一種抗體口含制品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗體口含制品及其制備方法，所述的抗體口含制品含有安全、有效的可食用的抗體。所述抗體對下述至少一種病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用：流感病毒包括禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，鼻病毒，冠狀病毒，輪狀病毒，腺病毒，腸病毒，呼吸道合胞病毒或A組鏈球菌。本發(fā)明所述的抗體口含制品具有成本低、特異性強(qiáng)、活性高、安全可食用等優(yōu)點(diǎn)，可用于口腔或呼吸道的清潔或感染性疾病的預(yù)防或輔助治療。
【專利說明】ー種抗體ロ含制品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及ー種抗體ロ含制品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗體藥物是對目標(biāo)抗原(如病毒、細(xì)菌、癌細(xì)胞等)具有非常特異的識(shí)別與抑制能力的ー種蛋白類藥物，由于其對目標(biāo)特異性強(qiáng)對身體副作用小成為目前世界上最具發(fā)展?jié)摿Φ男滦退幬?，也是最昂貴的藥物(價(jià)格是同樣治療目的化學(xué)藥的幾十倍)。抗體藥物雖然價(jià)格高昂但市場巨大利潤豐富，因此，近年來抗體藥物成了世界各大制藥巨頭追逐的研發(fā)方向。
[0003]目前市面上有預(yù)防疾病功能的ロ含制品有中藥型、果蔬型、維生素型尚未見有抗體ロ含制品。有報(bào)導(dǎo)ー種可用于預(yù)防非典型肺炎等傳染性疫癥防疫ロ含片(專利申請?zhí)?CN03108028.6)，它是ー種以甘草、香白芷、細(xì)辛、冰片、朱砂等原料為基本組方加工制成的ロ含制品。另有報(bào)導(dǎo)ー種抗病毒ロ含片(專利申請?zhí)?CN200610055156.5)，它是ー種以中成藥抗病毒ロ服液的處方及制備エ藝提取獲得粗提物為主料再加入輔料后壓制成片口含制品。
[0004]近來，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所公開了ー種提取禽流感卵黃抗體的方法(專利申請?zhí)?CN201110447572.0)。另有報(bào)導(dǎo)(專利申請?zhí)?CN02103760.4)公開了ー種通過接種人類預(yù)防傳染病的疫苗給母雞的方法，使母雞生產(chǎn)含有特異性免疫抗體的雞蛋。直接食用該免疫雞蛋有望消除體內(nèi)炎癥和提高防疫能力。然而，上述報(bào)導(dǎo)并未涉及如何，包括以什么樣形式，將抗體生產(chǎn)成真正有效的能預(yù)防疾病的合適產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供含有一種或多種能對不利于身體的有害物質(zhì)尤其是對口腔或呼吸道病毒和細(xì)菌有特異性中和或抑制作用的抗體，可用于口腔或呼吸道的清潔或感染性疾病的預(yù)防或輔助治療。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:ー種抗體ロ含制品，包括賦形劑，其特征是，還含有至少ー種對病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用的抗體。
[0007]所述抗體對下述ー種或多種病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用。所述病毒和/或細(xì)菌包括但不限于:流感病毒包括禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，鼻病毒，冠狀病毒，輪狀病毒，腺病毒，腸病毒，呼吸道合胞病毒或A組鏈球菌。
[0008]所述抗體ロ含制品中最終抗體效價(jià)為100-100000滴度，最好在1000-10000滴度范圍。
[0009]所述抗體是從免疫過哺乳母動(dòng)物(如:奶牛和奶山羊)，下的乳中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
[0010]所述抗體是從免疫過的母禽(如:母雞)，下的蛋中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
[0011]所述抗體是從免疫過動(dòng)物的血液中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
