具有靶向性的免疫磁性白蛋白納米球及制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向性的載基因免疫磁性白蛋白納米球及制備方法，先用去溶劑化-交聯(lián)法制備載基因磁性白蛋白納米球：將質(zhì)粒與磁性納米粒孵育30min，得到質(zhì)粒/納米粒復(fù)合物，此復(fù)合物再與牛血清白蛋白的溶液混勻，用無(wú)水乙醇滴至溶液呈膠狀。離心后沉淀即為載基因磁性白蛋白納米球。接著用異型雙功能交聯(lián)劑將單抗西妥昔連接至載基因磁性白蛋白納米球表面，即得到具有靶向性的免疫磁性白蛋白納米球。本發(fā)明制得的納米球經(jīng)免疫方法檢測(cè)具有免疫特性，并在體外檢測(cè)其對(duì)肺癌細(xì)胞GLC-82的靶向性，結(jié)果顯示出了良好的靶向性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有靶向性的免疫磁性白蛋白納米球及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗腫瘤的靶向藥物研究領(lǐng)域，具體涉及一種具有靶向性的免疫磁性白蛋白納米球及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002](I) Survivin-siRNA (生存素基因的干擾RNA)在腫瘤治療中的應(yīng)用
[0003]Survivin是新近克隆的凋亡抑制基因，survivin蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的分子最小、而功能最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白(inhibitor ofapoptosis protein, IAP)。其表達(dá)部位十分特殊，只表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，不見(jiàn)于終末分化的正常成人組織(胸腺和生殖腺除外)；但在體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞及人類(lèi)大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)有survivin的表達(dá)，如肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌等。研究也表明，survivin基因能夠抑制細(xì)胞的凋亡，且可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；因此，封閉或下調(diào)survivin基因的表達(dá)水平，恢復(fù)正常凋亡調(diào)控機(jī)制，成為肺癌基因治療的新思路。
[0004]RNA干擾(RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-strandedRNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。近幾年來(lái)RNAi研究取得了突破性進(jìn)展，被《科學(xué)》雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并列為2002年 十大科學(xué)進(jìn)展之首。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。跟傳統(tǒng)的基因治療技術(shù)相比，RNA干擾在基因功能和相關(guān)方面的研究中具有許多特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。最顯著的特征就是只引起與雙鏈RNA同源的mRNA降解，而對(duì)其他無(wú)關(guān)基因的表達(dá)影響，具有高度的特異性及祀向性(Cheng S Q, Wang W L, Yan ff, et al.Knockdownof survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in human hepatocellularcarcinoma cell line SMMC-7721[J].World J Gastroenterol,2005,11 (5):756-759.)。這正是目前分子靶向治療惡性腫瘤所需要的。
[0005](2)白蛋白納米球作為載體的應(yīng)用
