miR-329在制備預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的藥物中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及miR-329在制備預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
缺血可引起多種代謝物質(zhì)的缺乏，但最為緊急、損害最重的病變是由缺氧所致。在絕大多數(shù)情況下，缺血性病變的核心為缺氧性損害。大量研究報道，視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜缺血、缺氧是缺血性眼部疾病的重要驅(qū)動因素，是導(dǎo)致視力下降和喪失的重要原因(1,2)。常見的該類眼部疾病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathyofprematurity,ROP）、年齡相關(guān)性黃斑病變（age-relatedmaculardegeneration,AMD）、糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabeticretinopathy,DR）、新生血管性青光眼（neovascularglaucoma,NVG）等。上述疾病在全球發(fā)病率呈上升趨勢，是兒童、成年人和老年人各年齡段致盲的首要原因(3-6)。氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型（OIR小鼠）是經(jīng)典的缺血性眼部疾病的動物模型。OIR小鼠模型誘導(dǎo)過程中，小鼠眼睛組織內(nèi)的缺血缺氧引起VEGF和TNF-α等促血管生成因子的過度分泌，進(jìn)而導(dǎo)致眼底血管異常成簇狀生長，血管迂曲、擴(kuò)張和滲漏。這些缺血性眼部病變會導(dǎo)致眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀。（2，7）1.DorrellM,Uusitalo-JarvinenH,AguilarE,FriedlanderM.2007.Ocularneovascularization:basicmechanismsandtherapeuticadvances.SurvOphthalmol52Suppl1:S3-19.2.SapiehaP,JoyalJS,RiveraJC,Kermorvant-DucheminE,SennlaubF,HardyP,LachapelleP,ChemtobS.2010.Retinopathyofprematurity:understandingischemicretinalvasculopathiesatanextremeoflife.JClinInvest120:3022-3032.3.GilbertC.2008.Retinopathyofprematurity:aglobalperspectiveoftheepidemics,populationofbabiesatriskandimplicationsforcontrol.EarlyHumDev84:77-82.4.XuJ,WeiWB,YuanMX,YuanSY,WanG,ZhengYY,LiYB,WangS,XuL,FuHJ,ZhuLX,PuXL,ZhangJD,DuXP,LiYL,JiY,GuXN,LiY,PanSF,CuiXL,BaiW,ChenYJ,WangZM,ZhuQS,GaoY,LiudeY,JiYT,YangZ,JonasJB.2012.Prevalenceandriskfactorsfordiabeticretinopathy:theBeijingCommunitiesDiabetesStudy6.Retina32:322-329.5.CheungCM,TaiES,KawasakiR,TayWT,LeeJL,HamzahH,WongTY.2012.Prevalenceofandriskfactorsforage-relatedmaculardegenerationinamultiethnicAsiancohort.ArchOphthalmol130:480-486.6.OlmosLC,LeeRK.2011.Medicalandsurgicaltreatmentofneovascularglaucoma.IntOphthalmolClin51:27-36.7.GrossniklausHE,KangSJ,BerglinL.2010.Animalmodelsofchoroidalandretinalneovascularization.ProgRetinEyeRes29:500-519.

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供miR-329的一種新用途。本發(fā)明所提供的miR-329的新用途之一為miR-329或miR-329修飾物在制備預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的藥物中的應(yīng)用；所述miR-329的序列為SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示。上述應(yīng)用中，所述缺血性眼部疾病可為早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑病變或新生血管性青光眼。上述應(yīng)用中，所述缺血性眼部疾病可為缺血性眼底病變。上述應(yīng)用中，所述缺血性眼底病變可為視網(wǎng)膜病變或脈絡(luò)膜病變。