專利名稱：雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物及制備方法及其用途的制作方法
雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物及制備方法及其用途技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于藥用真菌領(lǐng)域，尤其是指一種白耙齒菌菌質(zhì)提取物及制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
白祀齒菌ZrjDejr Iacteus Fr.屬擔(dān)子菌綱多孔菌目齒菌科祀齒菌屬的一種真菌，別名白囊孔。該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)是CGMCC No. 1016。其子實(shí)體生于闊葉樹的枯立木和枯倒木上。形態(tài)特征擔(dān)子果(子實(shí)體)平伏，擴(kuò)展，白色，軟革質(zhì)；有時(shí)倒生，呈復(fù)瓦狀疊生，扇形，有狹小的基部；蓋面乳白色， 有短絨毛，絹絲樣光澤，有環(huán)紋，邊緣薄，下彎，波狀至淺裂。菌肉白色。刺呈耙齒狀，短，不整齊，白色至黃白色，孢子橢圓形，平滑，無色，囊狀體棒形或紡錘形，有時(shí)披有結(jié)晶，主要分布于長白山林區(qū)和黑龍江、河北、山西、甘肅、江西、福建、云南和西藏等省區(qū)。
白耙齒菌的藥用在歷史上僅限于民間采集野生子實(shí)體，其子實(shí)體生于闊葉樹的枯立木和枯倒木上。比較難采集到，因此子實(shí)體比較稀缺，無法大量收集。
慢性腎小球腎炎是由多種原發(fā)性腎小球病理損害導(dǎo)致的，以蛋白尿、血尿、水腫、 高血壓為常見的臨床表現(xiàn)的一類疾病。是腎科常見病與多發(fā)病。其中絕大多數(shù)患者具有不同程度的腎功能損害，且呈進(jìn)行性加重，漸進(jìn)性的轉(zhuǎn)為腎功能衰竭。因而，及時(shí)有效地治療慢性腎小球腎炎是科研工作者的重要課題。
80年代-90年代，長春中醫(yī)學(xué)院宋啟印教授首次研究開發(fā)應(yīng)用白耙齒菌液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)白耙齒菌多糖治療慢性腎小球腎炎，即目前市場上的中成藥“益腎康”膠囊。益腎康膠囊，主要成份是耙齒菌多糖的粗提物。內(nèi)容物為褐色至深褐色的粉末；味微酸澀。具有清利濕熱之功效。用于慢性腎小球腎炎屬下焦?jié)駸嶙C者。但患者服用偶見胃脘不適，口干，納差，惡心。
目前藥用真菌的生產(chǎn)一般有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種形式。國內(nèi)外較多應(yīng)用液體發(fā)酵生產(chǎn)是借鑒抗生素的生產(chǎn)工藝，應(yīng)用發(fā)酵罐優(yōu)點(diǎn)是有較高的機(jī)械化與自動(dòng)化，生產(chǎn)規(guī)模大。但因藥用真菌自身一般不產(chǎn)生抗生素，或產(chǎn)生的抗生素抑菌作用較弱，不能對(duì)細(xì)菌等其他微生物產(chǎn)生很好的拮抗作用，因此在發(fā)酵過程中易污染雜菌而倒灌，造成重大損失。其生產(chǎn)設(shè)備投資巨大，耗能也較多，生產(chǎn)成本較高。
藥用真菌的固體發(fā)酵最早見于2000年前中藥“六神曲”和“半夏曲”的生產(chǎn)，是利用自然界的霉菌進(jìn)行發(fā)酵，其作用是產(chǎn)生消食和胃的功能。其工藝一直沿用至今，但“六神曲”和“半夏曲”的發(fā)酵不是純種發(fā)酵，工藝不好控制。近幾年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，采用純種接種，建立科學(xué)可控的質(zhì)量監(jiān)控體系，其發(fā)酵過程的穩(wěn)定性得到了很好地解決。南京中醫(yī)藥大學(xué)莊毅教授于上世紀(jì)80年代研究以藥用真菌“槐耳robiniophila Murr. 為發(fā)酵菌種，在以農(nóng)副產(chǎn)品為營養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行固體發(fā)酵，其藥用菌質(zhì)稱”槐耳菌質(zhì)”。開發(fā)出具有抗腫瘤功效的新藥“槐耳沖劑”，同時(shí)提出藥用真菌新型雙向性固體發(fā)酵工程理論。藥用真菌新型雙向性固體發(fā)酵工程(以下簡稱“雙向發(fā)酵”)其原理為選定特定的發(fā)酵菌種，用3特定的中藥材作為藥性基質(zhì)，再用農(nóng)副產(chǎn)品作為營養(yǎng)基質(zhì)(合稱全性基質(zhì))，雙方共構(gòu)成一個(gè)發(fā)酵組合，在特定條件下進(jìn)行雙向發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品成為藥性菌質(zhì)，它是生物技術(shù)的一個(gè)新起點(diǎn)。它可以改變?cè)幍男阅堋⒃鰪?qiáng)藥效及擴(kuò)大適應(yīng)癥。發(fā)酵后的產(chǎn)物比進(jìn)行發(fā)酵的兩種物質(zhì)單獨(dú)使用的藥效大，即“1+1 > 2”。