[0006]傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物是通過(guò)各種途經(jīng)給藥后，達(dá)到一定的血藥濃度分布于全身而產(chǎn)生治療作用。這種治療方法最大的缺陷是缺乏選擇性，體內(nèi)藥物行為由其理化性質(zhì)及身體解剖/生理學(xué)特點(diǎn)決定。大多數(shù)常用抗腫瘤藥物分子量低，在體內(nèi)容易擴(kuò)散，導(dǎo)致相對(duì)平均的組織分布。往往在治療的同時(shí)產(chǎn)生毒副作用，嚴(yán)重影響這些藥物的抗腫瘤治療價(jià)值。白蛋白是一種天然的可生物降解的高分子材料，具有無(wú)數(shù)的網(wǎng)狀空隙，為鑲嵌攜帶藥物創(chuàng)造了有利的空間條件，因而作為藥物載體尤其是抗腫瘤藥物的載體受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。白蛋白微球就是由人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)制備，是化學(xué)性能穩(wěn)定、無(wú)毒、無(wú)免疫原性和生物相容性好的一種理想的載藥微球(樊繼波，陳永斌，周潔，等.白蛋白微球的制備方法及質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2009，21 (3):58-61.)。白蛋白納米球則是以白蛋白為基質(zhì)的納米級(jí)微粒，白蛋白微納米球在藥物輸送方面具有其獨(dú)特的優(yōu)越性:(1)可緩釋藥物，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)作用時(shí)間；(2)可實(shí)現(xiàn)靶向輸送的目的；(3)可在保證藥物作用的前提下，減少給藥劑量，從而減輕或避免毒副反應(yīng)；(4)可提高藥物的穩(wěn)定性，有利于儲(chǔ)存；(5)可用以建立一些新的給藥途徑，包括體內(nèi)局部給藥、黏膜吸收給藥、多月太類(lèi)藥物的口服給藥等(Felix Kratz.Albumin as a drug carrier:Design of prodrugs,drug conjugates and nanoparticles[J]Journal of Controlled Release，2008，132:171 - 183.)。所以，納米控釋系統(tǒng)是一種非常有前途的藥物新劑型，對(duì)其研究也越來(lái)越深入，用途也會(huì)越廣泛。
[0007] (3)抗原-抗體系統(tǒng)介導(dǎo)的靶向治療
[0008]主要是利用抗原-抗體之間的特異性識(shí)別機(jī)制發(fā)揮主動(dòng)靶向特定細(xì)胞作用的給藥系統(tǒng)。許多抗體對(duì)大多數(shù)腫瘤如肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等的特異性抗原具有識(shí)別作用，重組細(xì)胞工程的發(fā)展也使腫瘤抗體的低成本工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。許多常用抗腫瘤藥物被用于制備單克隆抗體-載藥微粒的偶聯(lián)物，即免疫微粒，是以腫瘤特異性抗體為導(dǎo)向載體，藥物吸附或包封在白蛋白等生物可降解材料中經(jīng)化分離而成的粒徑為納米級(jí)的膠態(tài)固體顆粒，其載藥量較大，具緩釋藥物性，能通過(guò)抗體特異性導(dǎo)向現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞主動(dòng)選擇性結(jié)合殺傷。
[0009]西妥昔為人鼠嵌合型抗EGFR (EGFR為表皮生長(zhǎng)因子受體)單克隆抗體，由美國(guó)禮來(lái)公司原研，德國(guó)默克和美國(guó)施貴寶公司開(kāi)發(fā)，2003年在瑞士首先上市。目前已批準(zhǔn)適應(yīng)證為腸癌、頭頸部癌和鱗狀細(xì)胞癌，用于肺癌尚處于注冊(cè)前階段。與抑制EGFR酪氨酸激酶的一些小分子化合物(易瑞沙，埃羅替尼等)比較，該藥的最大特點(diǎn)是無(wú)論單藥治療還是與放療或與化療聯(lián)合，都能在EGFR表達(dá)陽(yáng)性的癌細(xì)胞發(fā)揮明顯的抗癌作用，顯著增加放療或化療的療效。因此將偶聯(lián)在藥物載體系統(tǒng)的表面，對(duì)高表達(dá)EGFR的癌細(xì)胞有特異性的抗原-抗體識(shí)別機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)靶向治療的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供一種集中運(yùn)用了磁性白蛋白納米及免疫納米球的特點(diǎn)，在白蛋白納米球表面偶聯(lián)單抗的具有靶向性的載基因免疫磁性白蛋白納米球，同時(shí)提供了一種該磁性白蛋白納米球的制備方法。
