膠原蛋白7及相關(guān)方法
【專利摘要】公開了制造膠原蛋白7或其功能性片段的方法，以及通過此種方法生產(chǎn)的膠原蛋白7和其功能性片段、編碼膠原蛋白7和其功能性片段的核酸，以及包括此種核酸的載體和宿主細(xì)胞。
【專利說明】膠原蛋白7及相關(guān)方法
[0001]本發(fā)明涉及膠原蛋白7、膠原蛋白7相關(guān)核酸和細(xì)胞及相關(guān)方法。
[0002]背景
[0003]膠原蛋白是加強和支持結(jié)締組織，例如皮膚、腱、韌帶和骨骼的蛋白質(zhì)家族。膠原蛋白7作為錨原纖維的主要組分，其功能在于加強和穩(wěn)定各種組織，包括皮膚(Ricard-Blum, Cold Spring Harb Perspect Biol3 (I):a004978 (2011))。
[0004]膠原蛋白7合成為三條前-α I (VD多肽鏈，該多肽鏈隨后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)加工和折疊成三螺旋前膠原蛋白7蛋白質(zhì)。前膠原蛋白7分泌到細(xì)胞外空間中，在那里它被進(jìn)一步加工為成熟膠原蛋白 7 (Chung et al.Dermatol Clin28 (I):93-105 (2010))。成熟膠原蛋白7經(jīng)過多步驟的聚合過程以形成結(jié)構(gòu)性錨原纖維(Fritsch et al.J BiolChem284(44): 30248-30256 (2009))。在皮膚中，發(fā)現(xiàn)這些錨原纖維在表皮基底膜帶內(nèi)，其是位于皮膚最上層、表皮和真皮底層之間的兩層膜。在這里錨原纖維連接表皮基底膜至乳突真皮層。這種連接協(xié)助將皮膚的表皮和真皮層連接在一起，為皮膚提供構(gòu)造和穩(wěn)定性(Villone et al.J Biol Chem283 (36):24506-24513 (2008))。
[0005]發(fā)明概述
[0006]在一個方面，公開的特征在于制造膠原蛋白7或其功能性片段的方法。該方法包括:
[0007]提供細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞，例如，CHO或HEK細(xì)胞，經(jīng)基因修飾以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段，和可選地，一種或多種多肽，例如，在細(xì)胞中提高膠原蛋白7產(chǎn)量的一種或多種多肽(例如，脯氨酸肽酶和/或脯氨酰羥化酶)；以及
[0008]在足夠用于生產(chǎn)膠原蛋白7或其功能性片段的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，從而制造膠原蛋白7或其功能性片段。
[0009]在一個實施方案中,膠原蛋白7是人膠原蛋白7。在一個實施方案中,膠原蛋白7由高甘氨酸密碼子優(yōu)化的序列所編碼，例如，本文所描述的高甘氨酸密碼子優(yōu)化的序列。在一個實施方案中，膠原蛋白7具有SEQ ID N02的氨基酸序列。在一個實施方案中，膠原蛋白7的氨基酸序列與SEQ ID N02至少80、90、95或99%相同。在一個實施方案中，膠原蛋白7的氨基酸序列與SEQ ID N02的不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個氨基酸殘基。
[0010]在一個實施方案中，所述細(xì)胞經(jīng)基因修飾以表達(dá)脯氨酸肽酶或其功能性片段，并且例如，所述脯氨酸肽酶 可以是哺乳動物，例如人脯氨酸肽酶，或者嚙齒動物，如小鼠、大鼠或倉鼠脯氨酸肽酶。在一個實施方案中，脯氨酸肽酶是:人脯氨酸肽酶，例如具有SEQ IDN04的氨基酸序列的人脯氨酸肽酶；具有與SEQ ID N04至少80、90、95或99%相同的氨基酸序列的脯氨酸肽酶；具有與SEQ ID N04的不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個殘基的氨基酸序列的脯氨酸肽酶。
[0011]在一個實施方案中，所述細(xì)胞經(jīng)基因修飾以表達(dá)脯氨酰羥化酶或其功能性片段，并且例如，所述脯氨酰羥化酶可以是哺乳動物，例如人脯氨酰羥化酶，或者嚙齒動物，如小鼠、大鼠或倉鼠脯氨酰羥化酶。在一個實施方案中，脯氨酰羥化酶是:人脯氨酰羥化酶，例如具有SEQ ID NO X的氨基酸序列的人脯氨酰羥化酶；具有與SEQ ID NO X至少80、90、95或99%相同的氨基酸序列的脯氨酰羥化酶；具有與SEQ ID NO X的不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個殘基的氨基酸序列的脯氨酰羥化酶。
[0012]在一個實施方案中，所述細(xì)胞經(jīng)基因修飾以表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段，例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶或其功能片段。糖基轉(zhuǎn)移酶可以是哺乳動物，例如人糖基轉(zhuǎn)移酶，如唾液酸轉(zhuǎn)移酶，或者嚙齒動物，如小鼠、大鼠或倉鼠糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0013]在一個實施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶是唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如具有SEQID N05的氨基酸序列的唾液酸轉(zhuǎn)移酶；具有與SEQ ID N0:5至少80、90、95或99%相同的氨基酸序列的唾液酸轉(zhuǎn)移酶；具有與SEQ ID NO 5的不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個殘基的氨基酸序列的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
