利證明DHM對受損肝臟的保護作用和促進肝細胞增殖作用是通過調(diào)控JNK相關通路來完成的。
[0058]實施例7 DHM對急性肝衰竭小鼠生存率的影響本試驗使用的實驗動物為8周齡野生型C57BL/6雄性小鼠，以2.6mL/Kg體重腹腔注射CCl4溶液(CCl4與玉米油1:1混溶)，使試驗小鼠處理24 h后致死率達到50 %，制備急性肝衰竭小鼠模型。
[0059]DHM溶解于0.5 %羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液中，終濃度為200 mg/mL，在注射0:14后1 h，按照150 mg/Kg體重的劑量灌胃給藥，后每12 h以相同劑量給藥一次，連續(xù)5 d。對照組小鼠于相同時間灌胃相同體積的CMC-Na。
[0060]JNK抑制劑SP600125以50 mg/kg體重的劑量，于DHM處理前I h腹腔注射小鼠。
[0061]本實驗共分4 組，分別為=CCl4 組；CC14 + DHM 組；CC14 + SP600125 組和 CCl4 +SP600125+ DHM 組。 [0062]從注射CCl4開始計時，每12 h統(tǒng)計一次各組存活小鼠數(shù)量，比較CCl4 + DHM組和CCl4組小鼠存活率的差異。
[0063]結(jié)果顯示，在經(jīng)過半數(shù)致死劑量CCl4處理后，DHM能有效提高急性肝衰竭小鼠的存活率，與對照組結(jié)果差異顯著(P < 0.001)，但經(jīng)過5?600125處理的小鼠由于細胞內(nèi)1^(通路受到抑制，其死亡率不再因DHM處理而降低(圖7)。本實施例有力地證明了 DHM對急性肝衰竭小鼠肝臟的保護作用，同時闡明了 DHM對肝臟的保護作用是通過JNK通路發(fā)揮作用的。
【權利要求】
1.一種二氫楊梅素在制備肝再生藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的肝再生藥物為提高組織與血清中超氧化物歧化酶的活性的藥物。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的肝再生藥物為提高血清白蛋白含量的藥物，或降低谷草轉(zhuǎn)氨酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶及腫瘤壞死因子的藥物，或提高肝細胞分裂能力的藥物。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的肝再生藥物為治療肝硬化、肝炎或肝衰竭的藥物。
5.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的肝再生藥物為促進肝損傷后肝再生的藥物。
6.根據(jù)權利要 求5所述的應用，其特征在于，所述的肝損傷包括肝物理損傷或肝化學損傷。
7.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的肝物理損傷為肝切除、肝破裂或肝穿刺。
8.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的肝化學損傷為肝毒性損傷。
9.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的二氫楊梅素的用量為5(T500mg每公斤體重。
【文檔編號】A61P1/16GK103751173SQ201410004624
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權日:2014年1月6日
【發(fā)明者】朱潤芝, 李明意, 劉潔, 劉斌, 張慶余, 夏娟 申請人:廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院