[0012]所述抗體是從細(xì)胞培養(yǎng)液動(dòng)物腹水中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性單克隆抗體。
[0013]所述抗體是由對應(yīng)的抗原經(jīng)免疫動(dòng)物后獲得。所述抗原可以是ー個(gè)單ー的病毒或多個(gè)病毒株的組合裂解液或減毒的活株；也可以是商業(yè)上使用的疫苗，如甲型HlNl流感疫苗；流感病毒的選擇可以采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的季節(jié)性流感病毒；可以是任何病毒或細(xì)菌的蛋白質(zhì)，尤其是病毒或細(xì)菌中分離出來的表面或膜蛋白；抗原蛋白可以是通過基因工程技術(shù)制備的或人工合成的與所述呼吸道感染有關(guān)的病毒或細(xì)菌蛋白整體或根據(jù)其氨基酸序列制備的片段或多肽；所述抗原也可以是ー種基于DNA的疫苗，它可以在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗原。
[0014]ー種抗體ロ含制品的制備方法，包括下述幾個(gè)步驟:1)抗原選擇及制備；2)動(dòng)物免疫；3)抗體提??；4) ロ含制品制備。
[0015]所述步驟I)中的抗原是選用下述的ー種或多種病毒和/或細(xì)菌的裂解液或減毒的活株，或純化的病毒或細(xì)菌相關(guān)蛋白，在免疫動(dòng)物之前與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合、乳化制得；所述 的病毒或細(xì)菌包括但不限于:流感病毒，禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，鼻病毒，冠狀病毒，輪狀病毒，腺病毒，腸病毒，呼吸道合胞病毒或A組鏈球菌。
[0016]所述步驟4)中的ロ含制品制備過程中，抗體或摻合了抗體的原料、半成品、成品采用65°C以下低溫流程。所述抗體在最終ロ含制品中的效價(jià)需調(diào)至100-100000滴度，最好在1000-10000滴度范圍。
[0017]所述步驟4)的エ藝流程包括:1)將ロ含制品基料破碎、干燥、過篩備用；2)取部分過篩后的基料充分混勻，然后和純化水及已備好的抗體溶液調(diào)和單獨(dú)制粒、低溫干燥、破碎、過篩備用；3)將剩余的過篩后的基料與其它輔料及矯味劑充分混勻制空白粒、干燥、破碎、過篩備用；4)將兩種顆粒充分混勻、加入助流劑、混合均勻后壓片，制得抗體ロ含片。
[0018]所述步驟4)的エ藝流程還包括:1)將膠基與糖漿在高溫溶化、混和；2)加入糖粉及香料輔料，混和制成膠團(tuán)；3)將膠團(tuán)溫度調(diào)降至在45-50°C，加入抗體活性成分，充分混；
4)壓延、切片成型，制成抗體ロ香糖。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所述的抗體ロ含制品所含抗體是安全的有效的可食用的。由本發(fā)明所述的疾病預(yù)防型抗體ロ含制品具有成本低、特異性強(qiáng)、活性高、安全可食用等優(yōu)點(diǎn)，可用于口腔或呼吸道的清潔或感染性疾病的預(yù)防或輔助治療。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明:
[0021]本發(fā)明的抗體ロ含制品，包括賦形劑，還含有至少ー種對病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用的抗體。
[0022]所述抗體對下述ー種或多種病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用:流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，鼻病毒，冠狀病毒，輪狀病毒，腺病毒，腸病毒，呼吸道合胞病毒或A組鏈球菌。
[0023]所述抗體ロ含制品中最終抗體效價(jià)為100-100000滴度，最好在1000-10000滴度范圍。
[0024]所述抗體是從免疫過哺乳母動(dòng)物下的乳中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
[0025]所述抗體是從免疫過的母禽，下的蛋中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
[0026]所述抗體是從免疫過動(dòng)物的血液中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
