專利名稱：多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物組織和器官的人工制造技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用合成高分子材料、細(xì)胞基質(zhì)材料制備組織器官前體的工藝方法，屬于生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界上每年患有組織缺損或器官衰竭的病人數(shù)逾千萬(wàn)。然而，活體供體器官有限，現(xiàn)有的機(jī)械裝置不具備器官的所有功能，不能防止患者的病情進(jìn)一步惡化。據(jù)此，以提高此類疾患治療水平為宗旨的組織工程(Tissue Engineering)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。組織工程學(xué)是由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金委員會(huì)于1987年正式提出和確定的，是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)的原理，研究開發(fā)用于修復(fù)或改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的科學(xué)。組織工程是一門由生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)等多學(xué)科交叉產(chǎn)生的高新技術(shù)學(xué)科。其含義是應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物。Wolter在1984年正式提出“組織工程” 一詞，1987年美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金委員會(huì)正式確定組織工程學(xué)成為一門新學(xué)科。多年來(lái)科學(xué)家們運(yùn)用組織工程技術(shù)，利用人體殘余器官的少量正常細(xì)胞進(jìn)行體外繁殖，希望獲得患者所需的、具有相同功能的器官，并不存在排斥反應(yīng)，取得了可喜的成果。但現(xiàn)存的組織工程技術(shù)面臨許多困難和限制，組織工程應(yīng)用研究所取得的成功均是在那些結(jié)構(gòu)與生理功能較為簡(jiǎn)單的組織器官如骨骼、軟骨、皮膚。傳統(tǒng)組織工程方法一般先制備結(jié)構(gòu)支架，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中由于上層細(xì)胞消耗大部分的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，限制了這些組分向底層擴(kuò)散，從而限制了細(xì)胞向支架深層的遷移等，達(dá)不到及時(shí)治療臨床病人的要求。傳統(tǒng)的單一組織支架制備技術(shù)很難形成具有營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)通道分層組織并可誘導(dǎo)分化的組織器官前體。同時(shí)傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)不能滿足將不同的細(xì)胞在空間準(zhǔn)確定位與定點(diǎn)放置，構(gòu)建復(fù)雜組織器官的功能梯度結(jié)構(gòu)的需求。據(jù)統(tǒng)計(jì)中國(guó)已成為器官移植第二大國(guó)，每年接受器官移植的患者在一萬(wàn)例左右，但我國(guó)每年約有一百五十萬(wàn)例患者需要進(jìn)行器官移植，急需新型科技手段出現(xiàn)用以大量快速有效的培育出自體器官。一種多通道多細(xì)胞復(fù)合組織器官前體的制備方法恰好可以滿足這一巨大市場(chǎng)的前期關(guān)鍵需求，并為隨后的完整組織器官生長(zhǎng)提供了必要的準(zhǔn)備
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，旨在前人工作的基礎(chǔ)上，利用組合模具分步灌注，實(shí)現(xiàn)多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)和支架材料在空間的準(zhǔn)確定位，成形多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通道多種生長(zhǎng)因子的復(fù)合組織器官前體。利用模具組合、高分子凝固成形等原理實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，本發(fā)明可成形含不同細(xì)胞基質(zhì)材料與合成高分子支架的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，克服了組織工程存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞需要時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞很難滲入到內(nèi)層結(jié)構(gòu)中等缺點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟進(jìn)行I)將合成高分子材料溶于有機(jī)溶劑中，制成質(zhì)量百分濃度為20% 50%的合成高分子溶液；2)分別制備質(zhì)量百分濃度為1% 30%的多種天然高分子溶液，將多種天然高分子溶液與不同種類動(dòng)物細(xì)胞懸浮液分 別按I 99 I體積比混合制成多種細(xì)胞基質(zhì)溶液；動(dòng)物體細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞濃度為I X IO4個(gè)/mL I X