[0011]技術(shù)方案:本發(fā)明具有靶向性的載基因免疫磁性白蛋白納米球的制備方法，包括如下步驟:
[0012]I)制備載基因磁性白蛋白納米球:
[0013]按照質(zhì)量比30:1-50:1稱(chēng)取聚乙烯亞胺修飾的Fe3O4磁性納米粒懸液與質(zhì)粒survivin-siRNA,將兩者混合后孵育30分鐘以上，得到聚乙烯亞胺修飾的Fe3O4/survivin-siRNA 復(fù)合物；
[0014]按照聚乙烯亞胺修飾的Fe304/survivin-siRNA復(fù)合物與牛血清白蛋白粉質(zhì)量比1:5~3:5，將前者放入牛血清白蛋白溶液中，攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH值至9 ;一邊攪拌，一邊將乙醇緩慢滴至上述混合溶液中，直至溶液呈凝膠狀，得到納米粒溶液；
[0015]按照牛血清白蛋白與25%戍二醒溶液質(zhì)量體積比2mg/ ii I~4mg/ ii I,向納米粒溶液中緩慢滴加25%戊二醛溶液，磁力攪拌12~24小時(shí)，使納米粒交聯(lián)固化，制得固化的載基因磁性白蛋白納米球溶液；
[0016]將載基因磁性白蛋白納米球溶液高速離心，傾去上清液，超聲分散，洗滌3次以上，即得到載基因磁性白蛋白納米球；
[0017]2)采用SPDP交聯(lián)法進(jìn)行鼠抗人EGFR單克隆抗體與載基因磁性白蛋白微球的偶聯(lián)，具體步驟如下:取鼠抗人EGFR單克隆抗體，溶于0.01~0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中，以鼠抗人EGFR單克隆抗體與SPDP摩爾比1: 15，將鼠抗人EGFR單克隆抗體溶液加入15~25mmol/L的SPDP的乙醇溶液中，反應(yīng)60min以上，將反應(yīng)混合物用pH4~5的醋酸鹽緩沖液透析，在得到的帶吡啶二硫基的單克隆抗體溶液中加入二硫蘇糖醇，二硫蘇糖醇與SPDP的質(zhì)量比大于100:1，攪拌30分鐘以上，然后以磷酸鹽緩沖液為透析液進(jìn)行透析，得到帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體溶液；
[0018]將載基因磁性白蛋白納米球懸液超聲分散在PH4~5的醋酸鹽溶液中，然后按照載基因磁性白蛋白納米球與SPDP質(zhì)量比為10:1~20:1，攪拌下滴加SPDP乙醇溶液，高速離心后，用Hank’ s液洗滌，得到活化的磁性白蛋白納米粒；
[0019]按照活化的磁性白蛋白納米粒與帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體質(zhì)量比為20:1~30:1，將兩者的溶液混合，輕搖反應(yīng)15小時(shí)以上，高速離心后，用Hank’ s液洗滌，得到單克隆抗體偶聯(lián)的載基因磁性白蛋白納米球懸液，即為載基因免疫磁性白蛋白納米球。
[0020]本發(fā)明的具有靶向性的載基因免疫磁性白蛋白納米球，是按照上述方法制備得到。
[0021]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0022]本發(fā)明用白蛋白包裹質(zhì)粒起到緩釋作用，體外釋放基因曲線(xiàn)顯示干擾質(zhì)粒從siRNA-1MANS中的釋放符合雙相動(dòng)力學(xué)規(guī)律，初期為快速釋藥，后期為緩慢釋藥，這符合臨床需要，使靶部位迅速達(dá)治療濃度，并長(zhǎng)時(shí)間維持該濃度。能夠持續(xù)高效的進(jìn)行基因治療作用，這也是本課題的創(chuàng)新之一。在白蛋白納米球表面通過(guò)交聯(lián)劑將其與單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，可以實(shí)現(xiàn)其對(duì)特定器官或組織的主動(dòng)靶向作用。西妥昔(C225)單抗是EGFR的單克隆抗體，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制配體與EGFR結(jié)合，阻止EGFR活化。因而我們選擇了已經(jīng)商品化的并已應(yīng)用于臨床的與白蛋白納米球偶聯(lián)，既能起到靶向癌組織的作用，又能競(jìng)爭(zhēng)性抑制配體與EGFR結(jié)合起到治療作用。