上述應(yīng)用中，所述視網(wǎng)膜病變可為視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張或視網(wǎng)膜血管滲漏或視網(wǎng)膜出血。上述應(yīng)用中，所述視網(wǎng)膜病變可為視網(wǎng)膜血管新生或視網(wǎng)膜血管從視網(wǎng)膜遷移到玻璃體腔。上述應(yīng)用中，所述脈絡(luò)膜病變可為脈絡(luò)膜血管迂曲擴(kuò)張或脈絡(luò)膜血管滲漏或脈絡(luò)膜出血。上述應(yīng)用中，所述脈絡(luò)膜病變?yōu)槊}絡(luò)膜血管新生。本發(fā)明所提供的miR-329的新用途之二為miR-329或miR-329修飾物在制備抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生成血管或抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的藥物中的應(yīng)用；所述miR-329的序列為SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示。上述任一所述應(yīng)用中，miR-329修飾物為將miR-329進(jìn)行如下修飾中的至少一種：硫代磷酸骨架修飾；甲基化或氟代核糖修飾；膽固醇、聚乙二醇或短肽末端修飾。本發(fā)明首次提出miR-329是預(yù)防或/和治療缺血性眼部疾病的新型藥物。因此，本發(fā)明提供miR-329或miR-329修飾物在制備預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的藥物中的應(yīng)用。實驗證明，miR-329基因治療顯著減輕了缺血性眼部疾病的嚴(yán)重程度，表現(xiàn)為有效緩解了發(fā)病小鼠視網(wǎng)膜的血管迂曲擴(kuò)張、出血滲漏以及血管簇狀異常生長等癥狀；顯著減少了視網(wǎng)膜新生血管數(shù)量以及從視網(wǎng)膜遷移到玻璃體腔的異常血管數(shù)量。這種視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與形態(tài)的正常化，可以緩解眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀，并抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。miR-329治療缺血性眼部疾病的作用機(jī)理在于miR-329可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞中促血管生成因子VEGF誘導(dǎo)的下游信號通路SKF、p38MAPKs和NF-κB的激活以及多種促血管生成基因的表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成及遷移能力，從而改善了缺血性眼部疾病的異常血管新生及遷移。這些結(jié)果表明miR-329可以作為預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的新的手段。附圖說明圖1為正常小鼠和OIR小鼠的視網(wǎng)膜表型，顯示OIR小鼠模型構(gòu)建成功。圖2為miR-329治療后OIR小鼠視網(wǎng)膜血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)正?；D3為miR-329治療后顯著減輕OIR小鼠視網(wǎng)膜異常血管新生和血管遷移。圖4為miR-329抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的下游信號通路的激活。圖5為miR-329抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活。圖6為miR-329抑制內(nèi)皮細(xì)胞中多種促血管生成效應(yīng)基因的表達(dá)。圖7為miR-329抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成及細(xì)胞遷移能力。圖8為miR-329抑制小鼠異種移植物中內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實驗中使用的視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗按照如下方法進(jìn)行：（一）將小鼠麻醉，左心室心臟灌流600μl50mg/ml的FITC熒光標(biāo)記的dextran，此時小鼠的全身血管都灌注有熒光分子。（二）將小鼠眼睛剝離，4%多聚甲醛固定1小時。（三）小心剝離視網(wǎng)膜，并用剪刀剪成四葉草狀。用熒光體式顯微鏡觀察并拍照。下述實驗中使用的組織免疫熒光實驗按照如下方法進(jìn)行：（一）剝離小鼠的眼球進(jìn)行石蠟包埋切片。（二）取出切片，放入二甲苯溶液脫蠟三次，每次5分鐘。（三）放入100%-95%-80%-70%-50%乙醇和蒸餾水中水化。（四）將樣品放入0.01MpH6.0的檸檬酸緩沖液中，100℃沸水浴30分鐘進(jìn)行抗（五）5%羊血清封閉1小時。（六）加入一抗（5%羊血清稀釋的CD31腹水，體積比為1:50）37℃孵育過夜，PBS洗3次。（七）加入熒光標(biāo)記的二抗，37℃孵育1小時，PBS洗3次。（八）DAPI染核，并用抗熒光淬滅封片劑封片。Matrigel（不含生長因子）購自BDBiosciences。實施例1、miR-329能夠有效治療缺血性眼部疾病小鼠miR-329序列：5’-AACACACCCAGCUAACCUUUUU-3’（SEQIDNo.1）；對照miRNA為線蟲miR-239b，與人、小鼠、大鼠的miRNA具有最小同源性。