專利名稱：一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體為一種抗癌藥物復合物，尤其是一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物及制備方法和應用。
背景技術：
癌癥是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，有效地治療癌癥一直是世界矚目的研究課題。反義核酸技術是近年發(fā)展的一種基因治療腫瘤的有效方法，它以腫瘤發(fā)生相關基因為靶點，通過人工合成的反義寡核苷酸與之特異性互補結合，抑制靶向基因的表達而導 致腫瘤細胞凋亡，具有高選擇性、高效率、低毒性等特點。但是由于單純的反義寡聚核苷酸很難進入腫瘤細胞或被降解而達不到治療效果。研究表明通過選擇合適的藥物載體輸送，可大大提高治療惡性腫瘤的效果。因此，發(fā)展高效安全的基因載體系統(tǒng)在生物醫(yī)學領域中具有重要意義。納米級羥基磷灰石具有良好的生物相容性，生物降解性和生物可吸收性并且無毒副作用，是發(fā)展新一代高效高性能藥物前提，為治療癌癥這一人類重大疾病提供重要的理論和實驗基礎。近年來納米磷酸鈣的制備方法主要包括水熱合成法、溶膠凝膠法、化學沉淀法和微乳法等，其中，微乳法的微乳液結構限制了顆粒的大小，使納米微粒的制備成為可能。納米微粒的制備通常是將兩種確定的微乳體系通過混合實現(xiàn)的。含有反應物A，B的兩個微乳液經(jīng)過混合、相互的碰撞或聚結、反應成核和生長等形成納米微粒。當水核內(nèi)的微粒長到最后尺寸，表面活性劑分子將附著在微粒的表面，使微粒穩(wěn)定并防止其進一步長大，最終形成的微粒粒徑受到形成的水核大小調(diào)控，控制其達到合適的尺寸。多孔的磷酸鈣納米粒子在藥物載體上的應用具有如下優(yōu)點1)磷酸鈣納米粒子具有良好的生物相容性，對生物體系的毒性??；2)制備的磷酸鈣納米粒子具有有序的孔道，因而具有較大的比表面積，為藥物、蛋白質、DNA及核酸等提供了更多的負載空間，大大提聞負載量；生存素(survivin)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效應蛋白酶caspase3和caspase7來介導凋亡的抑制。在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達豐富，但在相應正常組織中不表達，這種選擇性表達特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點。而針對生存素(survivin)基因作為藥物治療靶點，負載其反義寡聚核苷酸的多孔磷酸鈣納米粒子藥物復合物未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物及其制備方法。本發(fā)明的另一目的，在于將上述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物用于制備治療宮頸癌的藥物。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術解決方案是ー種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物，含有生存素反義寡聚核苷酸或者帶熒光標記生存素反義寡聚核苷酸，粒徑為30 60nm。ー種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的制備，其特征在于包括以下步驟(I)將微乳液I和微乳液II以2000 4000rpm速度攪拌3 7min ;兩者體積比為 I : O. 8 I : I. 2 ;微乳液I以こニ醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有O. 3 O. 5μ g/mL生存素 ASODNs 或 6’-fam-生存素 AS0DNs、l 3mmol/L Na2HPO4 和 O. I O. 25mmol/L 硅酸鈉；こニ醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4 ;制備方法為，將含有生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、Na2HPO4、成核劑硅酸鈉的水溶液與こニ醇丁醚、環(huán)己烷混合均勻；微乳液II以こニ醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有氯化鈣；微乳液II中氯化鈣含量為2 4mmol/L;こニ醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4;制備方法為，將氯化鈣水溶液與こニ醇丁醚和環(huán)己烷混合均勻；Na2HPO4與氯化鈣的摩爾比為I : I I : 2 ;生存素ASODNs或6’ -fam-生存素ASODNs與氯化鈣的用量比為150 200 μ g/mmol。(2)繼續(xù)反應2 3min，加入分散劑檸檬酸鈉繼續(xù)反應10 12min ;檸檬酸在總反應體系中含量為O. 005 O. 01mmol/L ；(3)離心取沉淀洗滌。通過上述反相微乳法制備得到的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物，可介導反義寡聚核苷酸進入細胞，具有較高的細胞轉染率，尤其是體外Hela宮頸癌細胞。顯著提高反義核酸促進腫瘤細胞凋亡效率，增強其抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物，尤其是治療宮頸癌的藥物。采用上述技術方案后，本發(fā)明的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的制備及應用具有以下優(yōu)點I、制備方法簡單、快速，可靠；2、該復合物具有轉染率高、靶向性強，抑制腫瘤細胞效果明顯；3、對不同的生物體系以多孔磷酸鈣納米粒子為載體輸送不同的靶向性生物分子或藥物為其它腫瘤或疾病的治療提供了一條新途徑。


