一種細(xì)胞孵化器的制造方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種細(xì)胞孵化器，它包括外管、設(shè)于外管內(nèi)且與外管等長的若干根中空濾管；中空濾管兩端外緣通過密封膜與外管兩端內(nèi)緣密封固定；外管上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口和細(xì)胞培養(yǎng)基出口；所述細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口和細(xì)胞培養(yǎng)基出口均與中空濾管、密封膜及外管圍成的腔室連通；所述外管上端設(shè)有密封上蓋，密封上蓋頂端設(shè)有動脈端口；所述外管下端設(shè)有密封下蓋，密封下蓋下端設(shè)有靜脈端口；所述中空濾管內(nèi)壁上設(shè)有細(xì)胞抗體層。由于孵化器本身不帶有細(xì)胞，而是在植入體內(nèi)后才捕獲并培養(yǎng)自體細(xì)胞，因此，血液相容性顯著提高，不會引發(fā)免疫反應(yīng)，不會激活凝血，滿足長時間連續(xù)性在體細(xì)胞培養(yǎng)需要。生理環(huán)境中獲得的細(xì)胞層面，具備成熟、穩(wěn)定、可自行更新等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種細(xì)胞孵化器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬再生醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種細(xì)胞孵化器。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報道，全世界每年約有上千萬人遭受各種形式的創(chuàng)傷，有數(shù)百萬人因在疾病康復(fù)過程中重要器官發(fā)生纖維化而導(dǎo)致功能喪失，有數(shù)十萬人迫切希望進(jìn)行各種器官移植。但令人遺憾的是，一方面，目前的組織器官修復(fù)無論是體表還是內(nèi)臟，仍然停留在瘢痕愈合的解剖修復(fù)層面上，離人們所希望的“再生出一個完整的受損器官”差距甚遠(yuǎn)；另一方面，器官移植作為一種替代治療方法盡管有其巨大的治療作用，但它仍然是一種“拆東墻補(bǔ)西墻”的有損傷和有代價的治療方法。由于移植器官來源受限及倫理學(xué)等方面的限制，人們更加迫切需要復(fù)制所需要的組織或器官來進(jìn)行替代性治療。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及遺傳學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的迅猛發(fā)展，以及干細(xì)胞和組織工程技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床的應(yīng)用，使得現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)在臨床應(yīng)用方面顯示出良好的發(fā)展前景。如在再生腎領(lǐng)域，有學(xué)者提出通過3D打印技術(shù)，“打印”一個具備腎臟輪廓及微細(xì)結(jié)構(gòu)的器官，并以此為支撐材料，進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，在支撐材料上培育出腎臟細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)腎臟的再造。也有在支架材料表面種植肝細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)獲得生物人工肝，替代受損肝臟，發(fā)揮生物合成及解毒作用。但是，該些技術(shù)建立在體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)之上，體外培養(yǎng)細(xì)胞無法獲取機(jī)體相同的生長環(huán)境，因而，培育出來的細(xì)胞在植入機(jī)體后，不能適應(yīng)機(jī)體的生理環(huán)境。因而，目前在復(fù)制組織器官方面，仍然缺少一個理想的細(xì)胞培育方法。市面上有中空濾管外套、外管的裝置，但其主要用于水處理或血液過濾，目前有學(xué)者嘗試采用該裝置研制人工腎臟，即在體外培養(yǎng)腎臟細(xì)胞，然后將腎臟細(xì)胞注入中空管中。然而，該研制方法仍然建立在體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之上。體外細(xì)胞培養(yǎng)需時長，存在較高的污染風(fēng)險。而且，即使細(xì)胞培育成功，在移植體內(nèi)后，也不能承受血流沖刷而脫落。實(shí)驗(yàn)證明:體外培養(yǎng)獲得的人工腎臟接體循環(huán)I個小時即開始有細(xì)胞脫落，24小時幾乎脫落完全，離實(shí)現(xiàn)移植物的長期存活目標(biāo)相去甚遠(yuǎn)。另外，體外培養(yǎng)的細(xì)胞在植入體內(nèi)后可能會產(chǎn)生排異反應(yīng)，效果并不理想。與此同時，現(xiàn)有的人造肝臟、心臟等研究也存在同樣的技術(shù)問題。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0003]本實(shí)用新型旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在體細(xì)胞孵化器。