卞寒iiHordeum vulgare)為禾本科一年生草本植物的種子,既是食品又是藥品， 《本草綱目》記載“大麥味甘、性平、有去食療脹、消積進(jìn)食、平胃止渴、消暑除熱、益氣調(diào)中、 寬胸大氣、補(bǔ)虛劣、壯血脈、益顏色、實(shí)五臟、化谷食之功”。現(xiàn)代研究證明，大麥茶含有人體所需的17種微量元素，19種以上氨基酸，富含多種維生素及不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)和膳食纖維。用以治食積不化，脘悶腹脹，泄瀉等脾胃虛弱之癥。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物及制備方法及其用途，以解決白耙齒菌液體培養(yǎng)提取物使患者產(chǎn)生胃脘不適、口干、納差、惡心等副作用的問題。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物的制備方法是(1)白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中；(2)種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)在溫度22°C-26°C，空氣濕度65%-70%環(huán)境下發(fā)酵7-9天；(3)發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度22°C-26°C，空氣濕度65%-70%環(huán)境下發(fā)酵18-21 天，得到白耙齒菌的菌質(zhì)；(4)該菌質(zhì)以80°C 90°C熱水提取2 3次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次I小時(shí)，合并濾液，濃縮成60°C時(shí)測相對(duì)密度I. 05^1. 10的清膏，50°C 55°C減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。
本發(fā)明所述的大麥培養(yǎng)基是將重量比為95%-97%的大麥粒浸泡，使含水量達(dá)到 50-55%，加入重量比1%-2%的石膏粉，重量比2%-3%的蔗糖。
通過雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物的制備方法得到的白耙齒菌菌質(zhì)提取物在制備治療慢性腎小球腎炎屬下焦?jié)駸嶙C者的藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明利用大麥作為藥性基質(zhì)兼營養(yǎng)基質(zhì)(稱全性基質(zhì))，接種具有治療腎小球腎炎作用的白耙齒菌，雙方共構(gòu)成一個(gè)發(fā)酵組合，在特定條件下進(jìn)行雙向發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品成為藥性菌質(zhì)。大麥可以提供白耙齒菌生長的營養(yǎng)成分，使白耙齒菌菌絲生長繁殖，得到具有治療腎小球腎炎的代謝物，同時(shí)通過白耙齒菌的生長和代謝，改變大麥原有的性能、增強(qiáng)健脾消食的功能，緩和白耙齒菌代謝物所致胃脘不適，口干，納差，惡心等副作用。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所述白祀齒菌ZrjDeJT Iacteus Fr,該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)是=CGMCC No. 1016。
白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子的方法如下(I)一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)基:葡萄糖 2-3%,馬鈴薯 20-25%,瓊脂 2. 2%，MgSO4 O. 2%, KH2PO4O. 3%, VB1 O. 05% ； 斜面菌種培養(yǎng)溫度25-27°C，120小時(shí)菌絲長滿斜面，放置冷藏柜2-4°C存?zhèn)溆茫?(2) 二級(jí)搖瓶菌種培養(yǎng)基:葡萄糖 2%，酵母浸膏 O. 5%, KH2PO4 O. 2%, NaH2SO4 O. 15%,蛋白胨 O. 2%, VB1 O. 01%, ρΗ6· 5 ；取菌絲粗壯茂密的斜面菌種，在無菌條件下按I :4接種量接種，于26土1°C搖床培養(yǎng) 4飛天；結(jié)果菌液澄明，黃色，有濃水果香味，菌球呈放射狀；鏡檢美蘭單染色菌絲著色深，粗壯，分枝多，鎖狀聯(lián)合明顯可見；此時(shí)期正是菌絲發(fā)育的旺盛期(對(duì)數(shù)生長期)，又無雜菌污染，可轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)。
實(shí)施例I本發(fā)明膠囊劑的制備(O白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中；所述的大麥培養(yǎng)基是將重量比為95%的大麥粒浸泡，使含水量達(dá)到50%，加入重量比1%的石膏粉，重量比2%的蔗糖；(2)種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)在溫度26°C，空氣濕度70%環(huán)境下發(fā)酵7天；(3)發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度26°C，空氣濕度70%環(huán)境下發(fā)酵18天，得到白耙齒菌的菌質(zhì)；(4)該菌質(zhì)以90°C熱水提取3次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次I小時(shí)，合并濾液，濃縮成60°C時(shí)測相對(duì)密度I. 10的清膏，55°C減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入制備膠囊劑的輔料，按常規(guī)方法制備膠囊劑。