IO7個(gè)/mL ；3)預(yù)先設(shè)計(jì)好主模具和與主模具周向內(nèi)表面貼合的內(nèi)模具，所述主模具底部設(shè)有陣列布置的棒狀結(jié)構(gòu)，將內(nèi)模具嵌入主模具形成組合模具，將一部分合成高分子溶液罐注到組合模具中，通過(guò)干膜法或濕膜法除去有機(jī)溶劑，形成底層合成高分子材料支架；4)將一種或多種細(xì)胞基質(zhì)溶液分層罐注到組合模具中，再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細(xì)胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成多層穩(wěn)定的細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)；5)將內(nèi)模具從組合模具中移除，將合成高分子溶液灌入內(nèi)模具遺留的縫隙和多層細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)的上表面，通過(guò)干膜法或濕膜法除去有機(jī)溶劑，然后去除主模具，制成多通道及多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復(fù)合物。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的至少一種。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于在細(xì)胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為1% 30%的凍存保護(hù)劑，所述的凍存保護(hù)劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于在細(xì)胞基質(zhì)溶液中加入體積百分比為O. 001% O. I %細(xì)胞生長(zhǎng)因子；所述生長(zhǎng)因子采用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)移因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子中的一種或幾種。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述動(dòng)物體細(xì)胞采用干細(xì)胞或成體細(xì)胞，所述干細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞、血液干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞，所述成體細(xì)胞為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于步驟I)中用于溶解所述合成高分子材料的有機(jī)溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4- 二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的主模具由金屬或硬質(zhì)高分子材料制成，所述的主模具及內(nèi)模具的截面形狀為圓形、橢圓形、多邊形，或類似器官表面形狀的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所制備的帶有多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體中合成高分子支架材料具備優(yōu)異的機(jī)械性能，這種內(nèi)部細(xì)胞基質(zhì)外部復(fù)合高分子材料中間孔隙貫通的結(jié)構(gòu)可避免單純細(xì)胞基質(zhì)植入體內(nèi)散落進(jìn)而被自體吞噬這一難題。其中細(xì)胞基質(zhì)溶液具有優(yōu)異的生物相容性，多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以在其中形成多種組織。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)/天然高分子材料與合成高分子支架材料在空間的準(zhǔn)確定位，克服了組織工程存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞需要時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)胞種類單一、細(xì)胞分布不均勻、細(xì)胞層超過(guò)一定厚度后密閉其中的細(xì)胞不易成活、無(wú)營(yíng)養(yǎng)液通道、干細(xì)胞分層分化困難、支架外形局限性強(qiáng)等缺點(diǎn)。本發(fā)明利用組合模具法、高分子凝固成形等原理達(dá)到復(fù)雜器官中不同部位不同細(xì)胞類型及結(jié)構(gòu)類型的要求，為實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建打下基礎(chǔ)。