[0023]本發(fā)明的價(jià)值在于用“射箭要射靶心”來(lái)比喻靶向?qū)隨iRNA的方法，即:雙分子革巴向聯(lián)合治療技術(shù)。納米磁性白蛋白納米球復(fù)合物介導(dǎo)survivin-siRNA直接貓準(zhǔn)了 EGFR陽(yáng)性肺癌癌細(xì)胞這個(gè)祀心，在C225分子靶向治療肺癌的同時(shí)，使RNA干擾治療更為有效，并能避免“隨機(jī)射擊式”的治療對(duì)無(wú)辜健康組織造成的損害。有望為臨床分子靶向治療肺癌提供可靠的理論及實(shí)踐依據(jù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是載基因免疫磁性納米球的TEM圖。
[0025]圖2是載基因免疫磁性白蛋白納米球體外釋基因曲線(xiàn)圖。
[0026]圖3是免疫納米球與人肺癌細(xì)胞孵育后的SEM圖。
[0027]圖4是非免疫納米球與人肺癌細(xì)胞孵育后的SM圖。
[0028]圖5是人肺癌細(xì)胞的SEM圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0029]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案做進(jìn)一步具體說(shuō)明。
[0030]實(shí)施例1:
[0031]I)載基因磁性白蛋白納米球(siRNA-MANS)的制備
[0032]將PE1-Fe3O4磁性納米粒懸液與質(zhì)粒survivin-siRNA按照質(zhì)量比為50:1孵育3Omin 以上，得到 PE1-Fe304/survivin_siRNA 復(fù)合物；
[0033]按照PE1-Fe304/surViVin-siRNA復(fù)合物與牛血清白蛋白質(zhì)量比2:5，將PE1-Fe3O4/survivin-siRNA復(fù)合物放入牛血清白蛋白溶液中，攪拌混勻,調(diào)節(jié)pH值至9 ;一邊攪拌，一邊將乙醇緩慢滴至上述混合溶液中，直至溶液呈凝膠狀，得到納米粒溶液，該過(guò)程為去溶劑化過(guò)程；按照牛血清白蛋白與25%戊二醛溶液質(zhì)量體積比4mg/ia，向上述納米粒溶液中緩慢滴加25%戊二醛溶液，室溫磁力攪拌12~24h，使納米粒交聯(lián)固化，制得固化的載基因磁性白蛋白納米球(siRNA-MANS)溶液；
[0034]將納米球溶液以12000r/min的轉(zhuǎn)速高速離心,傾去上清液,加水至原體積,超聲分散。洗滌3次以上，去除制備中加入的有機(jī)溶劑，即得到載基因磁性白蛋白納米球。
[0035]2)載基因免疫磁性白蛋白納米球(siRNA-1MANS)的制備
[0036]采用SPDP交 聯(lián)法進(jìn)行鼠抗人EGFR單克隆抗體與載基因磁性白蛋白微球的偶聯(lián)，具體步驟如下:取適量鼠抗人EGFR單克隆抗體C225 (monoclonal antibody, McAb),溶于
0.01mol/LPBS(pH7.4)中，以摩爾比I:15的比例加入20mmol/LSPDP的乙醇溶液，室溫反應(yīng)60min,將反應(yīng)混合物裝入預(yù)處理好的透析袋中，以pH4.5,0.01mmol/L的醋酸鹽緩沖液透析，除去過(guò)量的SPDP。在得到的帶吡啶二硫基的單克隆抗體(McAb-PDP)溶液中加入二硫蘇糖醇，二硫蘇糖醇與SPDP的質(zhì)量比大于100:1即可，室溫輕攪30min，以PBS為透析液透析過(guò)夜，除去多余的DTT，最后得到帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體(McAb-PDP-SH)溶液；其中SPDP為3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。
[0037]按照載基因磁性白蛋白納米球與SPDP質(zhì)量比為20:1，將載基因磁性白蛋白納米球懸液超聲分散在PH4~5的醋酸鹽溶液中，攪拌下滴加SPDP乙醇溶液，高速離心后，用Hank’s液洗滌，得到活化的磁性白蛋白納米粒；其中Hank’s液為一種平衡鹽溶液，主要用于細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。主要由氯化鉀，氯化鈣，氯化鈉，硫酸鎂，氯化鎂，磷酸氫鈉，磷酸氫鉀，葡萄糖，酚紅等配置而成。
[0038]按照質(zhì)量比為25:1，將活化的磁性白蛋白納米粒與帶巰基的鼠抗人EGFR單克隆抗體溶液混合，輕搖反應(yīng)18h, 15000r/min離心后,用Hank’ s液洗漆,得到單克隆抗體偶聯(lián)的載基因磁性白蛋白納米球懸液，即為載基因免疫磁性白蛋白納米球(siRNA-1MANS)。
[0039]按每種物質(zhì)不同的不同的配比制備的其他具體實(shí)施例如下:
[0040]實(shí)施例2:基本流程步驟同實(shí)施例1，與實(shí)施例1不同之處在于:
[0041]步驟I)中PE1-Fe3O4磁性納米粒懸液與質(zhì)粒survivin-siRNA的質(zhì)量比為30:I，然后孵育制備聚乙烯亞胺修飾的Fe304/survivin-siRNA復(fù)合物；按照PE1-Fe3O4/survivin-siRNA復(fù)合物與牛血清白蛋白質(zhì)量比為1:5制備納米粒溶液；按照牛血清白蛋白與25%戊二醛溶液質(zhì)量體積比3mg/iil，制備固化的載基因磁性白蛋白納米球溶液。
[0042]步驟2)中鼠抗人EGFR單克隆抗體溶于0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液中；將鼠抗人EGFR單克隆抗體溶液加入15mmol/L的SPDP的乙醇溶液中；在得到的帶吡啶二硫基的單克隆抗體溶液中加入二硫蘇糖醇，二硫蘇糖醇與SPDP的質(zhì)量比大于150:1 ;按照載基因磁性白蛋白納米球與SPDP質(zhì)量比為10:1制備活化的磁性白蛋白納米粒；按照質(zhì)量比20::1，將活化的磁性白蛋白納米粒與帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體溶液混合，制備載基因免疫磁性白蛋白納米球。
[0043]本實(shí)施例的其他比例關(guān)系與實(shí)施例1相同。
[0044]實(shí)施例3:基本流程步驟同實(shí)施例1，與實(shí)施例1不同之處在于: [0045]步驟I)中PE1-Fe3O4磁性納米粒懸液與質(zhì)粒survivin-siRNA的質(zhì)量比為40:I，然后孵育制備聚乙烯亞胺修飾的Fe304/survivin-siRNA復(fù)合物；按照PE1-Fe3O4/survivin-siRNA復(fù)合物與牛血清白蛋白質(zhì)量比為3:5制備納米粒溶液；按照牛血清白蛋白與25%戊二醛溶液質(zhì)量體積比2mg/iil，制備固化的載基因磁性白蛋白納米球溶液。
[0046]步驟2)中，鼠抗人EGFR單克隆抗體溶于0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中；將鼠抗人EGFR單克隆抗體溶液加入25mmol/L的SPDP的乙醇溶液中；在得到的帶吡啶二硫基的單克隆抗體(McAb-PDP)溶液中加入二硫蘇糖醇，二硫蘇糖醇與SPDP的質(zhì)量比大于200:1 ;按照載基因磁性白蛋白納米球與SPDP質(zhì)量比為15:1制備活化的磁性白蛋白納米粒；按照質(zhì)量比30::1，將活化的磁性白蛋白納米粒與帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體溶液混合，制備載基因免疫磁性白蛋白納米球。
[0047]本實(shí)施例的其他比例關(guān)系與實(shí)施例1相同。
[0048]1.siRNA-1MANS 的表征
[0049]1.1電鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)
[0050]取出少量制備的免疫磁性白蛋白納米球懸液，充分混勻后，滴有膜銅網(wǎng)，制得電鏡樣品，在JEM-2010型TEM下觀(guān)察。
[0051]圖1顯示自制的載基因免疫磁性納米球在TEM檢測(cè)下近似球形，大小均勻，直徑在200nm左右，并且清晰地觀(guān)察到有電子密度較高的磁性顆粒在其質(zhì)中。其余實(shí)施例觀(guān)察的結(jié)果與此圖片相似。
[0052]1.2體外動(dòng)態(tài)釋放基因速率的動(dòng)態(tài)測(cè)定
[0053]用動(dòng)態(tài)透析法考察載基因磁性白蛋白納米球的體外釋藥。取15mL的樣品置入已經(jīng)處理好的透析袋中，扎緊兩端，置于裝有IOOmL醋酸鹽緩沖液的燒杯中，在37°C恒溫?fù)u床中并以150r/min的速度進(jìn)行震蕩，分別于固定時(shí)間定時(shí)取出5mL上清液同時(shí)補(bǔ)充相等量的緩沖液。測(cè)定釋放液中DNA的含量，繪制時(shí)間與累積釋放質(zhì)粒濃度曲線(xiàn)。
[0054]體外動(dòng)態(tài)釋放速率，計(jì)算其累積釋放率顯示，該材料13小時(shí)釋放DNA為96.89%，曲線(xiàn)平緩(圖2)。其他實(shí)施例的釋放曲線(xiàn)與此曲線(xiàn)差別不明顯。
[0055]1.3載基因免疫磁性納米球轉(zhuǎn)染效率的觀(guān)察