實(shí)施例2本發(fā)明片劑的制備(O白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中；所述的大麥培養(yǎng)基是將重量比為96%的大麥粒浸泡，使含水量達(dá)到53%,加入重量比I. 5%的石膏粉,重量比2. 5%的鹿糖；(2)種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)在溫度22°C，空氣濕度65%環(huán)境下發(fā)酵9天；(3)發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度22°C，空氣濕度65%環(huán)境下發(fā)酵21天，得到白耙齒菌的菌質(zhì)；(4)該菌質(zhì)以80°C熱水提取2次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并濾液，濃縮成60°C 時(shí)測相對(duì)密度1.05的清膏，50°C減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入制備片劑的輔料，按常規(guī)方法制備片劑。
實(shí)施例3本發(fā)明顆粒劑的制備(O白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中；所述的大麥培養(yǎng)基是將重量比為97%的大麥粒浸泡，使含水量達(dá)到55%,加入重量比2%的石膏粉,重量比3%的鹿糖；(2)種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)在溫度24°C，空氣濕度67%環(huán)境下發(fā)酵8天；(3)發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度24°C，空氣濕度67%環(huán)境下發(fā)酵20天，得到白耙齒菌的菌質(zhì)；(4)該菌質(zhì)以85°C熱水提取3次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次I小時(shí)，合并濾液，濃縮成60°C時(shí)測相對(duì)密度I. 08的清膏，52°C減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入制備顆粒劑的輔料，按常規(guī)方法制備顆粒劑。
本發(fā)明固體發(fā)酵白耙齒菌提取物制劑治療慢性腎小球腎炎的療效報(bào)告臨床資料凡具有慢性腎腎小球腎炎病史，24h尿蛋白定量O. 3 3g之間，Scr< 350umo/ L者列為研究對(duì)象，共觀察264例，其中住院病人120例，門診病人144 例，依其就診與住院次序，隨機(jī)分為治療組132例，對(duì)照組132例。排除標(biāo)準(zhǔn)(I)非妊娠婦女，非過敏體質(zhì)且對(duì)本藥無過敏者；(2)不合并心血管、肝、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)疾病者；(3)非精神病患者；(4)堅(jiān)持服藥治療者。本課題按上述標(biāo)準(zhǔn)選擇264例，治療組 132例，其中男性64例，女性68例，年齡在14 64歲之間，病程在4月 8年之間。 合并肌酐、尿素氮異常者56例；血色素降低者62例；高血壓者33例。對(duì)照組132例， 其中男性62例，女性70例，年齡在15 68歲之間，病程在6個(gè)月 7年之間。合并肌酐、尿素氮異常者44例；血色素降低者50例；高血壓者30例。兩組病例在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。
治療方法基礎(chǔ)治療(I)控制感染。(2)控制血壓。(3)有酸中毒者予糾正酸中毒。
治療組服用雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物制成的膠囊劑，每次2粒，每日3次，30天為I個(gè)療程，治療3個(gè)療程統(tǒng)計(jì)療效。
對(duì)照組服用液體發(fā)酵制劑即益腎康膠囊(長春益腎康生物制藥有限公司生產(chǎn))每次2粒，每日3次，30天為I個(gè)療程，治療3個(gè)療程統(tǒng)計(jì)療效。
觀察指標(biāo)主要癥狀變化包括腰膝酸軟，倦怠乏力，水腫，頭暈等。副作用出現(xiàn)情況包括胃脘不適，口干，納差，惡心等。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)治療前后做24h尿蛋白定量、 血肌酐、尿素氮、血紅蛋白等檢查。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料采用T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)。
療效標(biāo)準(zhǔn)痊愈水腫等癥狀及體征完全消失，尿蛋白檢查持續(xù)陰性，或24h尿蛋白定量持續(xù)小于200mg，高倍鏡下尿紅細(xì)胞消失。尿沉渣計(jì)數(shù)正常，腎功能恢復(fù)正常。 顯效水腫等癥狀及體征基本消失，尿蛋白檢查持續(xù)減少50%以上，高倍鏡下尿紅細(xì)胞不超過3個(gè)，尿沉洛計(jì)數(shù)接近正常。腎功能正?；蚧菊＃c正常值相差不超過15%。有效水腫等癥狀與體征明顯好轉(zhuǎn)，尿蛋白檢查持續(xù)減少I個(gè)+或24h尿蛋白定量持續(xù)減少25%以上，高倍鏡下尿紅細(xì)胞不超過5個(gè)，腎功能正?；蛴懈纳啤o效臨床表現(xiàn)與上述實(shí)驗(yàn)室檢查均無明顯改善或加重者。