[0004]為了達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型提供的技術(shù)方案為:
[0005]所述細(xì)胞孵化器，它包括外管、設(shè)于外管內(nèi)且與外管等長的若干根中空濾管；中空濾管兩端外緣通過密封膜與外管兩端內(nèi)緣密封固定；外管上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口和細(xì)胞培養(yǎng)基出口；所述細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口和細(xì)胞培養(yǎng)基出口均與中空濾管、密封膜及外管圍成的腔室連通；所述外管上端設(shè)有密封上蓋，密封上蓋頂端設(shè)有動脈端口 ；所述外管下端設(shè)有密封下蓋，密封下蓋下端設(shè)有靜脈端口 ；所述中空濾管內(nèi)壁上設(shè)有細(xì)胞抗體層。
[0006]其中，所述細(xì)胞抗體層通過層粘連蛋白與中空濾管內(nèi)壁結(jié)合；所述腔室內(nèi)填充含有細(xì)胞生長因子及抗凝劑的半固態(tài)或液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值為7.2~
7.4 ;所述細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM、DMEM、RPM1-1640、199細(xì)胞培養(yǎng)基系列或天然培養(yǎng)基等；所述細(xì)胞生長因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、上皮細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等；所述抗凝劑為:肝素、阿加曲班、水蛭素等。所述細(xì)胞抗體層為干細(xì)胞抗體層。所述干細(xì)胞抗體為MSC抗體。
[0007]下面以腎小球細(xì)胞孵化器為例，結(jié)合原理、制備方法及使用方法對本實(shí)用新型作進(jìn)一步說明:
[0008]本實(shí)用新型的細(xì)胞孵化器(以下簡稱“孵化器”)外形可采用現(xiàn)有的血濾器，或用聚羥基丁酸酯、聚碳酸酯、聚氨酯等可降解材料制作。首先通過浸潰法在中空濾管內(nèi)壁涂覆細(xì)胞外基質(zhì)成分(層黏連蛋白、膠原蛋白溶液等):將細(xì)胞外基質(zhì)成分溶液注入中空濾管，將孵化器置于37°C孵箱中孵育一段時間，之后抽去溶液，再將孵化器置于37°C恒溫干燥箱中干燥。用電鏡掃描中空濾管，可見中空濾管內(nèi)表面附著有細(xì)胞外基質(zhì)成分。然后通過浸潰法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)抗體固定于中空濾管內(nèi)壁:將MSC抗體溶液注入中空濾管后,將孵化器置于37°C孵箱中孵育一段時間，然后將溶液抽出，再將孵化器置于37°C恒溫干燥箱中干燥，備用。從細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口或細(xì)胞培養(yǎng)基出口向腔室注入包含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及抗凝劑的細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基PH在7.2~?.4，PH<7.2時更換培養(yǎng)基)，密封、消毒后于2-8 0C保存，該孵化器保存期為I月。或者將中空濾管被固定MSC抗體后的孵化器植入體內(nèi)后，再從細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口向腔室注入包含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及抗凝劑的細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基PH在7.2~7.4，PH<7.2時更換培養(yǎng)基)。