圖I是本發(fā)明中主模具與內(nèi)模具的 三維示意圖(以圓柱體形狀為例)。圖2a是本發(fā)明中組合模具的主視圖(以圓柱體形狀為例)。圖2b是圖2a的A-A剖視圖。圖3a是本發(fā)明中主模具的主視圖(以圓柱體形狀為例)。圖3b是圖3a的A-A剖視圖。圖4是多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)合組織器官前體的剖面分層圖(以雙層細(xì)胞基質(zhì)層為例)。在圖I至圖4中I-內(nèi)模具；2_主模具；3_底層高分子材料支架；4_細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)。具體實(shí)施方法本發(fā)明提供的一種多通道多細(xì)胞復(fù)合組織器官前體的制備方法，其具體工藝步驟如下I)將合成高分子材料溶于有機(jī)溶劑中，制成質(zhì)量百分濃度為20% 50%的合成高分子溶液；2)分別制備質(zhì)量百分濃度為1% 30%的多種天然高分子溶液，將多種天然高分子溶液與不同種類動(dòng)物細(xì)胞懸浮液分別按I 99 I體積比混合制成多種細(xì)胞基質(zhì)溶液；動(dòng)物體細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞濃度為I X IO4個(gè)/mL I X IO7個(gè)/mL ；3)預(yù)先設(shè)計(jì)好主模具2和與主模具周向內(nèi)表面貼合的內(nèi)模具1，所述主模具底部布置有陣列的棒狀結(jié)構(gòu)，將內(nèi)模具I內(nèi)嵌入主模具2形成組合模具，將合成高分子溶液罐注到組合模具中，通過(guò)干膜法或濕膜法除去有機(jī)溶劑，形成底層合成高分子材料支架3 ；4)將一種或多種細(xì)胞基質(zhì)溶液分層罐注到組合模具中，再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細(xì)胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成多層穩(wěn)定的細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)4 ；5)將內(nèi)模具I從組合模具中移除，再將合成高分子溶液灌入內(nèi)模具I遺留的縫隙與多層細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)上表面，通過(guò)干膜法或濕膜法除去有機(jī)溶劑，去除主模具2，制成多通道及多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體。本發(fā)明的優(yōu)選方案是在所述的細(xì)胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為1% 30%的凍存保護(hù)劑，所述的凍存保護(hù)劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。在所述的細(xì)胞基質(zhì)溶液中加入體積百分比為O. 001% O. 1%細(xì)胞生長(zhǎng)因子。所述的細(xì)胞生長(zhǎng)因子采用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)移因子或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等單一或復(fù)合生長(zhǎng)因子。所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復(fù)合物。所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的至少一種。所述動(dòng)物體細(xì)胞采用干細(xì)胞或成體細(xì)胞，所述干細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞、血液干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞，所述成體細(xì)胞為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。步驟I)中用于溶解所述合成高分子材料的有機(jī)溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇 或1，4- 二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液。所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的主模具2由金屬或硬質(zhì)高分子材料制成，所述的主模具2及內(nèi)模具I的截面形狀為圓形、橢圓形、多邊形，或類似器官表面形狀的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例I :1)制備一系列尺寸不等的黃銅材質(zhì)配套組合模具；2)配制50% (W/V)的PLGA/—四二氧六環(huán)溶液，加入I % (W/W)的肝素，灌入主模具內(nèi)。使用自然風(fēng)干的干膜法形成PLGA底層支架；2)配制纖維蛋白原溶液，將內(nèi)模具套入主模具內(nèi)部，在組合模具中注入明膠/纖維蛋白原與內(nèi)皮細(xì)胞的混合物，細(xì)胞密度為IXlO7個(gè)/mL;3)加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生長(zhǎng)因子(BB或TOGF-BB 50ng/mL)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β KTGF^ I 10ng/mL)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b_FGF 2. 5ng/mL)。使細(xì)胞天然高分子材料分布均勻，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細(xì)胞/天然高分子材料層形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；4)移除內(nèi)模具，在細(xì)胞/天然高分子材料層上表面及內(nèi)模具遺留空隙處灌注PLGA/ —四二氧六環(huán)溶液，風(fēng)干形成PLGA表層及周向支架；5)移除主模具，用縫合線貫穿通道固定，完成多通道多細(xì)胞復(fù)合組織器官前體的制備。實(shí)施例2 1)用硅橡膠制備多通道組織器官前體的配套組合模具；2)配制25%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇攪拌均勻，灌入主模具內(nèi)。使用細(xì)胞培養(yǎng)液萃取法形成外層聚氨酯層，套入內(nèi)模具；3)配制含5%紫杉醇的纖維蛋白原/內(nèi)皮細(xì)胞混合物(細(xì)胞密度為I X IO7個(gè)/mL)，灌注至組合模具中加凝血酶溶液(20IU/mL)，形成第一層主體材料；4)在第一層主體材料上注入明膠/纖維蛋白原與脂肪干細(xì)胞的混合物，細(xì)胞密度為
