專利名稱：癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、以及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及使用基于細(xì)胞的疫苗來延長非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的生命的組合物和方法。
背景技術(shù)：
盡管有許多進(jìn)展，在發(fā)達(dá)國家中癌癥仍然是死亡和發(fā)病的主要原因之一。雖然現(xiàn)在已經(jīng)揭示了腫瘤發(fā)生的許多分子機(jī)制，大多數(shù)侵襲性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療仍然是手術(shù)切除、化學(xué)療法以及放射療法。雖然這些方法日益成功，但它們各自仍然引起許多所不希望的副作用。在許多不同類型的癌癥中，NSCLC是最常見和最致命的一種。NSCLC在美國的年發(fā)病人數(shù)超過135,000 (所有類型的肺癌患者的總數(shù)為170，000)。NSCLC在轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)之后幾乎是致死無疑的，五年存活率〈5%。肺腫瘤的年死亡率高于結(jié)腸癌、乳腺癌以及前列腺癌的年死亡率?；瘜W(xué)療法對于NSCLC疾病的治療效果是差的。III期臨床試驗已經(jīng)典型地證明反應(yīng)率為15%到30%，中位存活期小于一年。對在最佳支持性療法和化學(xué)療法之間的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者進(jìn)行隨機(jī)化的臨床研究的最近的薈萃分析得出結(jié)論，在存活期方面的平均潛在增益(mean potentialgain)只有六個星期。最近還報道了在NSCLC方面的許多新藥和組合，但這些方案僅在〈10%的患者中導(dǎo)致了完全反應(yīng)并且對存活期影響極小。與更好的存活期相關(guān)的因素包括III期疾病(相對于IV期)、無體重減輕、良好的體力狀態(tài)、正常的乳酸脫氫酶(LDH)、較少的轉(zhuǎn)移部位、沒有向生命器官(如腦、腦膜、骨髓以及肝)的轉(zhuǎn)移、以及較長的復(fù)發(fā)間隔。顯然，有效的治療需要創(chuàng)新的策略。
概述本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即一種基于細(xì)胞的疫苗可以延長癌癥患者的存活期并且減緩疾病的進(jìn)展。在做出這一發(fā)現(xiàn)的過程中，將包括一個劑量的轉(zhuǎn)染有HLA Al與gp96-Ig(人gp96，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL被人IgGl的FC部分代替)的培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞(AD100)的一種疫苗輻照處理并且皮內(nèi)注射到患有晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性NSCLC的患者體內(nèi)。結(jié)果顯示，與用安慰劑治療的相同患者的平均存活時間相比，該疫苗的施用增加了患者的平均存活時間。而且，患者對該疫苗的免疫應(yīng)答與存活時間相關(guān)。因此，在一個方面，本發(fā)明的特征在于一種治療在人類受試者中的癌癥的方法。這種方法包括向受試者施用一種包括多個宿主細(xì)胞的疫苗的步驟，每個宿主細(xì)胞共同表達(dá)至少一種腫瘤抗原以及被修飾以便從每個宿主細(xì)胞分泌的一種熱休克蛋白。在該方法中，該受試者的存活時間相比于患有相同類型和階段的癌癥的其他受試者的預(yù)期存活時間可以是增加的。該方法可能另外包括在施用該疫苗之前和/或之后分析該受試者的血液中的⑶8T淋巴細(xì)胞的步驟。這些宿主細(xì)胞可以是癌細(xì)胞(例如源自與該受試者中的癌癥相同類型和/或等級的一個細(xì)胞系)。在該人類受試者中的癌癥是一種肺癌的情況下，這些宿主細(xì)胞可以是肺癌細(xì)胞。作為一個例子，在該肺癌是非小細(xì)胞肺癌的情況下，這些宿主細(xì)胞可以是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可以是來自該受試者的或者對該受試者是異基因的，并且可以在施用該疫苗之前對這些宿主細(xì)胞進(jìn)行輻照處理(例如，用來防止在施用之后這些細(xì)胞復(fù)制同時允許發(fā)生熱休克蛋白的分泌持續(xù)幾天或若干天)。可以皮內(nèi)施用該疫苗。在一個實例中，該疫苗是在一天之內(nèi)在受試者的皮膚的多個部位施用的。