專利名稱：一種抗cd20單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥、單克隆抗體技術、抗體人源化技術等技術領域，具體地說是涉及一種單克隆抗體及其制備方法和用途，更具體地說是涉及一種用于抗CD20單克隆抗體及其制備方法和用途。
背景技術：
腫瘤的死亡率在全世界各種疾病的死亡率居榜首，惡性腫瘤已經成為嚴重影響人類健康和生命的殺手。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’ s Lymphoma，NHL)是常見惡性血液病之一，且是臨床最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，由B淋巴細胞惡性增長引起(B細胞來源約占85%)，好發(fā)于青壯年。近年來，NHL發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴重危害著人類健康。非霍奇金淋巴瘤的治療和診斷是近年來的一個研究熱點，其由B淋巴細胞惡性增長引 起(B細胞來源約占85%)，好發(fā)于青壯年。近年來，NHL發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴重危害著人類健康。但是，非霍奇金淋巴瘤的機制復雜，是多種因素相互、共同作用的結果，而單一機制的研究往往不能達到滿意的效果，因此多種機制的、多藥物聯(lián)合運用的綜合性研究有待進一步開展。由B細胞和其對應惡性腫瘤表達的細胞表面分子是免疫治療的重要靶標。MS4A基因家族的B細胞特異成員CD20在未成熟和成熟B細胞以及其對應的惡性腫瘤的表達(Tedder and Engel (1994) Tmmunol. Today 15:450-454)。多數的人 B 細胞譜系惡性腫瘤表達CD20 (Anderson等，Blood，198463 :1424)。近年來針對多種惡性腫瘤表面細胞表面抗原標志物的靶向性治療取得巨大進步，應用單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤的臨床結果取得重大進展，使得針對CD20的單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤成為發(fā)展前景良好的一種新型抗腫瘤方法?？笴D20單克隆抗體是治療B淋巴瘤的最有效的治療藥物，在治療NHL中有極其重要的地位。⑶20是一種分子量為33 37kD的磷酸化蛋白質分子(⑶20分子結構示意圖見圖I，其中)，是B淋巴細胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴細胞表面，即B淋巴細胞表面分化抗原，而在其他組織以及多能B淋巴干細胞均不表達。它主要參與調節(jié)B淋巴細胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)起重要作用，CD20從前-B淋巴細胞階段開始表達，直到漿細胞階段才無 CD20 表達(Stashenko p. , Nsdler LM, Hardy R, et al. Characterization of ahuman Blymphocyte-specific antigen. J. Immun. 1980 ;125 :1678_1685)。CD20 和抗 CD20抗體結合后不發(fā)生內吞作用，因而細胞表面CD20數量并不因為抗體的結合而減少，在人體血清中無游離的⑶20存在。⑶20抗原高表達于超過95%的正?；驉夯腂淋巴瘤細胞，沒有顯著內吞和脫落(Press Off, Farr AG, Borroz KI et al. Endocytosis and Degradationof Monoclonal Antibodies Targeting Human B-Cell Malignancies. Cancer Resl989 ；49 :4906-4912),因此CD20是治療B淋巴細胞瘤的理想靶點。經FDA 批準上市用于治療 NHL 的 CD20 單抗有 Rituximab、Zevalin、Bexxar等，Rituximab (利妥昔單抗，商品名Rituximab ;后簡稱“Rituximab”)是第一個是上市的抗CD20單克隆抗體類藥物，是一種嵌合體人IgGl抗人CD20單克隆抗體，能高效誘導補體(C )激活的經典途徑和對新鮮分離的淋巴瘤細胞和B細胞系的補體依賴的細胞毒性(Reff 等，Blood, 1994,83 :435-445 ；Golay 等，Blood,98 :3383-3389 ；Cragg等 Blood，2003，101 :1045-1052 ;Di Gaetano 等 J.Immunl. 2003，171:1581-1587;Bellosillo 等，Blood,2001,98 :2771_2777)。 Rituximab 還在病人(van der Klok 等，Br. J. HematoI. 2001，115:807-811)和靈長類(Kennedy 等，Blood, 2003,101 :1071-1079)體內激活補體。此外，包括CD59在內的補體調解蛋白的腫瘤細胞中的表達和抗CD20治療的抗性相關(Golay 等，Blood, 98 :3383-3389 ；Treon 等 J. Immunotheraphy, 200124:263-271)ο雖然許多人認為補體依賴的細胞毒性是Rituximab在體外(invitro)和體內消除人淋巴瘤細胞中所使用的主要用途(Golay等，Blood,98 :3383-3389 ;Cragg等Blood，2003,101 :1045-1052 ；Di Gaetano 等 J. Immunl. 