[0056]將GLC-82細(xì)胞接種于6_孔板中，每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞，孵育18小時(shí)后(細(xì)胞有80%融合)，用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基替換原來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)基，按照轉(zhuǎn)染步驟操作，分成siRNA-1MANS組、siRNA-MANS組和空白蛋白納米球(ANS)組。轉(zhuǎn)染48h后于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率。
[0057]結(jié)果顯示，siRNA-1MANS組、siRNA-MANS組都能有效轉(zhuǎn)移帶有表達(dá)綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒survivin-shRNA-2進(jìn)入GLC-82細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察到亮綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，空白蛋白納米球組未見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。但在同樣條件下siRNA-1MANS組的轉(zhuǎn)染效率比siRNA-MANS組高。
[0058]2siRNA-1MANS的免疫特性檢測(cè)
[0059]2.1玻片凝集實(shí)驗(yàn)
[0060]在潔凈載玻片上，將siRNA-1MANS或siRNA-MANS懸液同兔抗小鼠IgG抗血清等量混合，37°C孵育數(shù)分鐘，光鏡下觀(guān)察納米球的狀態(tài)。
[0061]兔抗小鼠IgG抗血清加入后，原先分散均勻的siRNA-1MANS形成凝集塊，而siRNA-MANS仍處于均勻分散狀態(tài)。
[0062]2.2免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)
[0063]取siRNA-1MANS或siRNA-MANS懸液，加入等量AlexaFluor488標(biāo)記的兔抗小鼠IgG，4°C作用60min，用PBS洗滌沉淀3次，即得AleXaFluor488標(biāo)記的熒光免疫白蛋白納米球，將其置于熒光顯微鏡下觀(guān)察納米球的熒光染色結(jié)果。
[0064]結(jié)果顯示加入兔抗小鼠IgG-Alexa Fluor488后，siRNA-1MANS表面發(fā)出明亮黃綠色熒光，而siRNA-MANS不能被兔抗小鼠IgG_AlexaFluor488染色，未見(jiàn)熒光。
[0065]3C225-siRNA-MANS靶向結(jié)合人肺癌細(xì)胞的研究
[0066]3.1普魯士藍(lán)染色
[0067]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLC-82細(xì)胞接種于12孔板中，每孔約含細(xì)胞3 X 104，24h細(xì)胞貼壁后，將單抗靶向(siRNA-1 MANS)和非靶向組(ANS)與GLC-82共孵育24h后，通過(guò)普魯士藍(lán)染色觀(guān)察GLC-82細(xì)胞內(nèi)含鐵的情況，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)納米球的靶向吸收情況。
[0068]普魯士藍(lán)染色步驟如下:①拿出24孔板，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗3遍?’②10%甲醛固定30min，PBS洗3遍；③取4%亞鐵氰化鉀水溶液和4%鹽酸水溶液等份混合，滴在切片上，37度培養(yǎng)箱孵育30min PBS洗3遍，倒置相差顯微鏡觀(guān)察拍照。
[0069]單抗靶向組、磁靶向組與GLC-82細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞內(nèi)大量鐵存在，可以見(jiàn)到大量藍(lán)染顆粒；而非靶向組細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯鐵顆粒的存在。
[0070]3.2免疫熒光染色
[0071]免疫熒光按以下步驟操作:
[0072]l).GLC-82 細(xì)胞爬片；
[0073]2) ? 24h后冷丙酮室溫固定IOmin ；
[0074]3) ? PBS 漂洗 3 次，每次 5min ；
[0075]4).0.5%Triton 穿孔 15min ；
[0076]5) ? PBS 漂洗 2 次，每次 5min ；
[0077]6).1%BSA 封閉 30min ；