圖I為多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡糖核苷酸藥物復合物的 Μ圖，插圖為局部放大的納米粒子。圖2為多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物隨時間的溶解緩釋響應。圖3帶有FAM熒光素標記的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物和Hela細胞孵育4小時后流式細胞儀測定其轉染率圖，未處理的Hela細胞作為對照。圖4為采用噻唑藍法分別檢測多孔磷酸鈣納米粒子、裸露的反義寡聚核苷酸、多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物對Hela細胞孵育不同時間(24、48、72小時)后的細胞抑制率示意圖，未處理的Hela細胞作為對照(圖中柱狀圖從左至右依次為未處理的Hela細胞、裸露的反義寡聚核苷酸、多孔磷酸鈣納米粒子和多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物)。圖5為多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物孵育4小時的HeLa細胞生物TEM圖。
具體實施例方式以下結合實施例及其附圖對本發(fā)明作更進ー步說明。實施例I本發(fā)明的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的制備，其特征在于包括以下步驟a、將預先配制的 50 μ L 120 μ g/mL ASODNs 或 6’ -fam-ASODNs 溶液，650 μ L0. 03mol/L Na2HPO4溶液(含0. 004mol/L硅酸鈉作為成核劑)，4mLこニ醇丁醚和IOmL環(huán)己燒混合均勻制成微乳液I,同時將650 μ L O. 05mol/L CaCl2,4mLこニ醇丁醚和IOmL環(huán)己烷混合均勻制成微乳液II ；b、在室溫條件下，將兩種微乳液在機械攪拌條件下強力攪拌5分鐘使微乳液達到平衡后，進行快速混合形成微乳混合液。2-3分鐘反應后，加入225 μ L0. OOlmol/L檸檬酸鈉作為分散劑繼續(xù)進行反應10-12分鐘；C、反應完成后將微乳混合液轉至50mL離心管中在離心機轉速14000rpm下離心15分鐘。離心后，移去離心管中的上清液，將沉淀物用95%こ醇洗滌兩次除去有機殘液后再用pH7. 4PBS洗滌兩次以除去剰余的こ醇殘液；d、最后將沉淀物用25mL PBS溶解定容后即可得到分散的反義寡聚核苷酸-多孔磷酸鈣納米粒子(ASODNs-CP)溶液；圖I為本發(fā)明實施例的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的透射電鏡圖，從電鏡圖來看，其粒徑為30 60nm。產(chǎn)品隨時間的溶解緩釋響應如圖2所示。
本發(fā)明采用反相微乳法制備多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸，構建成ー種新型多孔磷酸鈣納米粒子反義寡聚核苷酸復合體。該復合體作用于體外培養(yǎng)的Hela宮頸癌細胞，可有效地介導反義核酸進入細胞，具有較高的細胞轉染率，并且顯著提高反義核酸促進腫瘤細胞凋亡效率，增強其抗腫瘤活性。實施例2多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的細胞轉染率的測定用帶有FAM熒光素標記的反義寡聚核苷酸取代單純的反義寡聚核苷酸制備多孔磷酸鈣納米粒子反義核酸復合體來考察該藥物復合物的細胞轉染率。將帶有FAM熒光素標記的多孔磷酸鈣納米粒子反義核酸復合體加入到對數(shù)生長期的Hela細胞中，在37°C 5%CO2飽和溫度下培養(yǎng)4小吋。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的Hela細胞，作為陰性對照。胰酶消化后，用70%的こ醇固定。用流式細胞儀檢測它們的轉染率，結果如圖3。該復合藥物的轉染率可以達到98%以上，說明多孔磷酸鈣納米粒子可以作為一種很好的藥物載體應用于生物領域。Hela宮頸癌細胞的培養(yǎng)
Hela宮頸癌細胞株購買自中科院細胞庫。Hela細胞在含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基，37°C 5% C02飽和溫度下培養(yǎng)，實驗選用對數(shù)生長期細胞。細胞抑制率的測定將多孔磷酸鈣納米粒子(CP)，裸露的反義寡聚核苷酸(naked ASODNs)和多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸(CP-ASODNs)分別加入到對數(shù)生長期的Hela細胞中，在370C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)24h。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的Hela細胞，作為陰性對照，通過噻唑藍法(MTT)檢測細胞的抑制率。結果如圖4所示，與裸露的反義寡聚核苷酸相比，多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物可明顯提高反義寡聚核苷酸的抑制腫瘤細胞的效率。裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細胞抑制率為5%，而多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的腫瘤細胞抑制率達到22%。