2003，171:1581-1587; Golay 等，Blood，95 3900-3908 ；Di Gaetano 等 J. HematoI.2001，114:800-809;Weiner Blood2003,101 :788),但是其他人發(fā)現，根據腫瘤細胞對補體介導裂解的易感性以及補體抑制劑CD46、CD55和0)59在腫瘤細胞上的表達不能預測Rituximab的治療效果(Weng和Levy, Blood, 2001,98 :1352-1357)。因為與臨床使用的同種型不同的嵌合體抗CD20單克隆抗體不能在非人或靈長類中消除正常的 B 細胞(Anderson 等，Biochem. Soc. Transac. ,1997,25 :705-708 ),并且抗⑶20單克隆抗體的抗腫瘤效應部分地依賴通過IgG的Fe受體(Fe Y R)的免疫激活(Clynes等，Nature Med. , 2000,6 :443-446),所以其他的抗體依賴作用也是重要的。單獨使用Rituximab治療復發(fā)以及難治的非霍奇金淋巴瘤有效率達50%左右，若與化療藥物聯(lián)用，則有效率可達90-100%。同時，Rituximab會帶來一系列的不良反應，諸如脫發(fā)、惡心、嘔吐、血細胞減少等，且又輕微的發(fā)熱、寒顫等。但Rituximab仍由其在治療非霍奇金淋巴瘤上表現的良好療效和低毒副作用，已成為美國銷售額最大的抗腫瘤藥物之一，2008年銷售額近30億，年增長率14%。但這些藥物治療費用較高，致使我國很多患者難以接受治療。因此，研究療效好、治療成本低的藥物對提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活質量具有重大意義。此外，研發(fā)對人免疫原性更小，表達量更高，以及具有其他優(yōu)良特性的抗CD20單克隆抗體或多克隆抗體，更成為目前的研究重點。因此，研制抗⑶20等方面的產品，特別是藥物，意義重大，并具有顯著的社會效益和經濟效益。

發(fā)明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種人源化抗CD20的單克隆抗體及其制備方法和用途。為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下一種人源化抗⑶20單克隆抗體，其中重鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列VH =SEQID N0. 5 ;輕鏈可變區(qū)具有下列氨基酸序列VL SEQ ID N0. 7。優(yōu)選地，上述人源化抗⑶20單克隆抗體重鏈可變區(qū)具有SEQ ID:N0. 6所示氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0. 8所示氨基酸序列。本發(fā)明還提供了抗CD20單克隆抗體的氨基酸序列及其其可變區(qū)鏈，以及具有這些鏈的其他蛋白質或融合表達產物，具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯(lián)物及融合表達產物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達產物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性?？贵w的抗原結構特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3各特定的區(qū)域來描述，成為互補決定區(qū)(complementarity determining region, Q)R),將該段間隔成4各框架區(qū)域(FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些⑶R形成環(huán)狀結構，通過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應輕鏈上的⑶R構成了抗體的抗原結合位點。本領域技術人員通過常規(guī)方法分析將本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈序列(SEQID NO: I和SEQ ID NO: 3)，可確定其⑶R區(qū)。本發(fā)明還包括這些⑶R區(qū)完全相同的抗體重鏈和抗體輕鏈，以及由所述重鏈和輕鏈構成的抗體。此外，最近還發(fā)現由輕鏈可變區(qū)構成的相關結構，與相應的重鏈可變區(qū)相比，其結合的動力學較小，分離的重鏈可變區(qū)域自身具有抗原結合活性。 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體，可用于本發(fā)明的形成嵌合抗體的技術是本領域公知的，以及抗體與藥物、毒素、細胞因子、放射性核素或酶等偶聯(lián)，組成免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通?？捎肞RC擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短室。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。獲得有關序列后，即可用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。一種制備上述單克隆抗體的方法，包括通過計算機輔助設計出人源化抗體BB3⑶20-7的氨基酸序列，全基因合成BD31-7的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因并經基因重組分別與人免疫球蛋白重、輕鏈恒定區(qū)基因拼接，克隆到真核表達載體中，分別構建人源化抗體的輕、重鏈表達載體，然后將輕、重鏈表達載體用脂質體法共轉染CHO細胞，然后進行篩選、培養(yǎng)純化即得本發(fā)明的抗人⑶20的人源化抗體BD31-7。