治療結(jié)果I、兩組間療效比較本組264例，治療組132例，痊愈16例，顯效44例，有效 66例，無效6例，總有效率95. 4%。對(duì)照組132例，痊愈14例，顯效40例，有效 69例，無效9例，總有效率93. 1%。兩組總有效率比較P值大于O. 05，差異并未有非常顯著性意義。
2、兩組間治療前后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化情況見(表一)表2兩組患者治療如后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化6注與本組治療前相比* P< O. 01 * * P〈 O. 05與對(duì)照組治療后相比ΛΡ> O.053、副作用治療組用固體發(fā)酵制成的膠囊后出現(xiàn)3例胃脘不適，6例口干，2例出現(xiàn)納差，O例惡心癥狀。對(duì)照組液體發(fā)酵制成的膠囊(益腎康)40例胃脘不適，32例口干，20例出現(xiàn)納差，12例惡心癥狀。
結(jié)論雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物與液體發(fā)酵產(chǎn)物制劑均對(duì)腎小球腎炎有較好的療效，但液體發(fā)酵產(chǎn)物副作用較多，而雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物副作用較少，因此雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物制劑優(yōu)于液體發(fā)酵制劑。
權(quán)利要求
1.一種雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物，其特征在于它是由下列方法得到的(1)白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中；(2)種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)在溫度22°C-26°C，空氣濕度65%-70%環(huán)境下發(fā)酵7-9天；(3)發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度22°C-26°C，空氣濕度65%-70%環(huán)境下發(fā)酵18-21 天，得到白耙齒菌的菌質(zhì)；(4)該菌質(zhì)以80°C 90°C熱水提取2 3次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次I小時(shí)，合并濾液，濃縮成60°C時(shí)測相對(duì)密度I. 05^1. 10的清膏，50°C 55°C減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物，其特征在于所述的大麥培養(yǎng)基是將重量比為95%-97%的大麥粒浸泡，使含水量達(dá)到50-55%，加入重量比 1%_2%的石骨粉，重量比2%_3%的鹿糖。
3.如權(quán)利要求I所述的雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物的的制備方法，包括下列步驟(O白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中；(2)種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)在溫度22°C-26°C，空氣濕度65%-70%環(huán)境下發(fā)酵7-9天；(3)發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度22°C-26°C，空氣濕度65%-70%環(huán)境下發(fā)酵18-21 天，得到白耙齒菌的菌質(zhì)；(4)該菌質(zhì)以80°C 90°C熱水提取2 3次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次I小時(shí)，合并濾液，濃縮成60°C時(shí)測相對(duì)密度I. 05^1. 10的清膏，50°C 55°C減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物的制備方法，其特征在于所述的大麥培養(yǎng)基是將重量比為95%-97%的大麥粒浸泡，使含水量達(dá)到50-55%，加入重量比1%_2%的石膏粉,重量比2%-3%的鹿糖。
5.如權(quán)利要求I所述的雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物在制備治療慢性腎小球腎炎屬下焦?jié)駸嶙C者的藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙向性固體發(fā)酵白耙齒菌菌質(zhì)提取物及制備方法及其用途,屬于藥用真菌領(lǐng)域。白耙齒菌以母種進(jìn)行液體培養(yǎng)得到對(duì)數(shù)生長期的種子，將該種子在無菌條件下接種到有大麥培養(yǎng)基的種子瓶中，進(jìn)行種子瓶發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)以及提取。本發(fā)明具有治療腎小球腎炎的代謝物，同時(shí)通過白耙齒菌的生長和代謝，改變大麥原有的性能。
文檔編號(hào)A61K36/07GK102935095SQ20121046116
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者郭尚印 申請(qǐng)人:長春益腎康生物制藥有限公司