對照miRNA序列：5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’（SEQIDNo.2）；以下實驗均使用雙鏈的小鼠miR-329和對照miRNA，并分別對其序列進(jìn)行如下修飾：2’-甲氧基修飾，硫代磷酸骨架修飾和序列5’端連接膽固醇。上述修飾過的小鼠miR-329序列和修飾過的對照miRNA序列均購自廣州銳博生物公司。一、構(gòu)建OIR小鼠模型將出生后第7天的C57BL/6J乳鼠（P7）和母鼠放入含75%氧氣的高氧培養(yǎng)箱中5天，在第12天（P12）將其從氧箱中取出，放在正常氧氣（21%氧氣）中飼養(yǎng)，造成相對低氧的環(huán)境，在第17天（P17）的乳鼠即為模型鼠。將正常鼠（正常C57BL/6J小鼠）和OIR模型鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，與正常鼠相比，OIR小鼠的視網(wǎng)膜血管呈現(xiàn)明顯的迂曲、擴(kuò)張和滲漏并成血管簇狀異常生長。視網(wǎng)膜血管的熒光滲漏點(diǎn)表示視網(wǎng)膜出血嚴(yán)重。以上視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常說明模型構(gòu)建成功。二、構(gòu)建OIR小鼠治療模型將出生后第7天的C57BL/6J乳鼠（P7）和母鼠放入含75%氧氣的高氧培養(yǎng)箱中5天，在第12天（P12）將其從氧箱中取出，將修飾過的鼠miR-329（5μg/μl,1μl）、修飾過的鼠對照miRNA（5μg/μl,1μl）或0.9%NaCl的水溶液（1μl）分別注射到乳鼠眼睛玻璃體腔內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)。三、視網(wǎng)膜熒光鋪片分析在第17天對各組OIR小鼠及正常C57BL/6J小鼠（每組8只）的視網(wǎng)膜進(jìn)行熒光鋪片分析。對異常新生血管，即迂曲、擴(kuò)張的血管及血管滲漏點(diǎn)，進(jìn)行面積的統(tǒng)計分析，以正常小鼠為對照，最終判定疾病的治療情況。結(jié)果如圖2所示。圖2中：NV為新生血管。結(jié)果表明，與對照miRNA組相比，miR-329注射組小鼠的視網(wǎng)膜血管迂曲、視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張、視網(wǎng)膜血管出血滲漏以及血管簇狀異常生長的癥狀顯著減輕，呈現(xiàn)較好的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，并且miR-329注射后視網(wǎng)膜血管新生的面積顯著減少。這種視網(wǎng)膜形態(tài)的正常化，可以緩解眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀，減輕疾病的發(fā)病程度。四、組織免疫熒光分析在第17天剝離各組OIR小鼠及正常C57BL/6J小鼠（每組9-14只）的眼球分別進(jìn)行石蠟包埋切片，進(jìn)行組織免疫熒光分析。結(jié)果如圖3所示。圖3中：GCL為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；VC為玻璃體腔；INL為視網(wǎng)膜內(nèi)核層；綠色標(biāo)記物為血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31。結(jié)果表明，正常小鼠中，只有極少數(shù)血管從視網(wǎng)膜遷移到玻璃體腔。與正常小鼠相比，OIR小鼠中視網(wǎng)膜新生血管數(shù)量以及從視網(wǎng)膜異常遷移到玻璃體腔的血管數(shù)量明顯增多。并且與對照miRNA組相比，miR-329注射組小鼠視網(wǎng)膜血管數(shù)量以及從視網(wǎng)膜遷移到玻璃體腔的血管數(shù)量明顯減少。從熒光圖片可以看出注射miR-329會改善拉長的不規(guī)則呈簇狀生長的異常血管形態(tài)（箭頭所示）。綜合以上結(jié)果，表明miR-329能夠有效減輕缺血性眼部疾病的發(fā)病程度，可以作為該疾病有效的治療手段。以下實施例2-4中使用的miR-329為人miR-329的雙鏈模擬物，人對照miRNA為無義序列。上述人miR-329序列和人對照miRNA序列均購自上海吉瑪公司。人miR-329序列：5’-AACACACCUGGUUAACCUCUUU-3’（SEQIDNo.3）人對照miRNA序列：5’–UUCUCCGAACGUGUCACGUTT–3’（SEQIDNo.4）以下實施例2-4中使用的內(nèi)皮細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC。實施例2、miR-329抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的下游信號通路的激活。缺血性眼部疾病發(fā)生發(fā)展過程中，眼睛組織內(nèi)的缺血缺氧引起VEGF和TNF-α等促血管生成因子的過度分泌，進(jìn)而導(dǎo)致眼底血管異常成簇狀生長，血管迂曲、擴(kuò)張和滲漏。因此，我們關(guān)注miR-329能否抑制促血管生成因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞引起的信號通路的激活。一、VEGF刺激HUVEC條件下，miR-329抑制VEGF下游信號通路的激活（一）實驗分為下列3組（1）轉(zhuǎn)染對照miRNA并且不刺激HUVEC；（2）轉(zhuǎn)染對照miRNA并用促血管生成因子VEGF刺激HUVEC；（3）轉(zhuǎn)染miR-329并用VEGF刺激HUVEC。