[0014]在一個實施方案中，所述經(jīng)基因修飾的細(xì)胞包括編碼膠原蛋白7或其功能性片段的核酸，例如高甘氨酸密碼子優(yōu)化的核酸序列，例如SEQ ID NOl的核酸序列。在一個實施方案中，所述核酸序列與SEQID NOl至少80、90、95或99%相同；所述核酸序列與SEQ IDNOl的不同不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個殘基。在一個實施方案中，至少80、90、95、或99%的密碼子具有SEQ ID NOl的密碼子值。
[0015]在一個實施方案中，經(jīng)基因修飾的細(xì)胞包括編碼脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸。
[0016]在一個實施方案中，經(jīng)基因修飾的細(xì)胞包括編碼脯氨酰羥化酶或其功能性片段的核酸。
[0017]在一個實施方案中，經(jīng)基因修飾的細(xì)胞包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸。
[0018]在一個實施方案中，細(xì)胞包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括編碼膠原蛋白7或其功能性片段的核酸序列。在一個實施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列。在一個實施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼脯氨酰羥化酶或其功能性片段的核酸序列。在一個實施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸序列。在一個實施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列，以及編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸序列。在一個實施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼脯氨酰羥化酶或其功能性片段的核酸序列，以及編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸序列。
[0019]在一個實施方案中，細(xì)胞包括第二表達(dá)載體，所述第二表達(dá)載體包括編碼脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列。
[0020]在一個實施方案中，細(xì)胞包括第二表達(dá)載體，所述第二表達(dá)載體包括編碼脯氨酰羥化酶或其功能性片段的核酸序列。
[0021]在一個實施方案中，細(xì)胞包括第三表達(dá)載體，所述第三表達(dá)載體包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸序列。
[0022]在一個實施方案中，細(xì)胞包括第二表達(dá)載體和第三表達(dá)載體，所述第二表達(dá)載體包括編碼脯氨酸肽酶或其功能性片段的核酸序列，所述第三表達(dá)載體包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸序列。
[0023]在一個實施方案中，細(xì)胞包括第二表達(dá)載體和第三表達(dá)載體，所述第二表達(dá)載體包括編碼脯氨酰羥化酶或其功能性片段的核酸序列，所述第三表達(dá)載體包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或其功能性片段的核酸序列的第三表達(dá)載體。
[0024]在一個實施方案中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例如人或嚙齒動物，如大鼠、小鼠或中國倉鼠細(xì)胞。
[0025]在一個實施方案中，細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0026]在一個實施方案中，細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。
[0027]在一個實施方案中，方法進(jìn)一步包括從所述經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞中回收膠原蛋白7或其功能性片段。
[0028]在一個實施方案中，從培養(yǎng)基回收膠原蛋白7或其功能性片段。
[0029]在一個實施方案中，方法進(jìn)一步包括從所述培養(yǎng)的細(xì)胞中純化膠原蛋白7或其功能性片段。
[0030]在一個實施方案中，方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中純化膠原蛋白7或其功能片段。
[0031]在一個實施方案中，至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入同三聚體中。
[0032]在一個實施方案中，至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功
能性片段并入六聚體中。
[0033]在另一個方面，所公開的特征在于本文所描述的載體。
[0034]在另一個方面，所公開的特征在于本文所描述的細(xì)胞或經(jīng)分離的細(xì)胞制備物。
[0035]在另一個方面，所公開的特征在于編碼本文所描述的膠原蛋白7的高甘氨酸優(yōu)化的序列。