[0027]所述抗體是從細(xì)胞培養(yǎng)液動(dòng)物腹水中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性單克隆抗體。
[0028]抗體ロ含制品的制備方法，包括下述幾個(gè)步驟:1)抗原選擇及制備；2)動(dòng)物免疫；
3)抗體提??；4) ロ含制品制備。
[0029]所述步驟I)中的抗原是選用下述的ー種或多種病毒和/或細(xì)菌的裂解液或減毒的活株，或純化的病毒或細(xì)菌相 關(guān)蛋白，在免疫動(dòng)物之前與弗氏完全佐劑(初次免疫用)或弗氏不完全佐劑(后續(xù)免疫用)混合、乳化制得；所述的病毒或細(xì)菌包括:流感病毒，禽流感病毒(influenza virus),呼吸道合胞病毒(RSV) (respiratory syncytialvirus),人類副流感病毒 3, HPIV-3 (human parainfluenza virus3),肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia e ),流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae),如:こ型流感嗜血桿菌(Hib),鼻病毒，冠狀病毒(rhinovirus),輪狀病毒(coronavirus),腺病毒(adenovirus；, 1--? (enterovirus；, BsF(respiratory syncytial virus；,A 組鏈球菌(group A streptococcus)等。
[0030]所述步驟4)中的ロ含制品制備過程中，抗體或摻合了抗體的原料、半成品、成品采用65°C以下，最好是45°C以下低溫流程。所述步驟4)的エ藝流程包括:1)將ロ含制品基料，如:可溶性淀粉、蔗糖等，破碎、干燥、過篩備用；2)取部分過篩后的基料充分混勻，然后和純化水及已備好的抗體溶液調(diào)和單獨(dú)制粒、低溫干燥、破碎、過篩備用；3)將剩余的分過篩后的基料與其它輔料，如:甘露醇，及矯味劑，如:薄荷、檸檬酸，充分混勻制空白粒、干燥、破碎、過篩備用；4)將兩種顆粒充分混勻、加入助流劑，如:硬脂酸鎂、混合均勻后壓片，制成抗體ロ含片。
[0031]所述的ロ含制品也可以制成ロ香糖形式，其制備方法基本上是:先將膠基與糖漿在高溫溶化、混和，然后加入糖粉及香料等輔料，混和后將膠團(tuán)溫度調(diào)降至在45-50°C，此時(shí)加入抗體等活性成分經(jīng)充分混和后壓延、切片成型。ロ香糖的基本組分比是:膠基18-20%，糖60%左右，葡萄糖漿20%左右，甘油0.3-0.5%，抗體適量，調(diào)香料和調(diào)味料適量。
[0032]實(shí)施例1.流感病毒抗原制備:
[0033]將甲型H1N1、H3N2流感病毒和こ型布里斯班病毒分別裂解然后按1:1:1比例混合，制的三種流感病毒裂解混合液，備 用。免疫時(shí)，再將此混合液與弗氏完全佐劑(第一次免疫用)或與弗氏不完全佐劑(后續(xù)免疫用)按1:1比例混合、乳化制得含總抗原約0.6mg/ml的抗原混合液。
[0034]實(shí)施例2.奶抗體制 備:[0035]選懷孕奶牛(荷斯坦奶牛)，在產(chǎn)仔日前九個(gè)星期，皮下注射50毫克的實(shí)施例1中所述的用弗氏完全佐劑乳化的抗原混合液，進(jìn)行首次免疫，三周和七周后，用30毫克實(shí)施例I中所述的用弗氏不完全佐劑乳化的抗原混合液再分別免疫各一次。分娩后，再重新免疫兩次注射在胸腺附近的淋巴結(jié)。動(dòng)物分娩后連續(xù)收集初乳和常乳五個(gè)月。以12，000g離心15分鐘除去乳脂肪，得脫脂抗體乳，經(jīng)60°C 30分鐘巴氏滅菌(注:巴氏滅菌會(huì)使抗體活性下降20%左右)后分裝、冷凍保存?zhèn)溆?。取少量樣品，檢測牛奶中的每種免疫球蛋白類的濃度:分別使用HRP偶聯(lián)的兔抗牛IgG，IgA和IgM特定的第二抗體及ELISA測定法來定量IgG, IgA和IgM濃度。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果:免疫奶中的IgG、IgA和IgM的平均濃度分別達(dá)到
0.3g/L、0.02g/L和0.01g/L ;合并使用HRP偶聯(lián)的兔抗牛IgG，IgA和IgM特定的第二抗體經(jīng)間接ELISA法(該檢測法為公知的方法，可參照實(shí)施例4中所述抗體活性檢測)檢測，該抗體乳對HlNl、H3N2和こ型布里斯班病毒三種抗原均呈特異性陽性，滴度分別達(dá)600倍，450倍和400倍。將此抗體乳冷凍干燥成凍干粉，分裝、冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0036]實(shí)施例3卵黃抗體制備:
[0037]將甲型HlNl流感病毒和こ型流感嗜血桿菌(Hib)分別裂解然后按1:1比例混合，制得含總抗原約0.4mg/ml的抗原混合液，備用。選好初產(chǎn)或豐產(chǎn)期的健康羅馬母雞，對每只母雞通過皮下多點(diǎn)注射含0.2毫克抗原的按1:1比例與弗氏完全佐劑混合、乳化的抗原混合液，進(jìn)行首次免疫。兩周后通過再注射含0.1毫克抗原的按1:1比例與弗氏不完全佐劑混合、乳化的抗原混合液，進(jìn)行二次免疫。再過兩周后通過再注射再注射含0.1毫克抗原的按1:1比例與弗氏不完全佐劑混合、乳化的抗原混合液，進(jìn)行三次免疫。收集自第一次免疫起6周后的雞蛋。每隔ー個(gè)月再注射一次含0.1毫克抗原的按1:1比例與弗氏不完全佐劑混合、乳化的抗原混合液。
[0038]從雞蛋中分離出蛋黃，然后加5倍體積的去離子水并調(diào)pH至5.5，靜置過夜，離心取上清，然后加PEG-6000至12%，室溫放置30分鐘，2000rpm離心15分鐘，所得沉淀以3倍體積的0.01mol/L的Tris-HCl (pH8.0)緩沖液溶解，獲得抗HlNl流感病毒和抗Hib流感嗜血桿菌的特異蛋黃抗體液。然后，取蛋黃抗體液0.1毫升用間接ELISA法(該檢測法為公知的方法，可參照實(shí)施例4中所述抗體活性檢測)檢測抗體滴度，根據(jù)檢測結(jié)果，低溫濃縮或用0.01mol/L的Tris-HCl (pH8.0)緩沖液稀釋調(diào)所得抗體液至滴度至10000以上，然后無菌過濾、分裝、冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0039]實(shí)施例4.抗體ロ含片制備
[0040]I?抗體ロ含片生產(chǎn)工藝:
[0041]A:將1000克可溶性淀粉真空低溫干燥，過篩備用；將100克蔗糖粉碎，80目過篩備用;
[0042]B:分別取部分過篩的可溶性淀粉200克和蔗糖粉20克充分混勻，混勻后和輔料甘露醇10克、已備好的效價(jià)等于或大于100000滴度的抗體溶縮液15ml (或抗體凍干粉加適量純凈水調(diào)和成IOml)制粒，45°C以下低溫真空干燥，破碎，30目過篩，備用；
[0043]C:將剩余的過篩的可溶性淀粉蔗和糖粉加上甘露醇50克及檸檬酸I克充分混勻，制空白粒，干燥，破碎，30目過篩，備用；
[0044]D:將兩種顆粒充分混勻，加入助流劑硬脂酸鎂10克，總混，混合均勻后壓片，每片I克；[0045]E:質(zhì)量檢測；
[0046]F:鋁塑包裝。
[0047]注:為保護(hù)抗體的活性，上述ロ含制品制備エ藝中必須避免高溫(65°C以下，最好45°C以下)。
[0048]2.抗體活性檢測:
[0049]取一片由牛奶抗體制備的抗體ロ含制品(I克)將其浸泡于5ml的PBS緩沖液，室溫I小吋，然后經(jīng)6000RPM轉(zhuǎn)速10分鐘離心，取得上清液。
[0050]抗體特異性測定:采用間接酶聯(lián)免疫檢測法測定，將HlNl病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)品(來自英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)及控制研究所的由雞蛋培育的抗原California/7/2009(NYMC X-179A)，(NIBSC代碼:09/146))用PBS緩沖液稀釋至4ug/ml，按每槽IOOul的量添加到酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽中，室溫靜置3小時(shí)后棄去該液體，并用PBS緩沖液洗盤3次，然后于每個(gè)槽中加入200ml封閉液(溶于PBS緩沖液的1%人血清蛋白HAS)室溫靜置3小時(shí)后棄去該液體，再用PBS緩沖液洗盤3次，涼干備用。將待測樣品上清液用PBS緩沖液按1:3梯度稀釋，制備8份不同的稀釋液，其中一份不含任何待測樣品，每份0.2ml;每份取IOOul添加到上述抗原包被過的酶標(biāo)盤上不同的槽中，每份樣品測兩次，室溫靜置孵育2小時(shí)后棄去該液體，用洗滌液(0.l%Tween20溶于PBS緩沖液)洗盤3次；取IOOul HRP標(biāo)記的兔抗牛二抗(當(dāng)ロ含制品中抗體提取自牛奶時(shí))或兔抗雞IgY 二抗(當(dāng)ロ含制品中抗體提取自雞蛋時(shí))的稀釋液(0.05%溶于含1%人血清蛋白的HBS緩沖液)添加到酶標(biāo)盤的各個(gè)槽中，室溫靜置孵育I小時(shí)后棄去該液體，用洗滌液(0.l%Tween20溶于PBS緩沖液)洗盤3次；取IOOul含H202的TMB顯色液添加到酶標(biāo)盤的各個(gè)槽中，室溫靜置至藍(lán)色梯度出現(xiàn)，然后添加lOOullM的H2S04終止液到酶標(biāo)盤的各個(gè)槽中終止顯色；用酶標(biāo)儀在450nm下檢測各槽的吸光度。