（二）將上述的各組對照miRNA或miR-329分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。（三）轉(zhuǎn)染后24小時，刺激細(xì)胞：先將各組的HUVEC細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，饑餓12小時。內(nèi)皮細(xì)胞生長密度達(dá)80%左右時，第（2）和（3）組加入終濃度為50ng/ml的細(xì)胞因子VEGF刺激。（四）在VEGF刺激下，繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘，檢測SKF或p38MAPKs信號通路中的蛋白磷酸化水平。或在VEGF刺激下，繼續(xù)培養(yǎng)12小時，檢測NF-κB信號通路中的蛋白磷酸化水平。（五）在上述時間點(diǎn)收集各組細(xì)胞，進(jìn)行westernblot。實驗結(jié)果如圖4所示。圖4A為VEGF下游SKF信號通路中的蛋白磷酸化水平。圖4B為VEGF下游p38MAPKs信號通路中的蛋白磷酸化水平。圖4C為VEGF下游的NF-κB信號通路中的蛋白磷酸化水平。圖4表明，對照miRNA轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，并用VEGF刺激之后，VEGF下游SKF，p38和NF-κBp65的磷酸化水平升高，IκBα發(fā)生降解。而miR-329的過表達(dá)可以抑制VEGF下游SKF，p38和NF-κBp65的磷酸化以及IκBα的降解。二、VEGF和TNF-α聯(lián)合刺激HUVEC的條件下，miR-329抑制下游NF-κB通路的激活在體內(nèi)病理性血管生成中，VEGF和TNF-α通常是過度分泌并且在微環(huán)境中同時存在的。本實驗為了更好的模擬體內(nèi)的病理環(huán)境，在VEGF和TNF-α聯(lián)合刺激下研究miR-329是否可以抑制NF-κB通路的激活。（一）實驗分為下列3組（1）轉(zhuǎn)染對照miRNA并且不刺激HUVEC；（2）轉(zhuǎn)染對照miRNA并用細(xì)胞因子刺激HUVEC；（3）轉(zhuǎn)染miR-329并用細(xì)胞因子刺激HUVEC。（二）將上述的各組對照miRNA或miR-329分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。（三）轉(zhuǎn)染24小時后，刺激細(xì)胞：先將各組的HUVEC細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，饑餓12小時。內(nèi)皮細(xì)胞生長密度達(dá)80%左右時，第（2）和（3）組加入終濃度為50ng/ml的細(xì)胞因子VEGF和TNF-α共同刺激。（四）在VEGF和TNF-α共同刺激下，繼續(xù)培養(yǎng)12小時，檢測NF-κB信號通路中的蛋白磷酸化水平。（五）收集各組細(xì)胞，進(jìn)行westernblot。結(jié)果如圖5所示。圖5和圖4C相比較表明，以VEGF和TNF-α聯(lián)合刺激HUVEC細(xì)胞，NF-κB通路的激活比單獨(dú)刺激更為顯著，并且miR-329同樣可以顯著抑制聯(lián)合刺激下的NF-κBp65的磷酸化以及IκBα的降解，即抑制NF-κB通路的激活。三、VEGF和TNF-α共同刺激HUVEC的條件下，miR-329抑制促血管生成效應(yīng)基因mRNA的表達(dá)。（一）實驗分為下列3組（1）轉(zhuǎn)染對照miRNA并且不刺激HUVEC；（2）轉(zhuǎn)染對照miRNA并用細(xì)胞因子刺激HUVEC；（3）轉(zhuǎn)染miR-329并用細(xì)胞因子刺激HUVEC。（二）將上述的各組對照miRNA或miR-329分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。（三）轉(zhuǎn)染8小時后，刺激細(xì)胞：先將各組的HUVEC細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，饑餓12小時。內(nèi)皮細(xì)胞生長密度達(dá)80%左右時，第（2）和（3）組加入終濃度為50ng/ml的細(xì)胞因子VEGF和TNF-α共同刺激。（四）在VEGF和TNF-α共同刺激下，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，（五）實時熒光定量PCR檢測miR-329對促血管生成效應(yīng)基因mRNA表達(dá)水平的影響，以GAPDH為內(nèi)參，每組實驗中未刺激組細(xì)胞的RNA相對表達(dá)量設(shè)為1。所檢測的基因及相對應(yīng)的引物如下：PCR擴(kuò)增條件：95℃，5分鐘；95℃30s，55℃30s，72℃20s，40個循環(huán)。結(jié)果如圖6所示。圖6表明，miR-329可以抑制所檢測基因的RNA表達(dá)量，證實miR-329可以抑制多種促血管生成基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明，miR-329能夠顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中促血管生成因子VEGF及VEGF與TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)的下游信號通路的激活，進(jìn)而抑制多種促血管生成因子的表達(dá)，提示miR-329治療在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的重要作用。