本發(fā)明的另一個方面是一種包含多個宿主細(xì)胞的用來治療在人類受試者中的癌 癥的疫苗的用途，其中每個宿主細(xì)胞共同表達(dá)至少一種腫瘤抗原以及被修飾以便從每個宿主細(xì)胞分泌的一種熱休克蛋白。在此用途中，該受試者的存活時間相比于患有相同類型和階段的癌癥的其他受試者的預(yù)期存活時間可以是增加的。在該人類受試者中的癌癥是一種肺癌的情況下，這些宿主細(xì)胞可以是肺癌細(xì)胞。作為一個例子，在該肺癌是非小細(xì)胞肺癌的情況下，那么這些宿主細(xì)胞可以是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可以是來自該受試者的或者對該受試者是異基因的，并且可以在施用該疫苗之前對這些宿主細(xì)胞進(jìn)行輻照處理(例如，用來防止在施用之后這些細(xì)胞復(fù)制同時允許發(fā)生熱休克蛋白的分泌持續(xù)幾天或若干天)。并且，可以例如在一天之內(nèi)在受試者的皮膚的多個部位皮內(nèi)施用該疫苗。除非另有定義，在此所使用的所有技術(shù)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。通常理解的生物學(xué)術(shù)語的定義可以在Rieger等人的遺傳學(xué)詞匯經(jīng)典及分子，第五版，施普林格出版社紐約，1991 (Rieger et al. , Glossary ofGenetics:Classical andMolecular, 5th edition,Springer-Verlag:New York, 1991)；以及 Lewin 的基因 V,牛津大學(xué)出版社紐約，1994 (Lewin, Genes V, Oxford UniversityPress:New York, 1994)中找到。 雖然與在此描述的那些相似或等效的方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或測試，以下描述了適合的方法和材料。在此提及的所有專利文獻(xiàn)和出版物通過引用以其全文結(jié)合在此。在發(fā)生沖突的情況下，以包括定義的本說明書為準(zhǔn)。另外，以下所討論的具體實施方案僅僅是說明性的而不旨在限制。
附圖
簡要說明圖I是卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)曲線的曲線圖,顯示了疊加在來自另一項研究的歷史數(shù)據(jù)上的來自臨床研究的患者存活期數(shù)據(jù)。刻度線指示在該指示的時間點處于存活狀態(tài)的患者。圖2是顯示在由外周血⑶8+T細(xì)胞響應(yīng)于AD100細(xì)胞所產(chǎn)生的IFNy與總存活期之間的關(guān)聯(lián)的曲線圖。圖3是一系列曲線圖，顯示了在IFN-Y酶聯(lián)免疫斑點(ELIspot)中檢測的⑶8CTL頻率(左圖)、在血液中的FoxP3 (+)⑶4的頻率(中圖)、以及中位存活期(右圖)。
詳細(xì)說明本發(fā)明涵蓋有關(guān)治療癌癥的方法和組合物。以下描述的優(yōu)選實施方案說明了這些組合物和方法的調(diào)適。雖然如此，根據(jù)這些實施方案的說明，基于以下提供的說明可以完成和/或?qū)嵺`本發(fā)明的其他方面。
生物學(xué)方法在此描述了涉及常規(guī)免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的方法。這些免疫學(xué)方法在本·領(lǐng)域中通常是已知的，并且描述于方法論專著如Coligan等人編著的當(dāng)代免疫學(xué)實驗手冊，約翰 威利父子出版公司，紐約(CurrentProtocols in Immunology, Coligan etal. , ed. , John ffiley&Sons, New York)中。分子生物學(xué)的技術(shù)詳細(xì)描述于以下專著中，如SambiOok等人編著的分子克隆實驗室手冊，第2版，第1_3卷，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，2001 (Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol. 1-3, Sambrooket al. , ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001)；以及Ausubel等人編著的當(dāng)代分子生物學(xué)實驗手冊，格林出版與威利交叉科學(xué)，紐約(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel etal. , ed. , Greene Publishingand ffiley-Interscience, New York)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在本領(lǐng)域中通常是已知的，并且詳細(xì)描述于以下方法學(xué)專著中，如R