表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒組及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒組及其制備與應(yīng)用。所述重組腺病毒組，是由表達(dá)豬唾液酸粘附素前四個IgV結(jié)構(gòu)域和與豬IgG?Fc片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達(dá)脫衣殼受體CD163第5-9個SRCR結(jié)構(gòu)域與豬IgG?Fc片段融合蛋白的重組腺病毒組成。該重組腺病毒組應(yīng)用于制備防治豬繁殖與呼吸綜合征制劑。與現(xiàn)有的疫苗相比，本發(fā)明制備的重組腺病毒為復(fù)制缺陷性病毒，不能在豬體內(nèi)擴散傳播，不存在散毒和毒力返強風(fēng)險，表達(dá)的兩種游離受體的協(xié)同作用能顯著抑制不同毒株P(guān)RRSV感染，可以作為防控PRRS的新型制劑進(jìn)行開發(fā)。
【專利說明】表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒組及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)與動物疫病防控領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒的制備方法與應(yīng)用 。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是豬的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙和各種年齡豬呼吸道癥狀為主要特征。該病首次于1987年在北美發(fā)生，1996年傳入我國，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)主要感染豬的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡和免疫抑制，并能引起持續(xù)性感染。另外，該病毒不僅毒株多、變異快，還利用多種機制逃逸宿主的先天性和獲得性免疫應(yīng)答，包括抑制干擾素應(yīng)答、干擾抗原提呈、抗體依賴的感染促進(jìn)作用、減少感染細(xì)胞表面病毒抗原表達(dá)和中和表位遮蔽。因此，現(xiàn)有疫苗的免疫保護(hù)效果欠佳(滅活苗)或有散毒、毒力返強風(fēng)險(弱毒苗)，新型疫苗研制又面臨巨大挑戰(zhàn)，迫切需要研究防控該病的新策略。
[0003]PRRSV利用受體依賴的胞吞機制進(jìn)入靶細(xì)胞，參與巨噬細(xì)胞感染的受體至少有三個，包括非特異吸附因子硫酸乙酰肝素、吸附與進(jìn)入受體唾液酸粘附素(Sn)和脫衣殼受體⑶163。其中，Sn前4個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Sn4D)參與病毒的吸附，⑶163的第5個清道夫受體半胱氨酸富含(SRCR)結(jié)構(gòu)域參與病毒的結(jié)合，但需要第6-9個SRCR結(jié)構(gòu)域存在才具有受體功能，這些病毒結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以作為游離受體阻斷病毒感染。
[0004]與容易變異的病毒蛋白不同，病毒受體是宿主細(xì)胞編碼的保守分子，因此可作為阻斷病毒感染的理想靶點，尤其是對容易變異的RNA病毒。其中，游離受體能與細(xì)胞受體競爭結(jié)合病毒，所以能中和或抑制病毒感染，并在抗麻疹病毒、禽白血病病毒和柯薩奇病毒等病毒中得以證實。據(jù)報道，由Sn4D和人IgG Fe片段組成的游離受體可部分抑制PRRSV感染，但人IgG Fe片段對豬有免疫原性，所用的游離受體從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取，因此豬體內(nèi)使用受到限制。更為重要的是，PRRSV至少使用兩個特異受體感染巨噬細(xì)胞，單個游離受體不足以阻斷該病毒感染。至于CD163游離受體及其對PRRSV感染的阻斷作用，目前尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明用重組腺病毒表達(dá)PRRSV游離受體Sn4D-Fc和SRCR59_Fc，經(jīng)融合蛋白處理病毒和重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞證明，兩個游離受體的共同作用能顯著抑制不同毒株P(guān)RRSV感染。該重組腺病毒可用較成熟的技術(shù)進(jìn)行批量制備，能在注射豬體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，但不能在豬體內(nèi)擴散傳播，因此可作為防治PRRSV的新型制劑進(jìn)行開發(fā)。
[0006]表達(dá)PRRSV游離受體的重組腺病毒組，是由表達(dá)Sn4D_Fc和SRCR59_Fc融合蛋白的重組腺病毒組成。即由表達(dá)豬唾液酸粘附素前4個IgV結(jié)構(gòu)域和與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達(dá)脫衣殼受體⑶163第5-9個SRCR結(jié)構(gòu)域與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒組成。
[0007]本發(fā)明還公開了上述表達(dá)PRRSV游離受體的重組腺病毒組在制備防治豬繁殖與呼吸綜合征制劑中的應(yīng)用。
[0008]其中，所述PRRSV游離受體的重組腺病毒組通過下述方法制備:
[0009]1.用化學(xué)合成法合成豬IgG重鏈信號肽序列，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增豬IgG Fe片段、唾液酸粘附素前4個IgV結(jié)構(gòu)域(Sn4D)和CD163第5_9個結(jié)構(gòu)域(SRCR59)編碼序列。
[0010]2.將Sn4D與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle_CMV，獲得重組載體pShuttle-Sn4D-Fc ;將豬IgG信號肽、SRCR59與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle-CMV,獲得重組載體 pShuttle-SRCR59_Fc。
[0011]3.用重組載體 pShuttle-Sn4D-Fc 和 pShuttle-SRCR59_Fc 轉(zhuǎn)染 AAV-293 細(xì)胞，獲得重組腺病毒 rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-SRCR59_Fc。
[0012]4.用AAV-293細(xì)胞擴增重組腺病毒。
[0013]與現(xiàn)有的PRRS疫苗相比，本發(fā)明制備的重組腺病毒為復(fù)制缺陷性病毒，不存在散毒或毒力返強等風(fēng)險，而且能在注射豬體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，表達(dá)的游離受體對不同毒株P(guān)RRSV感染具有穩(wěn)定的抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為重組腺病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖。ITR為腺病毒基因組左、右反向末端重復(fù)序列；PCMV為巨細(xì)胞病毒早期`啟動子；L為豬IgG重鏈信號肽序列；Fc為豬IgG Fe片段編碼序列；Sn4D為豬Sn前4個IgV結(jié)構(gòu)域編碼序列；SRCR5和SRCR59分別為豬CD163第5個和第5~9個SRCR結(jié)構(gòu)域編碼序列。
[0015]圖2為重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細(xì)胞中游離受體基因轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測。
[0016]圖3為重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)豬細(xì)胞中游離受體表達(dá)的免疫熒光檢測
[0017]圖4為親和純化游離受體的電泳分析
[0018]圖5為純化游離受體的免疫印跡檢測
[0019]圖6為純化游離受體與PRRSV結(jié)合的RT-PCR檢測。PRRSV為未結(jié)合病毒對照；SPA-Sn4D-Fc代表與Sn4D_Fc包被的葡萄球菌A蛋白(SPA)偶聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合；SPA-SRCR5-Fc代表與SRCR5_Fc包被的SPA偶聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合；SPA-SRCR59_Fc代表與SRCR59-Fc包被的SPA偶聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合；SPA_Fc代表與豬Fe片段包被的SPA偶聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合；SPA代表與無游離受體包被的SPA偶聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合。
[0020]圖7為游離受體中和PRRSV感染的劑量依賴關(guān)系流式細(xì)胞術(shù)檢測，縱坐標(biāo)表示病毒陽性細(xì)胞百分率；橫坐標(biāo)代表游離受體濃度；Sn4D-Fc+SRCR59-Fc為兩種游離受體的共同作用。
[0021]圖8為重組腺病毒表達(dá)的游離受體中和PRRSV感染的作用檢測，rAd-Fc為僅表達(dá)豬IgGFc片段的重組腺病毒對照；3D4/21-PAM和PK-15/PAM分別代表重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)3D4/21和PK-15細(xì)胞表達(dá)的游離受體向PAM細(xì)胞的傳遞。
[0022]圖9為重組腺病毒表達(dá)的游離受體中和PRRSV感染的劑量依賴關(guān)系，縱坐標(biāo)代表病毒滴度，橫坐標(biāo)代表病毒接種劑量。[0023]圖10為重組腺病毒表達(dá)的游離受體中和PRRSV感染的動態(tài)檢測，縱坐標(biāo)代表病毒滴度，橫坐標(biāo)表示感染后不同時間。
[0024]圖11為重組腺病毒表達(dá)的游離受體對不同毒株P(guān)RRSV感染的抑制作用，縱坐標(biāo)代表病毒滴度，橫坐標(biāo)表示不同毒株。
[0025]圖12本發(fā)明克隆的豬IgG Fe片段序列與發(fā)表序列(L0C396781)的比對分析。
[0026]圖13本發(fā)明克隆的豬Sn4D序列與發(fā)表序列(NM-214346)的比對分析。
[0027]圖14本發(fā)明克隆的豬SRCR5序列與發(fā)表序列的(NM-213976.5)比對分析。
[0028]圖15本發(fā)明克隆的豬SRCR59序列與發(fā)表序列(NM-213976.59)的比對分析。
【具體實施方式】
[0029]生物材料來源:
[0030]1.pShuttle-CMV載體:購自美國 Stratagene 公司。文獻(xiàn):He TC, Zhou S，da CostaLT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2509-2514.[0031]2.BJ-5183-AD-1 株大腸桿菌:購自美國 Stratagene 公司。文獻(xiàn):He TC, Zhou S，daCosta LT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2509-2514.[0032]3.AAV-293細(xì)胞:從中國科學(xué)院細(xì)胞庫引進(jìn)。文獻(xiàn):Xie Qff, Leung M, FuortesM，Sassa S，Nathan C.Co mplementation analysis of mutants of nitric oxide synthasereveals that the active site requires two hemes.Proc Natl Acad Sci USA.1996,93(10):4891-4896.[0033]4.pMD18-T載體:購自寶生物工程(大連)有限公司(Takara Code:6011)。
[0034]5.PRRSV參考株VR2332:購自美國ATCC (ATCC VR2332)，本實驗室保存。文獻(xiàn):Col Iins.TE，Benfield DA, Christianson WT, Harris L, Hennings JC, ShawDP，Goya，SM，McCullough S，Morrison RB，.Too HS.1solation of swine infertilityand respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332)in North America andexperimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs.J Vet DiagnInvest,1992，4:117-126 ；
[0035]6.PRRSV疫苗株CH-1R和強毒株JXAl:由國藥集團(tuán)揚州威克生物工程有限公司提供。文獻(xiàn):Hu SPj Zhang Zj Cai XHj Tian ZJj An TQj Wu DL.Valuation of protectiveefficacy of PRRS attenuated vaccine and inactivated mutant PRRSV strains.Chinese J Prev Vet Med,2009, 31:392-396 ；Tian K，Yu X，Zhao T，F(xiàn)eng Y，Cao Zj WangC，Hu Y，Chen X，Hu D，Tain X.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleledoutbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the uniquehallmark.PLoS One, 2007.2 (6):e526.[0036]7.MARC-145細(xì)胞:從美國ATCC引進(jìn)(ATCC CRL-12231 )，江蘇揚州優(yōu)邦生物制藥有
限公司保存。
[0037]8.PK-15細(xì)胞:從從美國ATCC引進(jìn)(ATCC CCL-33)，本實驗室保存。
[0038]9.6周齡健康豬:由江蘇省畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院種豬場提供。
[0039]具體操作步驟如下:
[0040]1.重組腺病毒構(gòu)建:具體操作步驟如下:[0041](I)豬IgGl重鏈信號肽序列(GenBank Accession:L0C396781)合成:由南京金瑞思生物科技有限公司合成。[0042](2)豬IgGlFc片段編碼序列克隆:根據(jù)豬IgGlFc片段編碼序列(GenBankAccession:L0C396781)設(shè)計下列 I 對引物:
[0043]正向引物:5-GGAACAAAGACCAAACCACC-3(SEQID N0.1)；
[0044]反向引物:5-TCATTTACCCTGAGTCTTGGA-3(SEQID N0.2)。
[0045]按照RNAiso Kit [自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬外周血淋巴細(xì)胞提取 RNA,按照 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (美國 Fermentas 公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照LA Taq DNA聚合酶[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進(jìn)行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示:克隆的豬IgGlFc片段編碼序列與發(fā)表序列的同源性為92.6%，無插入或缺失突變(圖12)。
[0046](3) Sn4D編碼序列克隆:根據(jù)豬Sn4個N端IgV結(jié)構(gòu)域序列(GenBankAccess ion:NM_214346)合成下列 I 對引物:
[0047]正向引物:5-ATGGACTTCCTGCTCCTGCT-3(SEQID N0.3)；
[0048]反向引物:5-GCTGACCACCACGCTGACA-3(SEQ ID N0.4)。
[0049]按照RNAiso Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬肺巨噬細(xì)胞提取RNA,按照 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (美國 Fermentas 公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照LA Taq DNA聚合酶[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進(jìn)行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆入PMD18-T載體進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示:克隆的Sn4D編碼序列與發(fā)表序列的同源性為99.3%，無插入或缺失突變(圖13)。