[0078]7).加入 1%BSA 稀釋的 siRNA-1MANS 或 siRNA-MANS，于 4°C反應(yīng)過(guò)夜；
[0079]8) ? PBST 漂洗 3 次，每次 5min ；
[0080]9).加入1%BSA稀釋的熒光二抗，于37°C雜交Ih ；
[0081]10) ? PBST 漂洗 3 次，每次 5min ；
[0082]11) ? 5ug/mlDAPI 染核 3min ;
[0083]12).抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦下觀(guān)察結(jié)果。
[0084]結(jié)果顯示單抗靶向組能與人肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合，被兔抗小鼠IgG-AlexaFluor488染色，結(jié)合了免疫微球的細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)出明亮熒光。而非靶向組未被兔抗小鼠IgG-AleXaFluor488熒光染色，在細(xì)胞周?chē)鞍麧{也未觀(guān)察到熒光。
[0085]3.3siRNA-1MANS體外結(jié)合肺癌細(xì)胞電鏡觀(guān)察
[0086]將生長(zhǎng)良好的靶細(xì)胞GLC-82經(jīng)5mL的胰蛋白酶消化后離心，用含5%小牛血清的PBS洗滌沉淀后將沉淀配制成2X 105/mL細(xì)胞懸液，加入免疫磁性白蛋白納米球(siRNA-1MANS)或納米球(siRNA-MANS)，室溫振蕩60min，離心，沉淀用PBS洗滌3次后于光鏡下觀(guān)察細(xì)胞和微粒的結(jié)合情況。
[0087]取潔凈載玻片滴加1%多聚賴(lài)氨酸，37°C烘干。取免疫納米球與靶細(xì)胞的結(jié)合物滴加于玻片上，4°C作用30min，浸入PBS中輕輕洗滌后，用2.5%戊二醛4°C固定30min，浸入蒸餾水中輕輕洗滌，依次用50%、70%、90%、100%乙醇脫水，自然干燥，真空下噴鍍膠體金，電鏡掃描觀(guān)察免疫納米球與靶細(xì)胞的結(jié)合情況。
[0088]電鏡掃描siRNA-1MANS與GLC-82的結(jié)合情況示于圖3至圖5，多個(gè)siRNA-1MANS緊密結(jié)合于人肺癌細(xì)胞表面，似葡萄狀或串珠狀(圖3)，與siRNA-MANS結(jié)合的GLC-82細(xì)胞(圖4)和僅經(jīng)胰酶消化后的人肺癌細(xì)胞GLC-82(圖5)有明顯差別。
[0089]4siRNA-1MANS對(duì)GLC-82細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
[0090]4.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0091]GLC-82細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37°C，飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。
[0092]4.2MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖率
[0093]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLC-82細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4X IO4個(gè)/ml，按每孔IOOu I接種于3個(gè)96孔板，分組分別為:陰性對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)液)、游離C225組、磁靶向基因治療(siRNA-MANS)組、單抗靶向基因治療(siRNA-1MANS)組、雙靶向(磁靶向與單抗靶向)基因治療組。每組6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種24h后，按分組情況分別加入DMEM培養(yǎng)液、C225、納米球siRNA-MANS以及免疫納米球siRNA-1MANS，并在磁靶向組與雙革巴向組的96孔板下置96孔磁板(Magneto FCTOR plate, chemicell德國(guó))。分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，96h后，加入MTT20 U I/孔，同前條件繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150 u 1DMS0,振蕩混勻lOmin，離心后取上清置于酶標(biāo)儀上讀取493nm處OD值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值X 100%。