[0036]在另一個方面，所公開的特征在于本文所描述的經(jīng)分離的細(xì)胞制備物，其進(jìn)一步包括任何培養(yǎng)基，和由所述細(xì)胞生產(chǎn)的膠原蛋白7或其功能性片段，
[0037]在另一個方面，所公開的特征在于制造適合用于表達(dá)膠原蛋白7或其功能片段的方法，其包括:
[0038]重組地操作細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞,如本文所描述的哺乳動物細(xì)胞，以表達(dá)重組膠原蛋白7或其功能性片段；
[0039]可選地，重組地操作所述細(xì)胞以表達(dá)一種或多種多肽，例如，提高細(xì)胞中膠原蛋白7產(chǎn)量的一種或多種多肽(例如，脯氨酸肽酶和/或脯氨酰羥化酶);
[0040]從而制造適合用于表達(dá)重組膠原蛋白7的細(xì)胞。
[0041]在一個實施方案中，方法包括重組地操作細(xì)胞以表達(dá)由高甘氨酸密碼子優(yōu)化的核酸序列所編碼的膠原蛋白7，例如本文所描述的高甘氨酸密碼子優(yōu)化的核酸序列。
[0042]在本方法的一個實施方案中，細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段，并且細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)一種或多種多肽，例如，增加細(xì)胞中膠原蛋白7的表達(dá)的那些。在一個實施方案中，在細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)一種或多種多肽之前，例如在細(xì)胞中增強膠原蛋白7的表達(dá)的那些，例如一個或多個脯氨酸肽酶、脯氨酰羥化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和其功能性片段，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段。
[0043]在一個實施方案中，在細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)一種或多種多肽之后，例如在細(xì)胞中增強膠原蛋白7的表達(dá)的那些，例如一個或多個脯氨酸肽酶、脯氨酰羥化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和其功能性片段，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段。[0044]在本方法的一個實施方案中，在細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)一種或多種多肽的同時，例如在細(xì)胞中增強膠原蛋白7的表達(dá)的那些，例如一個或多個脯氨酸肽酶、脯氨酰羥化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和其功能性片段，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段。
[0045]在另一個方面，本發(fā)明的特征在于通過本文所描述的方法所制造的膠原蛋白7或其功能性片段。
[0046]在另一個方面，本發(fā)明的特征在于通過本文所描述的方法制造的膠原蛋白7或其功能性片段的經(jīng)純化或經(jīng)分離的制備物。
[0047]在另一個方面，本發(fā)明的特征在于膠原蛋白7或其功能性片段的經(jīng)純化或經(jīng)分離的制備物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入同三聚體中。
[0048]在另一個方面，本發(fā)明的特征在于膠原蛋白7或其功能性片段的經(jīng)純化或經(jīng)分離的制備物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入六聚體中。
[0049]在另一個方面，本發(fā)明的特征在于純化膠原蛋白7或其功能片段的方法，其包括:
[0050]提供經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，例如，來自于對本文所描述的細(xì)胞的培養(yǎng)物；
[0051]對得自所述培養(yǎng)基的膠原蛋白7或其功能性片段進(jìn)行陰離子交換色譜，例如用Q瓊脂糖。
[0052]從而純化膠原蛋白7或其功能性片段。
[0053]在一個實施方案中，所述方法包括:
[0054]提供經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基，例如，來自對本文所描述的細(xì)胞的培養(yǎng)物；
[0055]可選地，沉淀蛋白質(zhì)，例如，用硫酸銨以形成沉淀蛋白質(zhì)；
[0056]溶解所述沉淀蛋白質(zhì)以形成溶解的蛋白質(zhì)；
[0057]透析所述溶解的蛋白質(zhì)以形成透析液；
[0058]沉降所述經(jīng)透析的樣品以形成上清液；和
[0059]對所述上清液進(jìn)行陰離子交換色譜法分析，例如，用Q瓊脂糖；從而純化膠原蛋白7或其功能性片段。
[0060]本發(fā)明的一個或多個實施方案的細(xì)節(jié)將在下面的說明書中闡明。借由說明書和附圖以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將是顯而易見的。
[0061]詳細(xì)說明
[0062]定義
[0063]“重組地操作以表達(dá)”或“經(jīng)基因操作以表達(dá)”，如本文所使用，是指經(jīng)過修飾的細(xì)胞以便表達(dá)蛋白質(zhì)。示例性的修飾包括引入編碼蛋白質(zhì)的核酸，或?qū)⒕幋a蛋白質(zhì)的內(nèi)源序列置于不是天然內(nèi)源序列的序列的控制下，例如引入激活內(nèi)源基因的序列。