[0050](3) SRCR5編碼序列克隆:根據(jù)豬CD163第5個SRCR結(jié)構(gòu)域序列(GenBankAccession:NM_213976)合成下列 I 對引物:
[0051]正向引物:5-GTTGGAGGGGACATTCCC-3(SEQID N0.5)；
[0052]反向引物:5-GACTACGCCGACGTCCCT-3(SEQ ID N0.6)。
[0053]按照RNAiso Kit [自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬肺巨噬細(xì)胞提取RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進(jìn)行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆入pMDlS-Τ載體進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示克隆的序列與發(fā)表序列一致(圖14)。
[0054](4) SRCR59編碼序列克隆:根據(jù)豬CD163第5個SRCR結(jié)構(gòu)域序列(GenBankAccession:NM_213976)合成下列 I 對引物:
[0055]正向引物:5-GTTGGAGGGGACATTCCC-3(SEQID N0.7)；
[0056]反向引物:5-TGAGCACGTCACAGCAGC-3(SEQ ID N0.8)。
[0057]按照RNAiso Kit [自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬肺巨噬細(xì)胞提取RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進(jìn)行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆入pMDlS-Τ載體進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示克隆的序列與發(fā)表序列一致(圖15)。
[0058](5)對照載體pShuttle-Fc的構(gòu)建:將合成的豬IgGl重鏈信號肽序列克隆入腺病毒載體pShuttIe-CMV (美國Stratagene公司)的KpnI和XhoI酶切位點之間,將克隆的豬Fe編碼序列克隆在HindIII和EcoRV酶切位點之間，經(jīng)限制酶消化法鑒定重組載體(圖1)構(gòu)建正確。
[0059](6)重組載體pShuttle-Sn4D_Fc的構(gòu)建:將克隆的Sn4D編碼序列克隆入腺病毒載體pShuttIe-CMV (美國Stratagene公司)的KpnI和XhoI酶切位點之間,將克隆的豬Fe編碼序列克隆在HindIII和EcoRV酶切位點之間，經(jīng)限制酶消化法鑒定重組載體(圖1)構(gòu)
建正確。
[0060](7)重組載體pShutt I e-SRCR5_Fc的構(gòu)建:將克隆的SRCR5編碼序列插在pShuttle-Fc中豬IgG重鏈信號肽與Fe序列之間，經(jīng)限制酶消化法鑒定重組載體(圖1)構(gòu)建正確。
[0061 ] (8 )重組載體pShutt I e-SRCR59_Fc的構(gòu)建:將克隆的SRCR59編碼序列插在pShuttle-Fc中豬IgG重鏈信號肽與Fe序列之間，經(jīng)限制酶消化法鑒定重組載體(圖1)構(gòu)建正確。
[0062](9)重組病毒產(chǎn)生:參考 AdEasy? Adenoviral Vector System (美國 Stratagene公司)說明書進(jìn)行(文獻(xiàn):He TC, Zhou S，da Costa LT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc NatlAcad SciUSA，1998,95(5):2509-2514.He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J1Kinzler Kff.etal.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95 (5): 2509-2514)。用限制酶 PacI 消化法將重組質(zhì)粒pShuttle-Sn4D_Fc, pShuttle-SRCR5_Fc, pShuttle_SRCR59_Fc、pShuttle-Fc 線性化，電轉(zhuǎn)化BJ-5183-AD-1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素抗性初步篩選同源重組質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳法初步篩選大于20Kb的重組質(zhì)粒，利用限制酶PacI消化和瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)陽性重組質(zhì)粒。用常規(guī)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒[康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司]提取質(zhì)粒DNA。在25cm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)AAV-293細(xì)胞至密度為80%。