[0051]檢測結(jié)果(如下表)顯示所測ロ含制品特異抗體活性較強(qiáng)，特異性抗體滴度超1200。
[0052]表1，間接酶聯(lián)免疫法檢測ロ含制品特異性抗體滴度結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.ー種抗體ロ含制品，包括賦形劑，其特征是，還含有至少ー種對病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體ロ含制品，其特征是，所述抗體對下述至少ー種病毒和/或細(xì)菌有特異性中和或抑制作用:流感病毒，禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，鼻病毒，冠狀病毒，輪狀病毒，腺病毒，腸病毒，呼吸道合胞病毒或A組鏈球菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體ロ含制品，其特征是，所述抗體是從免疫過哺乳母動(dòng)物下的乳中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體ロ含制品，其特征是，所述抗體是從免疫過的母禽下的蛋中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體ロ含制品，其特征是，所述抗體是從免疫過動(dòng)物的血液中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體ロ含制品，其特征是，所述抗體是從細(xì)胞培養(yǎng)液動(dòng)物腹水中提取的并且對至少ー種病毒和/或細(xì)菌具有特異性中和或抑制作用的活性單克隆抗體。
7.ー種抗體ロ含制品的制備方法，其特征是，包括下述幾個(gè)步驟:1)抗原選擇及制備；2)動(dòng)物免疫；3)抗體提??；4) ロ含制品制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體ロ含制品的制備方法，其特征是，所述步驟I)中的抗原是選用下述的至少ー種病毒和/或細(xì)菌的裂解液或減毒的活株，或純化的病毒或細(xì)菌相關(guān)蛋白，在免疫動(dòng)物之前與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合、乳化制得；所述的病毒或細(xì)菌包括:流感病毒，禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，鼻病毒，冠狀病毒，輪狀病毒，腺病毒，腸病毒，呼吸道合胞病毒或A組鏈球菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體ロ含制品的制備方法，其特征是，所述步驟4)中的ロ含制品制備過程中，抗體或摻合了抗體的原料、半成品、成品采用65°C以下低溫流程。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體ロ含制品的制備方法，其特征是，所述步驟4)的エ藝流程包括:①將ロ含制品基料破碎、干燥、過篩備用取部分過篩后的基料充分混勻，然后和純化水及已備好的抗體溶液調(diào)和單獨(dú)制粒、低溫干燥、破碎、過篩備用；③將剩余的分過篩后的基料與其它輔料及矯味劑充分混勻制空白粒，干燥、破碎、過篩備用；④將兩種顆粒充分混勻、加入助流劑、混合均勻后壓片，制成抗體ロ含片。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體ロ含制品的制備方法，其特征是，所述步驟4)的エ藝流程包括:①將膠基與糖漿在高溫溶化、混和加入糖粉及香料輔料，混和制得膠團(tuán)；③將膠團(tuán)溫度調(diào)降至在45-50°C，加入抗體活性成分、充分混；④壓延、切片成型，制成抗體ロ香糖。
【文檔編號(hào)】A61P31/12GK103520719SQ201310508746
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】鄒潮 申請人:哈德遜（天津）生物技術(shù)有限責(zé)任公司