本發(fā)明中所述的“核酸分子”指聚核苷酸，例如脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，還包括由核苷酸類似物形成的DNA或RNA的等效物、類似物，單鏈(有義鏈或反義鏈)和雙鏈聚核苷酸。該術語還包括同源序列。對本領域技術人員來說，很顯然，任意一種上述形式的核酸分子都當然地涵蓋了該“核酸分子”的所有上述等效形式。此外，目前已可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列，然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。上述的宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物稀薄。代表例有大腸桿菌、鏈霉菌屬、鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞、真菌細胞如酵母、果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞、CH0、C0S7或293細胞的動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主細胞為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收貨，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域中公知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可以用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據所用的訴諸細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選用各種常規(guī)的培養(yǎng)基。在適合宿主細胞生長的條件下培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉化或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上述方法中的重組多肽可在細胞內、或細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的其他特性通過各種分離方法分離純化重組的蛋白。這些方法是 本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其他各種液相層析技術及這些方法的結合。一種上述單克隆抗體的用途，是作為活性成分用于制備治療非霍奇金淋巴瘤的藥物或用于制備診斷惡性B細胞淋巴瘤的試劑。作為進一步優(yōu)選方案，是作為活性成分用于制備治療于非霍奇金淋巴瘤、類風濕性關節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少紫癜和溶血性貧血以及其他免疫介導的疾病的藥物，最優(yōu)為非霍奇金淋巴瘤。本發(fā)明還提供了一種治療非霍奇金淋巴瘤的藥物組合物，其含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配置于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常為5-8，較佳的pH為6-8，盡管pH值可隨被配制物的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內、靜脈內、或局部給藥。本發(fā)明藥物組合物的制備方法可以是將現有的市售可得的上述化合物，或從生物中提取的含上述化合物的提取物，按配比，采用本領域的常規(guī)方法獲得，即得所述的抗CD20單克隆抗體組合物。本發(fā)明中述及的各原料或試劑均市售可得。在具體使用方面，本發(fā)明所述的抗CD20單克隆抗體組合物能夠單獨直接使用，還能夠與其他許多化學物質一起使用。無論這些化學物質是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，包括輔助功能如協(xié)同放大作用、拮抗或緩解抗CD20單克隆抗體組合物的副作用等，這些化學物質是包括醫(yī)藥學上可接受的載體、天然產物、化學合成藥物或人類用藥等中的一種或多種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學上可接受的載體等中的一種或多種。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的單克隆抗體的藥物組合物，以及藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑。這類載體包括，但不限于任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。醫(yī)藥學上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、緩沖液、葡萄糖、甘油或乙醇等及其組合物中的一種或多種。例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。