[0009]使用孵化器時需要將孵化器植入體內(nèi)，將孵化器動脈端口與股動脈(頸動脈)連接，將靜脈端口與股靜脈(頸靜脈)連接，形成動脈一孵化器一靜脈的血液循環(huán)通路。血流中干細(xì)胞和中空濾管內(nèi)的干細(xì)胞抗體結(jié)合，在腔室細(xì)胞培養(yǎng)基作用下，增殖分化形成血管內(nèi)皮細(xì)胞層，從而獲得完美血液相容性界面，維持血液循環(huán)順利進(jìn)行，同時保留中空濾管的濾過性能。成束的中空濾管類似腎小球的小動脈叢,并且同樣具備小動脈的內(nèi)皮細(xì)胞層,故而符合腎小球的基本生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了腎小球的再生；另外，通過改變細(xì)胞培養(yǎng)基的配方，還可實(shí)現(xiàn)肝臟、心臟等多種組織細(xì)胞的再生。使用時，定期更換包含細(xì)胞生長因子及抗凝劑的細(xì)胞培養(yǎng)基即可。
[0010]本實(shí)用新型另辟蹊徑，在體外構(gòu)建腎小球細(xì)胞“孵化器”，該孵化器具備腎小球的大體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，由類似腎小球動脈的多根中空濾管組成，中空濾管內(nèi)表面固定有MSC抗體，能捕獲血流中的MSC。所捕獲的MSC在中空濾管內(nèi)壁能增殖分化成內(nèi)皮細(xì)胞表層。中空濾管浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)基可定期更換，誘導(dǎo)所捕獲的MSC細(xì)胞定向有序分化。植入機(jī)體后，將血流引入中空濾管內(nèi)表面，通過表面MSC抗體特異性結(jié)合血流中的MSC，從而將MSC固定在中空濾管內(nèi)表面，中空濾管內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞層形成后，能避免管材料和血流直接接觸，防止免疫反應(yīng)和促發(fā)凝血，實(shí)現(xiàn)連續(xù)性的血液循環(huán)和溶質(zhì)濾過。采用在體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可將固定的干細(xì)胞培育為血管內(nèi)皮細(xì)胞。獲得的血管內(nèi)皮細(xì)胞層可將中空濾管和血流隔開，從而避免免疫反應(yīng)，并保留中空濾管的濾過功能，實(shí)現(xiàn)腎小球的再生。MSC是機(jī)體多種組織細(xì)胞的祖始細(xì)胞，通過 改變“孵化器”中空濾管內(nèi)培養(yǎng)基配方，還可將MSC培養(yǎng)培養(yǎng)成肝臟、心臟、胰腺等多種組織細(xì)胞。本實(shí)用新型中應(yīng)用到的細(xì)胞捕獲技術(shù)，是近些年在細(xì)胞工程領(lǐng)域興起的一項(xiàng)技術(shù)，其原理是:將細(xì)胞抗體固定在材料表面，利用該抗體能特異性結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞的能力,捕獲血流中的目標(biāo)細(xì)胞。該技術(shù)在構(gòu)建自體內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲血管支架研究中，已經(jīng)取得了成功并日趨成熟。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型的有益效果包括:
[0012]由于細(xì)胞孵化器本身不帶有細(xì)胞，而是在植入體內(nèi)后才培育細(xì)胞，因此，血液相容性顯著提高，不會引發(fā)免疫反應(yīng)，不會激活凝血。生理環(huán)境中獲得的自體細(xì)胞層面，具備成熟、穩(wěn)定、可自行更新等優(yōu)點(diǎn)。另外，本實(shí)用新型的細(xì)胞孵化器可批量生產(chǎn)，有較高的經(jīng)濟(jì)效益，同時作為再造人體器官研究的一部分，為再造人體器官的研發(fā)提供新思路，具備較高的社會價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本實(shí)用新型細(xì)胞孵化器結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]圖2為圖1A處的放大圖。
[0015]圖中:1、外管；2、中空濾管；3、密封膜；4、細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 ；5、細(xì)胞培養(yǎng)基出口 ；
6、腔室；7、密封上蓋；8、動脈端口 ；9、密封下蓋；10、靜脈端口 ；11、細(xì)胞抗體層。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1腎小球細(xì)胞孵化器
