專利名稱：一種鹽酸苯海拉明在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種鹽酸苯海拉明在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒(influenza virus)是嚴(yán)重影響人類健康的,可引起流行性感冒的病原體。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也稱甲、乙、丙三型。這三種不同型的病毒的基因組結(jié)構(gòu)、多肽組成、感染性和致病性等方面都存在顯著差異。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負鏈RNA組成，分別以節(jié)段I至節(jié)段8命名。病毒基因組全長約13.6kb，分別編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進一步分為16個H(H1-H16)和9個N(N1-N9)亞型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型，而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感多為H5、H7、和H9亞型，其中以H5N1亞型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆發(fā)，且至今未在除人以外的其它動物中發(fā)現(xiàn)其存在。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，可感染人類和豬。流感病毒在病毒分類學(xué)上屬正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒屬。流感病毒是分節(jié)段負鏈RNA病毒，所以病毒RNA不具有感染性，各個RNA節(jié)段必須與RNA聚合酶(PB2、PB1和PA)及核蛋白(NP)結(jié)合后形成vRNPs才有活性。感染的起始是病毒顆粒表面的HA刺突識別和結(jié)合宿主細胞表面含唾液酸的受體。唾液酸與次末端半乳糖的連接鍵，決定了病毒的宿主特異性，該連接鍵在禽類中為α (2-3)，在人類中為α (2_6)。流感病毒HA蛋白分子中，個別氨基酸的替換及不同的糖基化修飾能改變其受體結(jié)合的特異性。病毒吸附細胞后，細胞通過網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用攝入病毒。在細胞內(nèi)，網(wǎng)格蛋白分子解離，病毒與內(nèi)涵體融合形成吞噬體，使得病毒粒子周圍的pH值下降至5.0左右。在此pH條件下，病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使位于輕鏈(HA2) N端的融合肽暴露，從而引起病毒囊膜與細胞膜融合。低PH環(huán)境也致使大量H+經(jīng)由M2離子通道進入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致Ml蛋白與vRNPs的解離。兩者的共同結(jié)果致使病毒粒子的vRNPs釋放到被感染細胞的胞漿。與其它RNA病毒不同，流感病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均發(fā)生在宿主細胞的細胞核內(nèi)。mRNA在核內(nèi)合成后轉(zhuǎn)移到胞漿，合成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。而后開始裝配子代病毒，神經(jīng)氨酸酶可水解細胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點釋放出來。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解為HAl和HA2多肽，這樣的病毒粒子才具有感染性，從而開始新一輪病毒的復(fù)制。流感病毒在人 類中已流行傳播了 300多年，數(shù)年即有一次暴發(fā)流行，全球性的流感大流行則數(shù)十年暴發(fā)一次。流感流行每年可導(dǎo)致25萬 50萬例死亡，300萬 500萬重病例，全球約共有5 15%的人被感染。對于全球性流感大流行而言，“在流行期間中疫苗和抗病毒藥物是降低發(fā)病率和死亡率最重要的應(yīng)對措施”。但是目前全球每年可生產(chǎn)3億人份三價流感疫苗一這僅夠西方國家的流感預(yù)防之用，而不能滿足全球性流感大流行的需求，而且由于流感病毒的抗原變異能力強，在新病毒株出現(xiàn)之前不可能研制疫苗。通常一個疫苗的大規(guī)模研發(fā)和制造至少需要六個月時間，即使到那時，由于全球生產(chǎn)能力有限及生產(chǎn)設(shè)施集中在發(fā)達國家，許多沒有生產(chǎn)設(shè)施的國家在第I波流行期間將使用不到疫苗。所以當(dāng)前疫苗能提供的保護率并不高?？沽鞲胁《舅幬锊粌H問世較晚，而且臨床上速效、顯效的治療藥物也較少，屬于抗感染類藥物中的小品種。目前，經(jīng)美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)正式上市的抗流感病毒藥物有兩類:(I)以金剛烷胺和金剛乙胺為代表的M2離子通道阻斷劑。此類藥只對甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用，研究表明藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且由于廣泛使用使得耐藥株普遍存在，所以CDC建議此類藥物不再用于預(yù)防流感病毒感染。(2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑，此類藥的代表是奧斯他韋和扎拉米韋。此類藥物對所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來關(guān)于奧斯他韋的耐藥株卻不斷有報道。鹽酸苯 海拉明為組胺I類抑制劑，為人工合成的小分子化合物，能消除各種過敏癥狀，其中樞抑制作用顯著，具有鎮(zhèn)靜、防暈動及止吐作用，也有抗膽堿作用，可緩解支氣管平滑肌痙攣。用于各種過敏性皮膚疾病，如蕁麻疹、蟲咬癥；亦用于暈動癥，惡心、嘔吐。鹽酸苯海拉明可以用于治療鼻炎，目前沒有鹽酸苯海拉明直接用在抗流感病毒方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，是在于提供了一種小分子化合物鹽酸苯海拉明在制備治療或預(yù)防流感藥物中的應(yīng)用，從而為臨床上流感的治療提供一種安全高效毒副作用小的小分子化合物。鹽酸苯海拉明在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制流感病毒的進入，可進一步開發(fā)為治療流感病毒感染疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。鹽酸苯海拉明的英文名為diphenhydramine hydrochloride,化學(xué)式為N，N-二甲基-2- (二苯基甲氧基)乙胺鹽酸鹽(N-(2_Diphenylmethoxyethyl)-N，N-dimethylamine hydrochloride)，具有結(jié)構(gòu)式I所示的結(jié)構(gòu)式:
I
(^0.μ結(jié)構(gòu)式I為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案: 一種鹽酸苯海拉明在制備治療或預(yù)防流感病毒(甲型或乙型)藥物中的應(yīng)用，其步驟是:Α.鹽酸苯海拉明對MDCK細胞的細胞毒性實驗:MDCK細胞按5000細胞/孔(100μ I)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，用細胞維持液(DMEM+2%血清)將藥物以ImM為起始濃度連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，每梯度2個復(fù)孔，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，以3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍，MTT)法檢測細胞的存活率。結(jié)果顯示鹽酸苯海拉明對MDCK細胞的CC50 (半數(shù)致死濃度)為699.7 μ Μ。B.鹽酸苯海拉明抗流感病毒活性的評價:將MDCK細胞按2*104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 18h待細胞長成單層，然后加IOOTCID5ci/孔病毒液感染細胞，同時加入各濃度梯度藥物共200 μ I維持培養(yǎng)液(DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶)于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。結(jié)果顯示:鹽酸苯海拉明明顯抑制了流感病毒復(fù)制，其EC50為14.67 μ M0C.鹽酸苯海拉明抗流感病毒作用周期分析:細胞按5*104接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁為單層后，分別在病毒感染-2 0h，0 2h，2 4h，4 6h給以相同濃度藥物培養(yǎng)，在感染后6h固定細胞，通過間接免疫熒光檢測病毒NP蛋白表達。結(jié)果顯示:鹽酸苯海拉明在O 2h內(nèi)給藥能抑制病毒感染，主要抑制病毒吸附和進入。D.鹽酸苯海拉明抗流感病毒活性廣譜性分析:將MDCK細胞按2*104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37 °C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 18h待細胞長成單層，然后加 IOOTCId50/ 孔病毒液(A/human/Hubei/1/2009 (H1N1), A/human/Hubei/3/2005(H3N2), Influenza B virus)感染細胞，同時加入各濃度梯度藥物共200 μ I維持培養(yǎng)液(DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶)于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。結(jié)果顯示:鹽酸苯海拉明可以明顯抑制甲型流感病毒亞型HlNl株、甲型流感病毒H3N2株和乙型流感病毒株的復(fù)制，且具有劑量依賴效應(yīng)。本發(fā)明與 現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果:1.鹽酸苯海拉明是小分子化合物，其CC50是699.7 μ M。鹽酸苯海拉明劑量依賴地抑制流感病毒復(fù)制，其EC50是14.67 μ Μ，治療指數(shù)約為48。這說明鹽酸苯海拉明是低毒高效的抗流感病毒的藥物。2.鹽酸苯海拉明作用于流感病毒復(fù)制早期，主要抑制病毒吸附和進入等早期事件。3.鹽酸苯海拉明能抑制甲型流感病毒亞型HlNl株、甲型流感病毒Η3Ν2株和乙型流感病毒株的復(fù)制，具有廣譜的抗病毒活性。4.利用現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將鹽酸苯海拉明可以作成活性成分制成片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、緩釋制劑、控釋制劑、納米制劑、注射劑等任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。


圖1為一種鹽酸苯海拉明化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2為一種鹽酸苯海拉明的細胞毒性檢測示意圖。圖3為一種鹽酸苯海拉明處理流感病毒感染細胞的培養(yǎng)液上清中的神經(jīng)氨酸酶活示意圖。圖4為一種檢測鹽酸苯海拉明對病毒單輪復(fù)制周期不同階段的影響結(jié)果示意圖。圖5為一種檢測鹽酸苯海拉明抗流感病毒活性廣譜性檢測示意圖。圖5Α 圖為甲型流感病毒亞型 HlNl 株(A/human/Hubei/1/2009 (HlNl)；圖5B 圖為甲型流感病毒 H3N2 株(A/human/Hubei/3/2005 (H3N2)；圖5C圖為乙型流感病毒株(InfIuenza B virus)。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施方法對本發(fā)明內(nèi)容作進一步說明，但本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。目前，抗流感病毒藥物體外篩選模型分為細胞培養(yǎng)模型和病毒酶的無細胞系統(tǒng)篩選模型。酶反應(yīng)篩選模型具有高通量的特點，但篩選的化合物仍需進行更多的細胞學(xué)、組織學(xué)和體內(nèi)毒性、藥效實驗等以確定其效果。細胞培養(yǎng)模型是最常用的篩選模型，其優(yōu)點在于:可提供大量遺傳性狀相同的細胞為研究對象，操作方便，可消除其它外界因素的影響，并可以檢測藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機理研究提供更多基礎(chǔ)。本發(fā)明采用細胞培養(yǎng)篩選法檢測鹽酸苯海拉明對流感病毒感染MDCK細胞，檢測病毒上清中病毒粒子的含量，定量分析鹽酸苯海拉明抗流感病毒活性。實施例1:鹽酸苯海拉明抗流感病毒活性的評價1.