[0064]分離的核酸分子，如本文所使用，意指已經(jīng)從它們來源的基因組DNA或細(xì)胞RNA的核酸分離出的核酸。這包括通過合適的方法包括但不限于化學(xué)方法、化學(xué)和生物方法的組合獲得的核酸分子，及分離的重組核酸分子。
[0065]重組的，如本文所使用，關(guān)于核酸分子，屬于利用分子生物技術(shù)已被工程改造化的核酸分子。重組的，如本文所使用，關(guān)于蛋白質(zhì)或多肽分子，屬于使用分離的核酸分子或重組核酸分子表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽分子。
[0066]高甘氨酸優(yōu)化的或高甘氨酸密碼子優(yōu)化的，如本文所使用，是指編碼膠原蛋白7或其功能片段的核酸序列。所述序列包括至少一個除最常見的甘氨酸密碼子以外的甘氨酸密碼子，在本文中稱為不常見的密碼子。在一個實施方案中，不常見的甘氨酸密碼子是除了對于將表達(dá)序列的細(xì)胞而言最常見的甘氨酸密碼子以外的那些。舉個例子，如果序列將在CHO細(xì)胞中表達(dá)，不常見的甘氨酸密碼子是除了 CHO細(xì)胞中的最常見的甘氨酸密碼子以外的那些。在一個實施方案中，不常見的甘氨酸密碼子是本文所指的細(xì)胞的不常見的甘氨酸密碼子，例如CHO或HEK細(xì)胞。在實施方案中，序列包括至少一個，并且在實施方案中，包括至少10、20或30個不存在于膠原蛋白7的天然人序列中的不常見的甘氨酸密碼子。在一個實施方案中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的甘氨酸密碼子是不常見甘氨酸密碼子。
[0067]膠原蛋白7
[0068]作為錨原纖維的主要組分，膠原蛋白7的功能在于維持組織的完整性。錨原纖維在一些組織的上皮和間質(zhì)層之間的界面上充當(dāng)附著復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性成分，包括皮膚、口腔粘膜和子宮頸(Chung et al.Dermatol Clin28 (I):93-105 (2010))。在皮膚中，錨原纖維從表皮基底膜的下部延伸到底層真皮乳頭層，保護(hù)表皮基底膜和真皮乳頭層之間的關(guān)聯(lián)(Varki et al.J Med Genet44:181-192 (2007))。這種關(guān)聯(lián)協(xié)助在表皮和真皮之間提供并維持凝聚力，促進(jìn)皮膚的完整性，這對其正常的結(jié)構(gòu)、功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要(Villoneet al.J Biol Chem283(36):24506-24513(2008))。
[0069]編碼膠原蛋白7的核酸能用于本文所描述的方法中。高甘氨酸密碼子優(yōu)化的序列尤其適合。如下是人膠原蛋白7的示例性高甘氨酸的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列:
[0070]
【權(quán)利要求】
1.制造膠原蛋白7的方法，包括: 提供細(xì)胞，其經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段，以及，可選的一種或多種增強膠原蛋白7的表達(dá)的多肽，例如，脯氨酸肽酶； 在足夠用于生產(chǎn)膠原蛋白7和脯氨酸肽酶的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞， 從而制造股原蛋白7。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)基因操作以表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶是唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞包括外源引入的、編碼膠原蛋白7或其功能性片段的核酸，例如，本文所描述的高甘氨酸密碼子優(yōu)化的核酸序列。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞包括外源引入的、編碼脯氨酸肽酶的核酸。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞包括外源引入的、編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞包括表達(dá)載體，其包括編碼膠原蛋白7的序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞包括第二表達(dá)載體，其包括編碼脯氨酸肽酶的序列。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞包括第三表達(dá)載體，其包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的序 列。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞包括第二表達(dá)載體和第三表達(dá)載體，所述第二表達(dá)載體包括編碼脯氨酸肽酶的序列，所述第三表達(dá)載體包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的序列。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼脯氨酸肽酶的序列。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的序列。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼脯氨酸肽酶的序列和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的序列。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠原蛋白7是人膠原蛋白7。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述脯氨酸肽酶是人脯氨酸肽酶。