實施例3多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的應用除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)48h，其余同實施例2，結果如圖4。裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細胞抑制率為7%，多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的腫瘤細胞抑制率達到40%。實施例4除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)72h，其余同實施例2，結果如圖4。裸露的反義寡聚核苷酸對腫瘤細胞的抑制率為9 %，多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復合物的腫瘤細胞抑制率達到50%。實施例5多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸在HeLa細胞中實際分布情況。對反義寡聚核苷酸-磷酸鈣納米粒子在HeLa細胞中實際分布情況亦可用生物電鏡(Biological TEM)進行檢測，用反義寡聚核苷酸-磷酸I丐納米粒子(fam-ASODNs-CP)的轉染液對HeLa細胞進行孵育4小時后，經(jīng)胰蛋白酶消化及生物切片固定后，切片進行檢測。黑色箭頭指向的就是合成的ASODNs-CP納米粒子，圖5中亦可以清晰地看出納米粒子可以通過細胞的內(nèi)吞作用轉染進入細胞質，而且部分可以到達細胞核的周圍，這是由于反義寡聚核酸對細胞核的靶向作用，透射電鏡圖表征結果證實了制備的ASODNs-CP納米粒子可以轉染進入細胞內(nèi)部，部分可到達細胞核周圍。以上實施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對本發(fā)明的限制，有關技術領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換或變化。因此，所有等同的技術方案也應該屬于本發(fā)明的范疇，應由各權利要求限定。權利要求
1.一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物，其特征在于，以多孔磷酸鈣納米粒子為載體，負載生存素反義寡聚核苷酸或者帶熒光標記生存素反義寡聚核苷酸，粒徑為 30 60nm。
2.權利要求I所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將微乳液I和微乳液II以2000 4000rpm速度攪拌3 7min； 微乳液I以乙二醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有O. 3 O. 5μ g/mL生存素ASODNs 或 6，-fam-生存素 ASODNsU 3mmol/L Na2HPO4 和 O. I O. 25mmol/L 硅酸鈉；乙二醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4; 微乳液II以乙二醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有氯化鈣；微乳液II中氯化鈣含量為2 4mmol/L ;乙二醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4 ; Na2HPO4與氯化鈣的摩爾比為I : I I : 2 ;生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs與氯化鈣的用量比為150 200μ g/mmol。
(2)繼續(xù)反應2 3min，加入分散劑檸檬酸鈉繼續(xù)反應10 12min;檸檬酸在總反應體系中含量為O. 005 O. 01mmol/L ； (3)離心取沉淀洗滌。
3.權利要求2所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中微乳液I與微乳液II體積比為I : O. 8 I : I. 2。
4.權利要求2所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中微乳液I制備方法為，將含有生存素ASODNs或6’ -fam-生存素ASODNs、Na2HPO4、成核劑硅酸鈉的水溶液與乙二醇丁醚、環(huán)己烷混合均勻。
5.權利要求2所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中微乳液II制備方法為，制備方法為，將氯化鈣水溶液與乙二醇丁醚和環(huán)己烷混合均勻。
6.權利要求I所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
7.權利要求I所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物在制備治療宮頸癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，公開了一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復合物以多孔磷酸鈣納米粒子為載體，負載生存素反義寡聚核苷酸或者帶熒光標記生存素反義寡聚核苷酸，粒徑為30～60nm。通過反相微乳法制備的上述復合物，可介導反義寡聚核苷酸進入細胞，具有較高的細胞轉染率，尤其是體外Hela宮頸癌細胞。顯著提高反義核酸促進腫瘤細胞凋亡效率，增強其抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物，尤其是治療宮頸癌的藥物，制備方法簡單快速。
文檔編號A61K48/00GK102631686SQ201210114798
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權日2012年4月18日
發(fā)明者侯生磊, 賈能勤, 馬紅美 申請人:上海師范大學