[0017]參見圖1，所述細(xì)胞孵化器包括外管1、設(shè)于外管I內(nèi)且與外管I等長的若干根中空濾管2 ;中空濾管2兩端外緣通過密封膜3與外管I兩端內(nèi)緣密封固定；外管I上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 4和細(xì)胞培養(yǎng)基出口 5 ;所述細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 4和細(xì)胞培養(yǎng)基出口 5均與中空濾管2、密封膜3及外管I圍成的腔室6連通；所述外管2上端設(shè)有密封上蓋7，密封上蓋7頂端設(shè)有動脈端口 8 ;所述外管2下端設(shè)有密封下蓋9，密封下蓋9下端設(shè)有靜脈端口 10 ；其特征在于，所述中空濾管2內(nèi)壁上設(shè)有MSC抗體層11。所述MSC抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內(nèi)壁結(jié)合。所述腔室6內(nèi)填充含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及抗凝劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。所述MSC抗體層11通過層粘連蛋白與中空濾管2內(nèi)壁結(jié)合。
[0018]其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值為7.2?7.4。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。所述細(xì)胞生長因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；所述抗凝劑為阿加曲班。
[0019]上述孵化器的制備及效果檢測如下:
[0020](I)孵化器外形制備。備血濾器(AV400，0.7m2，費(fèi)森尤斯)，用作孵化器外形。先用無血清的MEM培養(yǎng)基沖洗，再把無血清MEM配制的層黏連蛋白10ug/ml注入中空濾管中，置于37°C孵箱中孵育I h，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用。修飾后中空濾管經(jīng)掃描電鏡檢測，可見中空濾管內(nèi)表面全部被修飾物覆蓋，并附著均勻；
[0021](2)中空濾管內(nèi)壁MSC抗體固定。將MSC抗體溶液注入中空濾管，37°C孵箱中孵育過夜，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用；
[0022](3)腔室充填細(xì)胞培養(yǎng)基及抗凝成分。孵化器外腔注滿含5%(質(zhì)量百分比含量)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(20ug/L)以及抗凝成分阿加曲班(IOmg/L)。
[0023](4)MSC在體培養(yǎng)。通過動脈端、靜脈端對接將孵化器植入機(jī)體。維持動脈-中
空濾管一靜脈的有效血流循環(huán)。PH〈7.2時更換培養(yǎng)基。注意循環(huán)管路凝血情況，及時調(diào)整抗凝成分用量；
[0024]( 5)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能檢測。6個月后，掃描電鏡檢測見中空濾管內(nèi)壁完全被覆內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)正常，沿長軸密集排列，成單層生長于中空濾管內(nèi)腔內(nèi)。6個月后，收集培養(yǎng)基，進(jìn)行內(nèi)皮素水平測定(32.3±7.9pg/ml)證明內(nèi)皮細(xì)胞存活并保持正常的分泌功能。
[0025](6)進(jìn)行連續(xù)的血液凈化實(shí)驗(yàn)。抽出孵化器腔室培養(yǎng)基及抗凝成分，進(jìn)行連續(xù)的血液凈化。動物實(shí)驗(yàn)中觀察到該再生腎小球在不應(yīng)用任何抗凝劑的情況下，連續(xù)順利進(jìn)行血液凈化最長時間達(dá)I個月，且中空濾管內(nèi)表面內(nèi)皮細(xì)胞可自行更新。理論上，該再生腎小球可望實(shí)現(xiàn)永久的血液凈化。
[0026](7)再生腎小球溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能測定。經(jīng)檢測，尿素氮清除率210.7±55.3(ml/min)、肌酐清除率192.6±34.5(ml/min)，提示其小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能和血濾器無統(tǒng)計學(xué)差別。維生素B12清除率68.l±15.7(ml/min)，提示其較大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力較血濾器有輕度下降，但通過連續(xù)的血液凈化，該溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力完全可以得到補(bǔ)償。
[0027]實(shí)施例2腎小球細(xì)胞孵化器