[0094]各組細(xì)胞存活率根據(jù)測(cè)得的OD值，按公式:細(xì)胞存活率(％)=實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值X 100計(jì)算并列于(表1 )。從三天測(cè)得的MTT結(jié)果顯示游離C225組、磁靶向基因治療(siRNA-MANS)組、單抗靶向基因治療(siRNA-1MANS)組及雙靶向基因治療組對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并且雙靶向基因治療組的抑制作用明顯高于其它兩組單獨(dú)治療組，有顯著差異。而與單抗靶向基因治療組無(wú)顯著差異。三天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比顯示96h的各組抑制效果是最好的 ，而24h的是最差的。
[0095]表1GLC-82細(xì)胞生存率MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(fiS )
[0096]
【權(quán)利要求】
1.一種具有靶向性的載基因免疫磁性白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，該方法包括下述步驟: 1)制備載基因磁性白蛋白納米球: 按照質(zhì)量比30:1-50:1稱(chēng)取聚乙烯亞胺修飾的Fe3O4磁性納米粒懸液與質(zhì)粒survivin-siRNA,將兩者混合后孵育30分鐘以上，得到聚乙烯亞胺修飾的Fe3O4/survivin-siRNA 復(fù)合物； 按照聚乙烯亞胺修飾的Fe304/survivin_siRNA復(fù)合物與牛血清白蛋白粉質(zhì)量比1:5^3:5，將前者放入牛血清白蛋白溶液中，攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH值至9;一邊攪拌，一邊將乙醇緩慢滴至上述混合溶液中，直至溶液呈凝膠狀，得到納米粒溶液； 按照牛血清白蛋白與25%戍二醒溶液質(zhì)量體積比2mg/~4mg/,向所述納米粒溶液中緩慢滴加25%戊二醛溶液，磁力攪拌12~24小時(shí)，使納米粒交聯(lián)固化，制得固化的載基因磁性白蛋白納米球溶液； 將所述載基因磁性白蛋白納米球溶液高速離心，傾去上清液，超聲分散，洗滌3次以上，即得到載基因磁性白蛋白納米球； 2)采用SPDP交聯(lián)法進(jìn)行鼠抗人EGFR單克隆抗體與載基因磁性白蛋白微球的偶聯(lián)，具體步驟如下:取鼠抗人EGFR單克隆抗體，溶于0.0f0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中，以鼠抗人EGFR單克隆抗體與SPDP摩爾比1: 15，將鼠抗人EGFR單克隆抗體溶液加入15~25 mmol/L的SPDP的乙醇溶液中，反應(yīng)60min以上，將反應(yīng)混合物用pH4飛的醋酸鹽緩沖液透析，在得到的帶吡啶二硫基的單克隆抗體溶液中加入二硫蘇糖醇，所述二硫蘇糖醇與SPDP的質(zhì)量比大于100:1，攪拌30分鐘以上，然后以磷酸鹽緩沖液為透析液進(jìn)行透析，得到帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體溶液； 將載基因磁性白蛋白納米球懸液超聲分散在PH4~5的醋酸鹽溶液中，然后按照載基因磁性白蛋白納米球與SPDP質(zhì)量比為10:r20:1，攪拌下滴加SPDP乙醇溶液，高速離心后，用Hank’ s液洗滌，得到活化的磁性白蛋白納米粒； 按照活化的磁性白蛋白納米粒與帶巰基的鼠抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體質(zhì)量比為20:r30:1，將兩者的溶液混合，輕搖反應(yīng)15小時(shí)以上，高速離心后，用Hank’s液洗滌，得到單克隆抗體偶聯(lián)的載基因磁性白蛋白納米球懸液，即為載基因免疫磁性白蛋白納米球。
2.一種具有靶向性的載基因免疫磁性白蛋白納米球，其特征在于，該磁性白蛋白納米球是按照權(quán)利要求1所述方法制備得到。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103611169SQ201310634623
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】張東生, 侯欣欣, 張皓 申請(qǐng)人:東南大學(xué)