用限制酶PacI消化法將上述重組質(zhì)粒線性化，將3 μ g質(zhì)粒 DNA 與 15 μ L Lipofectmine (Life Technologies?)混合,按照試劑說明書轉(zhuǎn)染 AAV-293細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。培養(yǎng)10-14天觀察細(xì)胞縮小、變圓，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，收獲的重組腺病毒 rAd-Sn4D-Fc、`rAd-SRCR5_Fc、rAd-SRCR59_Fc 和 rAd-Fc 用 AAV-293 細(xì)胞擴增，按照 ViraBind? Adenovirus Miniprep Kit (美國 CELL B10LABS 公司)說明書進(jìn)行重組腺病毒純化，參考Luo等方法測定病毒滴度(文獻(xiàn):Jinyong Luo, Zhong-Liang Deng, XiaojiLuo,et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using theAdEasy system.Nature protocols, 2007, 2 (5):1236-1247.[0063]2.游離受體基因的轉(zhuǎn)錄檢測
[0064]在25cm2細(xì)胞瓶培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，次日分別用重組腺病毒rAd-SRCR5_Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-Fc (感染指數(shù)=1)，培養(yǎng) 24 小時后，用 RNAiso Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]提取細(xì)胞總RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進(jìn)行RT-PCR擴增，結(jié)果顯示在rAd-SRCR5-Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D_Fc和rAd-Fc感染細(xì)胞中分別能擴增出預(yù)期大小的SRCR5_Fc、SRCR59-Fc、Sn4D-Fc 和 Fe 轉(zhuǎn)錄子(圖 2)。
[0065]3.游離受體表達(dá)免疫熒光檢測
[0066]在24孔板培養(yǎng)PK-15、3D4/21和豬肺巨噬細(xì)胞(PAM)，次日分別用重組腺病毒 rAd-SRCR5、rAd_SRCR59、rAd-Sn4D_Fc 和 rAd-Fc (感染指數(shù)=1)，培養(yǎng) 24 小時后，用IRDye800CW標(biāo)記山羊抗豬IgG (美國Rockland公司)進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示重組腺病毒感染PK-15和3D4/21細(xì)胞為熒光強陽性，PAM細(xì)胞為弱陽性(圖3)。
[0067]4.游離受體的純化
[0068]在75cm2細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)PK-15細(xì)胞至密度約80%，次日分別用重組腺病毒rAd-SRCR5-Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-Fc 轉(zhuǎn)導(dǎo)(感染指數(shù)=1)，培養(yǎng) 48 小時后收集細(xì)胞上清，500g離心10分鐘后小心吸取上清，按照Protein A Sefinose? (上海生工生物有限公司)說明書進(jìn)行Fe融合蛋白純化，各取10 μ L進(jìn)行SDS-PAGE (12%分離膠)分離。結(jié)果顯示:在四種重組腺病毒感染細(xì)胞中，能純化到預(yù)期分子量的豬IgG Fe片段(SEQID N0.9)及 Sn4D-Fc (SEQ ID N0.10)、SRCR5_Fc (SEQ ID N0.11)和 SRCR59_Fc (SEQ IDN0.12)融合蛋白(圖4)。
[0069]5.游離受體免疫鑒定
[0070]各取上述純化蛋白10 μ L進(jìn)行SDS-PAGE分離，按照IRDye800CW標(biāo)記山羊抗豬IgG(美國Rockland公司)說明書進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印。結(jié)果顯示:純化的融合蛋白Sn4D_Fc，SRCR5_Fc和SRCR59-Fc以及豬IgG Fe片段均能與豬IgG反應(yīng)(圖5)。
[0071]6.游離受體的病毒結(jié)合試驗
[0072]純化游離受體與PRRSV結(jié)合試驗參考報道的方法進(jìn)行(文獻(xiàn):Van BreedamWj Delputte PL,Van Gorp H，Misinzo G,Vanderheiiden N，Duan X，Nauwynck HJ.Porcinereproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage.1Gen Virol，2010，91 (Pt7):1659_1667)。取 50%Protein A Sefinose Bead Slurry (上海生物工程有限公司)100 μ L，分別與PBS或25 μ g具體實施方案4純化的pFc、Sn4D_Fc、SRCR5-Fc、SRCR59-Fc 混合，然后加入 VR2332 株 PRRSV，37°C孵育 90min，用 PBS 離心洗去未結(jié)合病毒，用試劑盒中的洗脫 液洗脫結(jié)合病毒，用RNAiso Plus Kit抽提病毒RNA，按照RevertAid? Reverse Transcriptase說明書反轉(zhuǎn)錄后，以下列PRRSV VP5特異引物進(jìn)行PCR擴增。