如本文所用，術語“抗⑶20的特異性單克隆抗體”、“抗⑶20單抗”、“⑶20單抗”、“CD20抗體”等可互換使用，都是指由抗體重鏈元件的氨基酸序列和抗體輕鏈元件的氨基酸序列構成的抗體；該術語還包括與GST等形成的融合蛋白，只要在該融合蛋白中抗體部分仍然保留與CD20的結合活性。所述“藥學上可接受的載體”包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。藥學上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其組合物中的一種或多種。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉等中的一種或多種。藥學上可接受載體還可以包含少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等中的一種或多種，它們增強了該抗補體或抗氧化組合物的有效期或效力。從具體的分類上看，所說的藥學上可接受的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，包括潤滑劑，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸鎂等中的一種或多種；崩解劑，如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉或低取代羥丙纖維素等中的一種或多種；填充劑，如淀粉、糊精或乳糖等中的 一種或多種；粘合劑，如預膠化淀粉、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基纖維素等中的一種或多種；滲透壓調節(jié)劑，如氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一種或多種；pH調節(jié)劑，如鹽酸、氫氧化鈉等酸或堿中的一種或多種；溶齊U，如水、緩沖液、乙醇或丙二醇等中的一種或多種等；抗氧劑和絡合劑，如亞硫酸鈉、EDTA等中的一種或多種；表面活性劑，如季銨化合物、十六烷醇等；吸附載體，如高嶺土或皂粘土等中的一種或多種；高分子骨架劑，如環(huán)糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一種或多種；稀釋劑如淀粉、糖粉、糊精、微晶纖維素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一種或多種；穩(wěn)定劑如羧甲基纖維素鈉或環(huán)糊精等中的一種或多種；防腐劑如對羥基苯甲酸乙酯或苯甲酸鈉等中的一種或多種。另外，還可以在該藥物組合物中加入其他輔助劑，如香味劑和/或甜味劑如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一種或多種。相比現有技術，本發(fā)明具有如下的顯著效果本發(fā)明有針對性地研究⑶20單克隆抗體，發(fā)現了一種新的抗⑶20單克隆抗體組合物，作出了意想不到的成績；同時，本發(fā)明也有針對性地研究抗CD20單克隆抗體組合物的活性，其藥理作用較強，使用安全，最大限度地發(fā)揮了作用。本發(fā)明對抗CD20單克隆抗體組合物拓展了新的醫(yī)藥用途，也為診斷、檢測、保護、治療和研究抗CD20單克隆抗體提供了一種新的藥物來源。該藥物組合物用于治療B細胞誘導的惡性腫瘤、特別是非霍奇金淋巴瘤，可顯著殺傷B淋巴瘤細胞，治療效果顯著，且毒副作用小，克服了現有的常用藥物造成的副作用。本發(fā)明也為治療和診斷B細胞誘導的惡性腫瘤提供了一種新的藥物手段。本發(fā)明的抗CD20單克隆抗體組合物藥理作用較強，效果明顯?？傊?，本發(fā)明積極適應了現代醫(yī)療和科研領域的工作需要和人性化服務的需要，為研究開發(fā)新的抗CD20單克隆抗體產品提供了新的藥物和制劑來源，對開發(fā)利用中國現有藥物具有重要價值，是用于診斷、檢測、保護、治療和研究B細胞惡性腫瘤等方面的安全來源，對改進和提高現有的醫(yī)療水平具有重要價值。


圖I為⑶20分子的結構示意圖，其中圖I (A)為⑶20的三種拓撲結構，圖I (B)為CD20分子的跨膜結構；圖2體現了單克隆抗體BD31-7對Dauli細胞的ADCC實驗結果；圖3體現了單克隆抗體BD31-7對Raji細胞的ADCC實驗結果；圖4體現了單克隆抗體BD31-7對Dauli細胞的⑶C實驗結果；圖5體現了單克隆抗體BD31-7對Raji細胞的⑶C實驗結果；圖6體現了單克隆抗體BD31-7誘導Dauli細胞凋亡實驗結果；圖7體現了單克隆抗體BD31-7誘導Raji細胞凋亡實驗結果。
具體實施例方式下面結合實施例及對比例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。應理解，下述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Smabrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。以下實施例的實驗中所用到的動物、儀器設備、試劑及其配制等均是來自市售。