IanFreshney所著的動物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊，第4版，威利_利斯公司，霍博肯，新澤西州，2000 (Culture of Animal Cells:A Manual ofBasicTechnique,4th edition,by R Ian Freshney, ffiley-Liss, Hoboken, N. J. , 2000)；以及Maureen A Harrison和Ian F Rae的細(xì)胞培養(yǎng)的一般技術(shù)，劍橋大學(xué)出版社，劍橋，英國，1994 (General Techniques of Cell Culture, by Maureen AHarrison andIan F Rae, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1994)。蛋白質(zhì)純化的方法論述于由Deutscher M P編輯的蛋白質(zhì)純化指南酶學(xué)方法，第182卷，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，加利福尼亞，1990 (Guide to ProteinPurification:Methods in Enzymology,Vol. 182, Deutscher M P, ed. , AcademicPress, San Diego, Calif.，1990)。在 McPhee 和Papadakis的當(dāng)代醫(yī)學(xué)診斷與治療2010，第49版，麥格勞-希爾醫(yī)學(xué)，2010 (McPhee andPapadakis, CurrentMedical Diagnosis and Treatment 2010, 49th Edition, McGraw-HillMedical, 2010)以及Fauci等人的哈里森內(nèi)科學(xué)原理,第17版,麥格勞-希爾專業(yè)出版，2008 (Fauci et al.，Harrison’ s Principles of Internal Medicine, 17thEdition, McGraw-Hill Professional, 2008)中描述了醫(yī)療治療的一般方法。
腫瘤性疾病的治療在此描述的這些組合物和方法通過向受試者施用一種藥物組合物用于治療人類受試者中的腫瘤性疾病(如癌癥)是有用的，該藥物組合物包括表達(dá)一種或多種腫瘤相關(guān)抗原并且分泌一種熱休克蛋白(如gp96的一種分泌形式)的細(xì)胞。0}該人類受試者可以是男性、女性、成人、兒童、老年人(65歲以及大于65歲)，以及患有其他疾病的那些。特別優(yōu)選的受試者是那些在用化學(xué)療法、放射療法、外科手術(shù)和/或生物制劑治療之后其疾病進(jìn)展的患者。盡管這種技術(shù)被認(rèn)為對于治療源于肺組織的癌癥(如NSCLC)是特別有效的(與當(dāng)前治療方式相比)，對用在此描述的這些疫苗的治療敏感的任何類型的一種癌癥都可能是靶向的。其他類型的癌癥包括源于膀胱、乳房、結(jié)腸、直腸、子宮內(nèi)膜、子宮頸、腎、血液(如白血病和淋巴瘤)、皮膚(如黑色素瘤)、胰、前列腺、甲狀腺、睪丸以及卵巢的癌癥。對一個癌癥病人的成功治療可以被評定為預(yù)期存活期的延長、抗腫瘤免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)或癌癥的具體特征的改善。可能被改善的癌癥的特征的例子包括腫瘤大小(如T0、Tis、或者T1-4)、轉(zhuǎn)移狀態(tài)(如MO、Ml)、可觀測腫瘤的數(shù)目、淋巴結(jié)累及(如NO、Nl-4、Nx)、等級(即等級I、2、3、或4 )、階段(如O、I、II、III或IV期)、細(xì)胞上或體液中某些標(biāo)志物的存在或濃度(如 AFP、B2M、P-HCG、BTA、CA 15-3、CA27. 29、CA 125,CA 72. 4, CA 19-9、降鈣素、CEA、嗜鉻素 A (chromgrainin A)、EGFR、激素受體、HER2、HCG、免疫球蛋白、NSE、NMP22、PSA、PAP、PSMA, S-100、TA-90、以及甲狀腺球蛋白)、和/或相關(guān)的病理(如腹水或水腫)或癥狀(如惡病質(zhì)、發(fā)熱、食欲缺乏、或疼痛)。如果可以按百分比來度量，該改善可以是至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90% (如存活期、或腫瘤的體積或線性尺寸)。