[0028]參見圖1，所述細(xì)胞孵化器包括外管1、設(shè)于外管I內(nèi)且與外管I等長的若干根中空濾管2 ;中空濾管2兩端外緣通過密封膜3與外管I兩端內(nèi)緣密封固定；外管I上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 4和細(xì)胞培養(yǎng)基出口 5 ;所述細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 4和細(xì)胞培養(yǎng)基出口 5均與中空濾管2、密封膜3及外管I圍成的腔室6連通；所述外管2上端設(shè)有密封上蓋7，密封上蓋7頂端設(shè)有動脈端口 8 ;所述外管2下端設(shè)有密封下蓋9，密封下蓋9下端設(shè)有靜脈端口 10 ；其特征在于，所述中空濾管2內(nèi)壁上設(shè)有MSC抗體層11。所述MSC抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內(nèi)壁結(jié)合。所述MSCs抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內(nèi)壁結(jié)合。
[0029]上述孵化器的制備及效果檢測如下:
[0030](I)孵化器外形制備。以聚羥基丁酸酯為原料，采用靜電紡絲技術(shù)制備中空濾管。將中空濾管成束放入成形的外管內(nèi)，外管與中空濾管之間采用聚氨脂(密封膜)進(jìn)行密封，外管兩端用端蓋密封。外管留有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)出口，端蓋留有動、靜脈端口。外管和端蓋材料為聚碳酸酯，封口膠材料為聚氨酯膠，在外管和端蓋之間設(shè)一密封圈，密封圈材料為硅膠；
[0031](2)中空濾管內(nèi)壁修飾。取膠原蛋白溶液3mg/ml，將PH調(diào)至7.2?7.4，加入交聯(lián)劑EDAC (0.lmg/mg膠原)，配制膠原蛋白交聯(lián)溶液。將該溶液注入中空濾管內(nèi)，置于37°C孵箱中孵育I h，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用。反復(fù)多次獲得膠原蛋白多層膜；
[0032](3)中空濾管內(nèi)壁MSC抗體固定。將MSC抗體溶液注入中空濾管內(nèi)，37°C孵箱中孵育過夜，之后將其抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用；
[0033](4) MSC在體培養(yǎng)。通過動脈端、靜脈端對接將前述方法制備的孵化器植入機(jī)體。維持動脈一中空管一靜脈的有效血流循環(huán)。注意循環(huán)管路凝血情況，及時調(diào)整抗凝成分用量。在腔室中注入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含5% (質(zhì)量百分比含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子濃度為20ug/L、肝素抗凝劑濃度12500IU/L)，定期更換，保持培養(yǎng)基PH值>7.2 ;
[0034](5)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能檢測。6個月后，掃描電鏡檢測見中空濾管內(nèi)表面完全被覆內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)正常，沿長軸密集排列。留取細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)皮素水平測定(52.7±11.6pg/ml)證明內(nèi)皮細(xì)胞存活并保持正常的分泌功能。
[0035](6)進(jìn)行連續(xù)的血液凈化實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)血液凈化中觀察到所獲得的再生腎小球在不應(yīng)用任何抗凝劑的情況下，連續(xù)順利進(jìn)行血液凈化最長時間達(dá)30天。
[0036](7)再生腎小球溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能測定。經(jīng)檢測，尿素氮清除率230±61.7(ml/min)、肌酐清除率203.3±74.5(ml/min)，維生素B12清除率93.2±21.9 (ml/min)，尿素氮、肌酐、維生素B12轉(zhuǎn)運(yùn)能力和血濾器無統(tǒng)計學(xué)差別。
[0037]實(shí)施例3肝細(xì)胞孵化器