Raji (人 B 淋巴瘤細胞，ATCC，CCL-86)pGEM-T載體，美國Promega公司產品pcDNA3. I (+)，美國 Invitrogen 公司產品T4DNA連接酶，美國Invitrogen公司產品pcDNA3. I/ZEO(+)載體，美國 Invitrogen 公司產品C0S-1 細胞(ATCC CRL 1650)CHO-Kl 細胞(ATCC CRL-9618)pGEM-T easy 載體，Promega 公司產品Human myeloma IgGl, K, Sigma 公司產品HRP-羊抗人 kappa, Southern Biotechnology Associates 公司產品Human IgG為抗人her2的人源化抗體trastuzumab, Roche公司產品Rituximab, Roche 公司產品Daudi (人 B 淋巴瘤細胞，ATCC, CCL-213)人抗體輕、重鏈恒定區(qū)基因的克隆用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術發(fā)展公司產品)分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)提取總RNA，根據文獻(Cell, 1980, 22 =197-207)和文獻(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)報道昀序列分別設計引物采用 RT-PCR 反應擴增抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2分別顯示了重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T / CH和pGEM-T /CL。
實施例I小鼠單克隆抗體的制備和篩選(I)抗原的制備人B淋巴細胞特異性膜抗原⑶20基因通過PCR從人基因轉錄組中擴增獲得，引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下GSP1-H，5，-ACC TGG GTAGGT GCG GAC ACC ACT-3，；GSP2-H，5，-CAC ACT TTC ACG TCAAGG ACA-3，；GSP3-H，5，-CTT GTC CAG GGA TCC TAG AGT-3，；GSP1-L，5，-TTG CAG TCC TGA TCA GGC CAA CT-3，；GSP2-L，5，-TGT CGT GCA CTG GCAACA ATC TT-3，
GSP3-L，5，-TTG TTC ATG AAG CTC AAG GCT GA-3，。利用BamHI和Xho I雙酶切，將基因片段連入原核表達載體pGEM_T (美國Promega公司產品)，PCR和雙酶切鑒定陽性克隆后測序，序列測定正確后，提取質粒。原核表達載體PGEM-CD20轉化Rosetta菌株，在IOOml LB培養(yǎng)基中，0D600達到約O. 5時，ImM IPTG誘導表達4小時，⑶20蛋白形成包涵體。超聲破菌后，用IXSDS上樣緩沖液溶解包涵體，測定靶蛋白的表達量。將制備好的CD20蛋白進行SDS-PAGE電泳，割膠純化蛋白。(2)小鼠的免疫將純化后的⑶20蛋白溶解在1XPBS，取適量的蛋白溶液與弗氏完全佐劑(Sigma)混勻乳化，取8周齡的BALB/c雌鼠，皮下多點注射抗原。2周后，取適量的蛋自溶液與弗氏不完全佐劑(Sigma)混勻乳化，在小鼠的皮下，進行第二次免疫。以后每隔3周，進行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾臟進行細胞融合。(3)細胞融合和陽性克隆的篩選引頸處死小鼠，用70%酒精消毒其體表。無菌條件下取出脾臟，在滅菌不銹鋼網中，用注射器向脾臟內注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復抽吸數次獲得細胞懸液，將細胞懸液注Λ 50ml離心管中，加入20ml無血清培養(yǎng)液,輕輕吹打數次，1000rpm/min離心。用無血清培養(yǎng)液將細胞重懸，與小鼠骨髓瘤細胞SP210以適當比例輕輕混勻，在37°C水浴鍋中加入PEG1400，水浴I. 5min。加入無血清培養(yǎng)液35ml，離心。沉淀用含有20%FCS的RPM1-1640重懸，每孔200uL均分到96孔細胞培養(yǎng)板，放入37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，力口入選擇培養(yǎng)液HAT，每3天換一次新鮮培養(yǎng)液。14天后，取細胞培養(yǎng)上清，ELISA鑒定出陽性克隆。多次進行亞克隆鑒定陽性克隆細胞成系，繼續(xù)體外培養(yǎng)6個月。選出7株高效表達細胞株，分別命名為31-1、31-2、31-3、31-4、31-5、31-6、31-7。(4)單克隆抗體的鑒定血清I :1000-1 :50000稀釋，IOOng CD20上樣，進行Western Blot分析抗體的特異性。將⑶20基因通過TOPO克隆方法連入表達載體pLentl7. 3/V5-T0P0,真核表達載體pLentl7. 3/V5-CD20 利用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)介導瞬時轉染 293T 細胞，血清I :100稀釋，進行免疫熒光鑒定抗體。測定可知，21-7細胞株的抗體特異性最好，且能識別細胞內源表達的抗原。(5)單克隆抗體可變區(qū)序列的獲得利用Trizol(Invitrogen)法提取雜交瘤細胞株21_7的總RNA,然后用oligo-dT引物和 SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)反轉錄成 cDNA。根據小鼠抗體重鏈和輕鏈的FRl區(qū)氨基酸序列，合成兼并的寡核苷酸引物，用作正同引物。反向引物根據小鼠抗體的恒定區(qū)設計，可將全部的可變區(qū)擴增得到。PCR反應完成后，分別將抗體重鏈和輕鏈的DNA片段連于TA克隆載體，挑取克隆進行測序。