IX IO6個(gè)/mL，形成第二層主體材料；5)在第二層主體材料上注入纖維蛋白原/肝細(xì)胞混合物(細(xì)胞密度為I X IO7個(gè)/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分鐘，形成三層結(jié)構(gòu)材料；6)移除內(nèi)模具，在細(xì)胞/天然高分子材料層上表面及內(nèi)模具遺留空隙處灌注聚氨酯/乙二醇溶液，經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)液萃取形成表層及周向聚氨酯層支架；7)移除主模具，在通道處涂覆可誘導(dǎo)為血管的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)附近組織血管化，完成可植入型人工肝臟前體的制備。實(shí)施例3 1)制備一系列尺寸不等的聚四氟乙烯配套組合模具；2)配制濃度為30%的聚乳酸/異丙醇溶液，加入30%的檸檬酸鈉，攪拌均勻，灌入主模具內(nèi)。使用PBS萃取法形成底層支架，套入內(nèi)模具；3)配制I %檸檬酸鈉的膠原/內(nèi)皮細(xì)胞混合物(細(xì)胞密度為I X IO7個(gè)/mL)，灌注至組合模具中，37°C下放置10分鐘，使膠原/內(nèi)皮細(xì)胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，形成第一層主體材料；4)在第一層主體材料上注入膠原/平滑肌細(xì)胞混合物(細(xì)胞密度為I X IO7個(gè)/mL) ;37°C下放置10分鐘，使膠原/平滑肌細(xì)胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，形成第二層主體材料；5)在第二層主體材料上注入膠原與脂肪干細(xì)胞/乳鼠心肌細(xì)胞(I I)的混合物，細(xì)胞密度為I X IO6個(gè)/mL，37°C孵化箱中放置10分鐘，形成第三層主體材料；6)移除內(nèi)模具，在細(xì)胞/天然高分子材料層上表面及內(nèi)模具遺留空隙處灌注聚乳酸/異丙醇溶液，經(jīng)過(guò)PBS萃取形成表層及周向支架；7)移除主模具，完成可植入型人工心臟前體的制備。實(shí)施例4 1)用聚四氟乙烯制備配套的主模具及內(nèi)模具；2)配制30% PU/四乙二醇溶液，灌入主模具內(nèi)。使用PBS萃取形成底層支架，套入內(nèi)模具；3)配制下列溶液纖維蛋白原和明膠兩種天然生物材料分別溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%和30%的高分子溶液，再按I : l(v/v)比例混合均勻。然后按體積比加入10%的二甲基亞砜、5%葡聚糖；將脂肪干細(xì)胞與腎小球細(xì)胞按I : I比例混合均勻，加至高分子溶液中，得到脂肪干細(xì)胞-腎小球細(xì)胞-明膠-纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物(細(xì)胞密度為I X IO4個(gè)/mL)，灌注至組合模具中，并用凝血酶溶液(30IU/mL)固定2分鐘；4)移除內(nèi)模具，在細(xì)胞/天然高分子材料層上表面及內(nèi)模具遺留空隙處灌注PU/四乙二醇溶液，經(jīng)過(guò)PBS萃取溶劑，形成表層及周向支架；5)移除主模具，將上述三維結(jié)構(gòu)體在4°C下放置半小時(shí)，后置 于-20°C冰箱中半小時(shí)，最后放入-70°C低溫冰箱液氮中低溫保存，使用時(shí)快速?gòu)?fù)溫，培養(yǎng)以備使用。實(shí)施例5 1)制備一系列尺寸不等的黃銅材質(zhì)配套組合模具；2)配制含3%紫杉醇的30 %聚酯/四乙二醇溶液，灌入主模具內(nèi)，經(jīng)過(guò)PBS萃取溶劑，形成底層支架，套入內(nèi)模具；3)將纖維蛋白原溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%高分子溶液。然后按體積比加入20%的甘油、5%葡聚糖；將脂肪干細(xì)胞與胰島細(xì)胞按2 I比例混合均勻，加入高分子混合溶液中(細(xì)胞密度為I X IO7個(gè)/mL)，得到脂肪干細(xì)胞-胰島細(xì)胞、明膠-纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物，灌注至組合模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)固定2分鐘；4)移除內(nèi)模具，在細(xì)胞/天然高分子材料層上表面及內(nèi)模具遺留空隙處灌注聚酯/四乙二醇溶液，經(jīng)過(guò)PBS萃取溶劑，形成表層及周向支架；5)移除主模具，將上述三維結(jié)構(gòu)體在4°C下放置半小時(shí)，后置于-20°C冰箱中半小時(shí)，最后放入_196°C液氮中低溫保存，使用時(shí)快速?gòu)?fù)溫，加入培養(yǎng)液于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)備用。
權(quán)利要求