[0038]參見圖1，所述細(xì)胞孵化器包括外管1、設(shè)于外管I內(nèi)且與外管I等長的若干根中空濾管2 ;中空濾管2兩端外緣通過密封膜3與外管I兩端內(nèi)緣密封固定；外管I上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 4和細(xì)胞培養(yǎng)基出口 5 ;所述細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口 4和細(xì)胞培養(yǎng)基出口 5均與中空濾管2、密封膜3及外管I圍成的腔室6連通；所述外管2上端設(shè)有密封上蓋7，密封上蓋7頂端設(shè)有動脈端口 8 ;所述外管2下端設(shè)有密封下蓋9，密封下蓋9下端設(shè)有靜脈端口 10 ；其特征在于，所述中空濾管2內(nèi)壁上設(shè)有MSC抗體層11。所述MSC抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內(nèi)壁結(jié)合。
[0039]上述孵化器的制備及效果檢測如下:
[0040](I)孵化器外形制備。以聚羥基丁酸酯為原料，采用靜電紡絲技術(shù)制備中空濾管。將中空濾管成束放入成形的外管內(nèi)，外管與中空濾管之間采用聚氨脂(密封膜)進(jìn)行密封，外管兩端用端蓋密封。外管留有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)出口，端蓋留有動、靜脈端口。外管和端蓋材料為聚碳酸酯，封口膠材料為聚氨酯膠，在外管和端蓋之間設(shè)一密封圈，密封圈材料為硅膠；
[0041](2)中空濾管內(nèi)壁修飾。取膠原蛋白溶液3mg/ml，將PH調(diào)至7.2，加入交聯(lián)劑EDAC(0.lmg/mg膠原)，配制膠原蛋白交聯(lián)溶液。將該溶液注入中空濾管內(nèi)，置于37°C孵箱中孵育I h，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用。反復(fù)多次獲得膠原蛋白多層膜；
[0042](3)中空濾管內(nèi)壁MSC抗體固定。將MSC抗體溶液注入中空濾管內(nèi)，37°C孵箱中孵育過夜，之后將其抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用；
[0043](4) MSC在體培養(yǎng)。通過動脈端、靜脈端對接將前述方法制備的孵化器植入機(jī)體。維持動脈一中空管一靜脈的有效血流循環(huán)。注意循環(huán)管路凝血情況，及時調(diào)整抗凝成分用量。在腔室中注入肝細(xì)胞培養(yǎng)基(為含10% (質(zhì)量百分比含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加肝細(xì)胞生長因子濃度為20ug/L，抗凝劑重組水蛭素濃度為10mg/L)，定期更換，保持培養(yǎng)基PH值7.2?7.4 ；
[0044](5)肝細(xì)胞形態(tài)及功能檢測。6個月后，掃描電鏡檢測見中空濾管內(nèi)表面完全被覆肝細(xì)胞，形態(tài)正常，沿長軸密集排列。留取細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)水平測定為0.83±0.02ug/L，證明肝細(xì)胞生成并存活。經(jīng)檢測，培養(yǎng)基中白蛋白含量表達(dá)較原培養(yǎng)增加2.47±0.03g/L，證明肝細(xì)胞具備合成蛋白功能。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞孵化器，它包括外管(I)、設(shè)于外管(I)內(nèi)且與外管(I)等長的若干根中空濾管(2 );中空濾管(2 )兩端外緣通過密封膜(3 )與外管(I)兩端內(nèi)緣密封固定；外管(I)上設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口(4)和細(xì)胞培養(yǎng)基出口(5);所述細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)口(4)和細(xì)胞培養(yǎng)基出口(5)均與中空濾管(2)、密封膜(3)及外管(I)圍成的腔室(6)連通；所述外管(2)上端設(shè)有密封上蓋(7 )，密封上蓋(7 )頂端設(shè)有動脈端口( 8 );所述外管(2 )下端設(shè)有密封下蓋(9 )，密封下蓋(9)下端設(shè)有靜脈端口(10);其特征在于，所述中空濾管(2)內(nèi)壁上設(shè)有細(xì)胞抗體層(11)。
2.如權(quán)利要求1所述的孵化器，其特征在于，所述細(xì)胞抗體層(11)通過層粘連蛋白或膠原蛋白與中空濾管(2)內(nèi)壁結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的孵化器，其特征在于，所述細(xì)胞抗體層(11)為干細(xì)胞抗體層。
4.如權(quán)利要求3所述的孵化器，其特征在于，所述干細(xì)胞抗體為MSC抗體。
【文檔編號】A61F2/02GK203677312SQ201320835127
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】張義雄 申請人:張義雄