實驗材料與方法1.1細胞、病毒和藥物MDCK細胞購自ATCC，病毒A/PR8/34H1N1由雞胚培養(yǎng)擴增得到，鹽酸苯海拉明購于Sigma公司；1.2實驗儀器多功能檢測儀PerkinElmer,倒置顯微鏡Costar2.實驗方法:2.1細胞培·養(yǎng):37°C, 5% (體積比，以下相同)CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10% (體積比，以下相同)FBS、100U/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細胞至90%匯合度后傳代，傳代比例 1/3 - 1/4。2.2病毒培養(yǎng):取9 11日齡SPF雞胚，接種病毒前用驗蛋器檢查，并在遠離胚胎的位置標(biāo)記，消毒并打孔后按0.2ml/枚接種24血凝效價的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒溫箱孵育48h(接種24h后死亡的雞胚一般為操作不當(dāng)致死，棄之)。取出雞胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒雞胚氣室，無菌操作剪去氣室外殼，毛細吸管吸取雞胚尿囊液和羊水，3000rpm4°C離心301^11，檢測血凝效價，20(^1/管分裝并置_70°C凍存?zhèn)溆谩?一)藥物細胞毒性檢測:1.MDCK細胞按5000細胞/孔(100 μ I)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后
備用;2.用細胞維持液(DMEM+2%血清)將藥物以ImM為起始濃度連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，每梯度2個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后于每孔中加入5mg/ml MTT20 μ 1，置細胞培養(yǎng)箱中繼
續(xù)培養(yǎng)；3.培養(yǎng)4h后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入100 μ I/孔三聯(lián)溶解液(溶解液由SDSlOg，異丁醇5ml，IOM HC10.1ml，用雙蒸水溶解配成IOOml )，37°C培養(yǎng)箱中溶解4h以上或過夜后酶聯(lián)檢測儀檢測570nm波長處吸光值，校正波長為630nm，并計算各藥物濃度細胞存活率，結(jié)果見圖2。
結(jié)果顯示:鹽酸苯海拉明在濃度〈250 μ M范圍內(nèi)對MDCK細胞沒有明顯細胞毒性，說明鹽酸苯海拉明有比較安全的適用范圍。(二)鹽酸苯海拉明抗A/PR8/34 HlNl病毒株的活性檢測:Α.基于神經(jīng)氨酸酶活性檢測鹽酸苯海拉明抗流感病毒作用:1.實驗原理:MUNANA (4_methylumbelliferyl-a-N-acetyl-neuraminate)是流感病毒神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的催化產(chǎn)物在355nm激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生460nm熒光，熒光強度的變化，可以靈敏反應(yīng)神經(jīng)氨酸酶活性，從而可反應(yīng)細胞上清中病毒數(shù)量。2.將MDCK細胞按2*104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 18h后，待細胞長成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS液洗兩遍，力口100TCID50/孔病毒液感染細胞，同時加入各濃度梯度(以200 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋7個梯度，每梯度2個復(fù)孔)藥物共200 μ I維持培養(yǎng)液(DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶)于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。3.黑色 96 孔微量板中加入 40μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES，pH 6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實驗孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育30min，加入反應(yīng)終止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能檢測儀上測定熒光值(激發(fā)光波長355nm,發(fā)射光波長465nm)。4.計算各檢測孔中NA被抑制率。抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對照)/ (酶活對照-空白對照)*100%。結(jié)果顯示:鹽酸苯海拉明明顯抑制了流感病毒復(fù)制，并且呈劑量依賴關(guān)系(見圖3)``
不同濃度鹽酸苯海拉明對流感病毒復(fù)制抑制率如下所示:
權(quán)利要求
1.一種鹽酸苯海拉明在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用；所述的流感病毒為甲型流感病毒或乙型流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹽酸苯海拉明在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。選用完全無毒性濃度的鹽酸苯海拉明進行抗病毒實驗，結(jié)果顯示這種小分子化合物具有顯著的抗病毒活性并呈劑量依賴相關(guān)。接下來分析了鹽酸苯海拉明抗流感病毒的作用周期，表明鹽酸苯海拉明主要抑制病毒吸附和進入等病毒感染早期事件。最后檢測鹽酸苯海拉明對不同型和亞型流感病毒的抗病毒活性，結(jié)果顯示鹽酸苯海拉明可以抑制所有檢測病毒株的復(fù)制且具有劑量依賴效應(yīng)，表明鹽酸苯海拉明抗流感病毒活性具有一定的廣譜性。本發(fā)明的鹽酸苯海拉明可以作為新的抗流感病毒藥物進行開發(fā)，為治療流感提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61K31/135GK103251576SQ20131017516
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者陳緒林, 廖慶姣 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所