所得抗體序列如下重鏈可變區(qū)核酸序列CAGGTACAACTACAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTTTCACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACAAGGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCA ；重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGFTSYNQKFKGKAT LTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYKGGDWYFNVWGAGTTVTVSA ；輕鏈可變區(qū)核酸序列CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTCGCCCACCCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAGA TCAAA ；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQffTSRPPTFGGGTKLEIK。實施例2鼠單克隆抗體的人源化和表達純化(I)鼠單克隆抗體的人源化將小鼠的抗體氨基酸序列與人抗體氨基酸序列進行比對，獲得最高同源序列的人亞類共有序列的架構，即人輕鏈VL K亞組II (VL K II)和重鏈VH亞組I (VHI)，作為人源化構架。按照kabat等人的定義將L鏈的CDRl :24_34，CDR2 =50-56,CDR3 :89-97 ;H 鏈的 CDRl :26-35, CDR2:50-65，CDR3:95-102(sequences of proteinsof immunological Interest, (5th), Public Health Service, National Institutesof Heal th，Be the sda，MD (1991)。利用計算機構建鼠單克隆抗體VL-VH區(qū)的立體圖模型(Carter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :4285-4289 (1992) Eigenbrot. J. Mol. Biol. >229 969-995(1993))，確定將哪些鼠抗體構架區(qū)殘基引入人源化抗體。其中重鏈除⑶R1，⑶R2，⑶R3外，在H73位點人源化構架改用鼠抗體氨基酸，輕鏈⑶RL1，⑶RL2，⑶RL3使用鼠抗體氨基酸序列。(2)人源化抗體IgG的構建和表達純化人源化抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)核苷酸序列全基因合成后，分別克隆入載體AbVecl-hlgGl, AbVecl-hlgKappa。轉化DH5Q,提取陽性克隆質粒。利用轉染試劑Lipofectamine2000 (Invitrogen),將構建好的質粒共轉染人293A細胞。培養(yǎng)24h后，DMEM培養(yǎng)基被換成基本培養(yǎng)基，并在5天之內每天收獲上清。上清合并以后用ProteinA-Sepharose CL-4B (Amersham)純化抗體，并用SDS-PAGE電泳鑒定。經過親和層析的鑒定產物再次通過分子篩層析，獲得高純度的單抗，然后利用EZQProteinQuantitation Kit (Invitrogen)對抗體定量，以進行下一步的實驗。
實施例3人源化單克隆抗體⑶20親和力分析Scatchard法測定單克隆抗體31-7、BD31_7、Rituximab的親和力。表I顯示了測定的結果，實驗結果說明兩株單克隆抗體與VEGF有較強的結合親和力。表I單克隆抗體親和力結果
權利要求
1.一種人源化抗CD20單克隆抗體，其特征在于其重鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列VH SEQ ID N0. 6 ;輕鏈可變區(qū)具有下列氨基酸序列VL SEQ ID N0. 8。
2.一種分離的核酸分子，其特征在于所述核酸分子含有SEQ ID NO. 5所示的編碼所述單克隆抗體可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO. 7所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述核酸分子，其特征在于它編碼權利要求I所述的單克隆抗體。
4.一種藥物組合物，其特征在于它以權利要求I 3所述的人源化抗CD20單克隆抗體作為主要有效組分和藥學上可接受的載體。
一種制備權利要求I所述的人源化抗CD20單克隆抗體的方法，其特征在于在宿主細胞中表達權利要求2所述的核酸分子，以及從宿主細胞培養(yǎng)物中分離純化抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源化抗CD20單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列VHSEQ IDNO.6；輕鏈可變區(qū)具有下列氨基酸序列VLSEQ IDNO.8。本發(fā)明還包含了所述單克隆抗體在研究及診斷治療方面的應用。本發(fā)明提供的高特異性的人源化抗CD20單克隆抗體，所述單抗與陽性藥物相比藥效更佳且制備工藝簡便，成本更低，為癌癥以及眼科疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準確、簡便、有效的監(jiān)測手段，具有廣泛的應用范圍和社會需求?？傊景l(fā)明積極適應了現代生物、預防保健、臨床診斷等領域的工作需要和人性化服務的需要，本發(fā)明為研究開發(fā)該人源化抗CD20單克隆抗體，為我國醫(yī)藥市場提供一種性價比更高的治療藥物，因此具有十分廣闊的應用前景。
文檔編號A61P35/00GK102863531SQ20121027060
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權日2012年7月31日
發(fā)明者張愛暉 申請人:張愛暉