1.一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟進(jìn)行 1)將合成高分子材料溶于有機(jī)溶劑中，制成質(zhì)量百分濃度為20% 50%的合成高分子溶液； 2)分別制備質(zhì)量百分濃度為1% 30%的多種天然高分子溶液，將多種天然高分子溶液與不同種類動(dòng)物細(xì)胞懸浮液分別按I 99 I體積比混合制成多種細(xì)胞基質(zhì)溶液；動(dòng)物體細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞濃度為I X IO4個(gè)/mL I X IO7個(gè)/mL ； 3)預(yù)先設(shè)計(jì)好主模具(2)和與主模具周向內(nèi)表面貼合的內(nèi)模具(1)，所述主模具底部設(shè)有陣列布置的棒狀結(jié)構(gòu)，將內(nèi)模具(I)嵌入主模具(2)形成組合模具，將一部分合成高分子溶液罐注到組合模具中，通過(guò)干膜法或濕膜法除去有機(jī)溶劑，形成底層合成高分子材料支架⑶； 4)將一種或多種細(xì)胞基質(zhì)溶液分層罐注到組合模具中，再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細(xì)胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成多層穩(wěn)定的細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)(4)； 5)將內(nèi)模具(I)從組合模具中移除，將合成高分子溶液灌入內(nèi)模具(I)遺留的縫隙和多層細(xì)胞基質(zhì)層結(jié)構(gòu)的上表面，通過(guò)干膜法或濕膜法除去有機(jī)溶劑，然后去除主模具(2)，制成多通道及多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體。
2.按照權(quán)利要求I所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復(fù)合物。
3.按照權(quán)利要求I所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的至少一種。
4.按照權(quán)利要求I所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于在細(xì)胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為I % 30%的凍存保護(hù)劑，所述的凍存保護(hù)劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。
5.按照權(quán)利要求I或4所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于在細(xì)胞基質(zhì)溶液中加入體積百分比為0. 001% 0. 1%細(xì)胞生長(zhǎng)因子；所述生長(zhǎng)因子采用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)移因子、人血小板衍化生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子中的一種或幾種。
6.按照權(quán)利要求5所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述動(dòng)物體細(xì)胞采用干細(xì)胞或成體細(xì)胞，所述干細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞、血液干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞，所述成體細(xì)胞為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。
7.按照權(quán)利要求I所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于步驟I)中用于溶解所述合成高分子材料的有機(jī)溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4_ 二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液。
8.按照權(quán)利要求I所述的一種多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，其特征在于所述的主模具(2)由金屬或硬質(zhì)高分子材料制成，所述的主模具(2)及內(nèi)模具(I)的截面形狀為圓形、橢圓形、多邊形，或類似器官表面形狀的結(jié)構(gòu)。
全文摘要
多通道多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)合組織器官前體的制備方法，該方法首先制備一種或多種細(xì)胞基質(zhì)溶液和合成高分子溶液，將合成高分子溶液罐注到主模具中形成支架下表面，將一種或多種細(xì)胞基質(zhì)溶液分層灌注到組合模具中交聯(lián)形成多層細(xì)胞基質(zhì)層；移除內(nèi)模具，將合成高分子溶液灌注到細(xì)胞基質(zhì)層外表面和周邊空隙處形成外支架，去除組合模具即可。本發(fā)明可成形含均勻內(nèi)部通道的不同細(xì)胞基質(zhì)材料與合成高分子支架外殼結(jié)合的復(fù)雜多通道三維結(jié)構(gòu)，克服了組織工程存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞需要時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)胞種類單一、細(xì)胞分布不均勻、細(xì)胞層超過(guò)一定厚度后密閉其中的細(xì)胞不易成活、無(wú)營(yíng)養(yǎng)液通道、干細(xì)胞分層分化困難、支架外形局限性強(qiáng)等缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/44GK102631710SQ201210110388
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者王小紅 申請(qǐng)人:清華大學(xué)