[0073]正向引物:5-TTGAATGTTCAAGTATG_3(SEQID N0.13),
[0074]反向引物:5-ATCATTGCAGAAGTCGT-3(SEQID N0.14)。
[0075]結(jié)果顯示:游離受體Sn4D-Fc和SRCR59_Fc能與PRRSV結(jié)合，而SRCR5_Fc和豬Fe不能與PRRSV結(jié)合(圖6)。
[0076]7.游離受體的中和病毒作用檢測
[0077]在24孔板培養(yǎng)PAM細(xì)胞(IO6細(xì)胞/孔)，次日用PRRSV感染。先將PRRSV(感染指數(shù)=1)與 O、25、50、100 μ g/mL 純化豬 pFc、Sn4D_Fc、SRCR59_Fc 或 Sn4D-Fc+SRCR59_Fc 混合，37°C孵育I小時，然后接種PAM細(xì)胞培養(yǎng)。感染24h，用胰酶消化分散細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液室溫固定30min，各取IO5細(xì)胞，以PRRSV N蛋白單克隆抗體(美國Rural Technologies公司)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果與豬Fe處理組相比:Sn4D-Fc、SRCR59_Fc單獨處理組的PRRSV陽性細(xì)胞數(shù)均下降55%，兩者共同處理組(Sn4D-Fc+SRCR59-Fc)的病毒陽性細(xì)胞數(shù)平均下降78%)，兩種游離受體對PRRSV感染具有協(xié)同抑制作用，且具有劑量依賴關(guān)系(圖7)。
[0078]8.重組腺病毒及其組合細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗病毒作用檢測
[0079]將3D4/21或PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于24孔雙層培養(yǎng)板(CORNING公司)的上層作為供體細(xì)胞，PAM細(xì)胞培養(yǎng)于下層作為接受細(xì)胞。供體細(xì)胞用rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)或用rAd-Sn4D-Fc與rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)(轉(zhuǎn)導(dǎo)指數(shù)=1)，設(shè)rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)對照組，洗去未結(jié)合重組病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后用VR2332株P(guān)RRSV感染PAM細(xì)胞(感染指數(shù)=0.5),感染后24h收獲病毒,按報道的方法在MARC-145細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴定(文獻(xiàn):Jacobs AC, Hermann JR, Munoz-Zanzi C，Prickett JR, Roof MB, Yoon KJ.Stability ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus at ambient temperatures.JVet Diagn Invest, 2010, 22:257_260)。結(jié)果與 rAd-Fc 轉(zhuǎn)導(dǎo) 3D4/21 細(xì)胞共培養(yǎng)組的 PRRSV滴度(5.61og TCID5tl)相比，與rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)的PAM細(xì)胞的PRRSV滴度分別下降1.0和1.1log,與兩種重組腺病毒同時轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)的PRRSV滴度下降3.51og (圖8);與rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)組的PRRSV滴度(5.51og)相比，與rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59_Fc單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)的PAM細(xì)胞的PRRSV滴度分別下降
1.1log,與兩種重組腺病毒同時轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)的PRRSV滴度下降3.81og (圖8)。
[0080]9.重組腺病毒表達(dá)的游離受體協(xié)同中和PRRSV感染的劑量關(guān)系檢測
[0081]將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于24孔雙層培養(yǎng)板上層，PAM細(xì)胞培養(yǎng)于下層。供體細(xì)胞用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)(轉(zhuǎn)導(dǎo)指數(shù)=1)，設(shè)rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)對照組，洗去未結(jié)合重組病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，用不同劑量VR2332株P(guān)RRSV感染PAM細(xì)胞，感染后24h收獲病毒，按上述方法進(jìn)行病毒滴定。結(jié)果與rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)組的PRRSV滴度相比，4個PRRSV接種劑量的PAM細(xì)胞與rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)后，PRRSV滴度下降3.9~5.21og,兩者表達(dá)的游離受體對PRRSV感染的協(xié)同中和作用具有劑量依賴關(guān)系(圖9)。