19.權(quán)利要求2的方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶是人糖基轉(zhuǎn)移酶。
20.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括從所述已培養(yǎng)的細(xì)胞回收膠原蛋白7或其功能性片段。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述膠原蛋白7或其功能性片段回收自培養(yǎng)基。
22.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括從所述已培養(yǎng)的細(xì)胞純化膠原蛋白7或其功能性片段。
23.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基純化膠原蛋白7或其功能性片段。
24.權(quán)利要求23的方法，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入同三聚體中。
25.權(quán)利要求23的方法，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入六聚體中。
26.本文所描述的載體。
27.載體的集合，包括至少兩種本文所描述的載體。
28.本文所描述的細(xì)胞。
29.本文所描述的細(xì)胞的經(jīng)分離的制備物。
30.細(xì)胞培養(yǎng)物，包括上述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞、培養(yǎng)基和由所述細(xì)胞生產(chǎn)的膠原蛋白7。
31.制造適合用于表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段的細(xì)胞的方法，包括: 重組地操作所述細(xì)胞以表達(dá)重組膠原蛋白7或其功能性片段；以及 可選地，重組地操作所述細(xì)胞以表達(dá)重組脯氨酸肽酶； 從而制造適合于表達(dá)重組膠原蛋白7或其功能性片段的細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中在所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作表達(dá)重組糖基轉(zhuǎn)移酶之前，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段。
33.權(quán)利要求31的方法，其中在所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作表達(dá)重組糖基轉(zhuǎn)移酶之后，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以 表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段。
34.權(quán)利要求31的方法，其中在所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作表達(dá)重組糖基轉(zhuǎn)移酶的同時，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段。
35.權(quán)利要求31的方法，其中在操作所述細(xì)胞以重組地表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段之前，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)重組糖基轉(zhuǎn)移酶。
36.權(quán)利要求31的方法，進(jìn)一步包括重組地操作所述細(xì)胞以表達(dá)重組糖基轉(zhuǎn)移酶。
37.權(quán)利要求31的方法，其中在操作所述細(xì)胞以重組地表達(dá)膠原蛋白7或其功能性片段之前、之后或同時，所述細(xì)胞經(jīng)重組地操作以表達(dá)重組糖基轉(zhuǎn)移酶。
38.通過本文所描述的方法所制造的膠原蛋白7或其功能性片段。
39.通過本文所描述的方法所制造的膠原蛋白7或其功能性片段的經(jīng)純化或經(jīng)分離的制備物。
40.膠原蛋白的經(jīng)純化或經(jīng)分離的制備物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入同三聚體中。
41.膠原蛋白的經(jīng)純化或經(jīng)分離的制備物，其中至少30、40、50、60、70、80、90或95%的所述膠原蛋白7或其功能性片段并入六聚體中。
42.純化膠原蛋白7或其功能性片段的方法，包括: 提供經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基； 沉淀蛋白質(zhì)，例如，用硫酸銨； 溶解所述沉淀的蛋白質(zhì)； 透析所述溶解的蛋白質(zhì)； 沉降所述透析的樣品以形成上清液；和 對上清液進(jìn)行陰離子交換色譜法分析，例如，用Q瓊脂糖； 從而純化膠原蛋白7或其功能性片段。
【文檔編號】A61K38/17GK103842517SQ201280047084
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月3日
【發(fā)明者】M·德蘇薩, M·韋斯瓦納杉 申請人:蓮花組織修復(fù)公司