實施例3、miR-329抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成及細(xì)胞遷移能力缺血性眼部疾病發(fā)生發(fā)展過程中，眼睛組織內(nèi)的缺血缺氧將會導(dǎo)致眼底血管異常成簇狀生長，血管迂曲、擴(kuò)張和滲漏。而這些眼底的異常血管新生是導(dǎo)致眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀的重要原因。因此，我們關(guān)注miR-329能否抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。一、血管生成實驗（一）實驗分為下列3組（1）轉(zhuǎn)染對照miRNA并且不刺激HUVEC；（2）轉(zhuǎn)染對照miRNA并用細(xì)胞因子刺激HUVEC；（3）轉(zhuǎn)染miR-329并用細(xì)胞因子刺激HUVEC。（二）將上述的各組對照miRNA或miR-329分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。（三）在96孔板中包被70μl/孔冰浴的Matrigel，37℃固化30分鐘。（四）將轉(zhuǎn)染后24小時的HUVECs以1x105個/ml重懸于1640培養(yǎng)基（含10%血清）（五）將三種細(xì)胞懸液向96孔板的每個孔中加入100μl，每種細(xì)胞懸液設(shè)三個平行孔，VEGF和TNF-α（使用濃度50ng/ml）在接種細(xì)胞的時候同時加入。在培養(yǎng)箱中37℃孵育過夜。（六）倒置顯微鏡下觀察，拍照。（七）用圖像處理軟件ImageProPlus計算每孔血管狀細(xì)胞總長度。結(jié)果如圖7A所示。結(jié)果表明，VEGF和TNF-α聯(lián)合刺激可以顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的血管生成能力，而miR-329能夠顯著抑制聯(lián)合刺激引起的HUVEC血管生成。二、細(xì)胞遷移實驗（一）實驗分為下列3組（1）轉(zhuǎn)染對照miRNA并且不刺激HUVEC；（2）轉(zhuǎn)染對照miRNA并用細(xì)胞因子刺激HUVEC；（3）轉(zhuǎn)染miR-329并用細(xì)胞因子刺激HUVEC。（二）將上述的各組對照miRNA或miR-329分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。（三）將轉(zhuǎn)染后24小時的HUVEC以1x105個/ml重懸于無血清1640培養(yǎng)基。（四）Transwell上室分別加入細(xì)胞懸液(100μl/孔，每種處理設(shè)三個平行孔)，VEGF和TNF-α（使用濃度50ng/ml）在接種細(xì)胞的時候同時加入。下室加入200μl含10％血清的培養(yǎng)基。Transwell系統(tǒng)在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜。（五）將膜上層的細(xì)胞用棉簽擦掉，將膜揭下。下層細(xì)胞以4%多聚甲醛固定后，用1%結(jié)晶紫染色，顯微拍照。用ImageJ軟件統(tǒng)計每孔遷移的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果如圖7B所示。圖7表明，miR-329能夠顯著抑制VEGF和TNF-α聯(lián)合刺激引起的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。實施例4、miR-329抑制小鼠異種移植物中內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。（一）實驗分為下列3組（1）轉(zhuǎn)染對照miRNA并且不刺激HUVEC；（2）轉(zhuǎn)染對照miRNA并用細(xì)胞因子刺激HUVEC；（3）轉(zhuǎn)染miR-329并用細(xì)胞因子刺激HUVEC。（二）將上述的各組對照miRNA或miR-329分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。（三）在轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞20小時之后，將細(xì)胞消化并用60μlPBS重懸。（四）將細(xì)胞懸液（5×106個/樣）與500μlMatrigel，15U的肝素，VEGF和TNF-α（使用濃度50ng/ml）混合。(五)將混合物皮下注射到SCID/Beige雌性小鼠（年齡4周）的側(cè)背部。（六）6天以后，內(nèi)皮細(xì)胞將在體內(nèi)Matrigel中形成血管。處死小鼠，將異種移植物剝離，放入4%多聚甲醛固定并進(jìn)行石蠟切片和免疫組化實驗。（七）利用ImageJ軟件計算體內(nèi)成血管數(shù)量。結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，與第（2）組相比，第（3）組能顯著抑制小鼠中內(nèi)皮細(xì)胞血管的生成，與體外實驗結(jié)果一致。以上體外及體內(nèi)結(jié)果表明，miR-329可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成及細(xì)胞遷移能力，揭示了miR-329抑制缺血性眼部疾病視網(wǎng)膜上的血管新生及遷移并最終治療該疾病的作用機(jī)制。