[0082]10.重組腺病毒表達(dá)的游離受體協(xié)同中和PRRSV感染的動態(tài)檢測
[0083]將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于24孔雙層培養(yǎng)板上層，PAM細(xì)胞培養(yǎng)于下層，供體細(xì)胞用rAd-Sn4D-Fc與rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)(轉(zhuǎn)導(dǎo)指數(shù)=1)，設(shè)rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)對照組，洗去未結(jié)合重組病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，用VR2332株P(guān)RRSV感染PAM細(xì)胞，感染后不同時間收獲病毒，按上述方法進(jìn)行病毒滴定。結(jié)果與rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)組的PRRSV滴度相比，與rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)不同時間后，PAM細(xì)胞的PRRSV滴度下降3.8~4.61og，兩種重組腺病毒表達(dá)的游離受體對PRRSV感染的協(xié)同中和作用至少維持60h (圖 10)。
[0084]11.重組腺病毒表達(dá)的游離受體協(xié)同中和不同毒株P(guān)RRSV感染的檢測
[0085]將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于24孔雙層培養(yǎng)板上層，PAM細(xì)胞培養(yǎng)于下層，供體細(xì)胞用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)(轉(zhuǎn)導(dǎo)指數(shù)=1)，設(shè)rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)對照組，洗去未結(jié)合重組病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，PAM細(xì)胞分別用JXA1、CH-1R、VR2332株P(guān)RRSV感染，感染后24h收獲病毒，按上述方法進(jìn)行病毒滴定。結(jié)果與rAd-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)組的PRRSV滴度相比，接種3株病毒的PAM細(xì)胞與rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)后，PRRSV滴度分別下降4.1,4.3和4.21og (圖11)。
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒組，是由表達(dá)豬唾液酸粘附素前4個IgV結(jié)構(gòu)域和與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達(dá)脫衣殼受體⑶163第5_9個SRCR結(jié)構(gòu)域與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒組成。
2.權(quán)利要求1所述重組腺病毒組在制備防治豬繁殖與呼吸綜合征制劑中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒組的制備方法，其步驟如下: (O用化學(xué)合成法合成豬IgG重鏈信號肽序列，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增豬IgGFe片段、唾液酸粘附素前4個IgV結(jié)構(gòu)域Sn4D和⑶163第5_9個結(jié)構(gòu)域SRCR59編碼序列。 (2)將Sn4D與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle_CMV，獲得重組載體pShuttle-Sn4D-Fc ;將豬IgG信號肽、SRCR59與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle-CMV,獲得重組載體 pShuttle-SRCR59_Fc.(3)用步驟(2)獲得的兩種重組載體轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，獲得重組腺病毒rAd-Sn4D_Fc和 rAd-SRCR59-Fc0 (4)用AAV-293細(xì)胞擴增重組腺病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)是:將豬IgGFe片段編碼序列分別與Sn4D、SRCR59編碼序列融合，用Sn自身信號肽引導(dǎo)Sn4D_Fc融合蛋白分泌性表達(dá)，以豬IgG重鏈信號肽引導(dǎo) SRCR59-FC融合蛋白分泌性表達(dá)。
【文檔編號】A61K31/14GK103525775SQ201310485894
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】孫懷昌, 陳陽, 郭睿, 張鑫宇, 夏曉莉 申請人:揚州大學(xué)