疫苗組合物本發(fā)明包括藥物組合物和藥劑，該藥物組合物和藥劑包括或使用表達(dá)一種或多種腫瘤相關(guān)抗原并且分泌一種熱休克蛋白(例如gp96的一種分泌形式)的細(xì)胞作為一種活性成份。這些細(xì)胞可能來自于從患者外植的腫瘤產(chǎn)生的一個或多個人腫瘤細(xì)胞系(如單個腫瘤細(xì)胞系、或相同癌癥類型或不同癌癥類型的多個腫瘤細(xì)胞系)，或者可能是人細(xì)胞系(如 HEK293)，該人細(xì)胞系不是由一種癌癥衍生的而是被工程化以便表達(dá)一種或多種腫瘤相關(guān)抗原?？梢詫@些細(xì)胞進(jìn)行輻照以防止它們的復(fù)制，同時允許熱休克蛋白分泌持續(xù)至少I、
2、3、4、5、6、或 7 天(例如，以至少 2000、4000、6000、8000、10，000、或 12,000 拉德的劑量)。它們也可以被工程化為表達(dá)另一種標(biāo)志物(如一種人MHC蛋白)?？梢詫⒂糜谠撘呙绲倪@些細(xì)胞冷凍儲存，并且正好在使用之前在一種無菌的、藥學(xué)上可接受的液體(如USP級鹽水或一種緩沖鹽溶液)中進(jìn)行復(fù)原。藥學(xué)上可接受的載體以及藥物制劑的清單可以在作為本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)文本的雷明登氏藥物科學(xué)(Remington’ s Pharmaceutical Sciences)以及在USP/NF中找到?？梢韵蜻@些組合物中加入其它的物質(zhì)(例如人血清白蛋白和/或DMS0)，并且采取其它的步驟來穩(wěn)定和/或保存這些組合物、和/或促進(jìn)它們施用到受試者。
疫苗施用可以通過任何適合的技術(shù)向動物或人施用本發(fā)明的這些組合物。典型地，這種施用將是腸胃外的(例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、或者腹膜內(nèi)注射)。在通過注射施用這些組合物的實施方案中，針的大小應(yīng)當(dāng)選擇為使剪切降低至最低限度以便保護(hù)這些細(xì)胞的完整性(例如，根據(jù)不同的應(yīng)用，大于14、16、18、20、22、或24號)。這些組合物優(yōu)選地是通過多次注射(例如至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、40、45、或 50 次注射)或通過在多個部位(如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、或14個部位)的連續(xù)輸注(如使用一個泵)而施用的。在一個實例中，在多個身體部位進(jìn)行了皮膚注射以便降低局部皮膚反應(yīng)的程度。在一個給定的接種日，患者接受由一個注射器進(jìn)行施用的指定總劑量的細(xì)胞，將該總劑量分為3-5個獨立的皮內(nèi)注射劑量(例如至少O. 4ml,O. 2ml、或O. 1ml)，各自在肢體中在針頭進(jìn)入處距離最近的相鄰注射相距至少大約5cm (如至少4. 5、5、6、7、8、9、或10cm)。在后續(xù)的接種日中，這些注射部位按照順時針或者逆時針的方式在不同肢體間輪流。
疫苗接種的劑量和次數(shù)一個治療有效量是能夠在治療的動物或人體內(nèi)產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上所希望的結(jié)果的量。本發(fā)明的這些組合物的有效量是對患者產(chǎn)生臨床療效的量，該臨床療效是通過預(yù)期存活期的增加(與相似患者的平均值相比)或者以上描述的一種或多種癌癥特征的改善來度量的。正如在醫(yī)療領(lǐng)域熟知的，對于任何一種動物或人體采用的劑量取決于很多因素，包括受試者的尺寸、體表面積、年齡、待進(jìn)行施用的具體組合物、性別、施用的時間和途徑、全身健康狀況、以及同時進(jìn)行施用的其他藥物。每次施用的優(yōu)選劑量為在體外培養(yǎng)中分泌至少100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、或 9000mg/ml/ 天的分泌形式的熱休克蛋白的那些細(xì)胞數(shù)量。每一劑量中的細(xì)胞數(shù)量可以在從100，000到100，000, 000 (例如大約 100，000 ;250，000 ;500，000 ;750，000 ;1，000，000 ;2，000，000 ;5，000，000 ;10，000，000 ；20，000，000 ;50，000，000 ;或者 100，000，000+/-20%、10%、或 5%)的范圍內(nèi)。該劑量可以重復(fù)給予，如每小時一次、每日一次、一周兩次、每周一次、每兩周一次、每三周一次或每月一次。作為一種施用方案的一個例子，在每次治療出診(每周或每隔一周)時都要進(jìn)行癌癥以及毒性的臨床評價。在給予疫苗接種之前的每個療程的第I天獲得用于免疫學(xué)評價的血樣。對于在第一個疫苗接種過程結(jié)束時具有疾病穩(wěn)定跡象或反應(yīng)性NSCLC、以及可接受的毒性(自身免疫〈2級，并且其他身體系統(tǒng)< 2級)的患者，按照相同的劑量和時間表以一個另外的過程進(jìn)行處理。如果在第二個療程結(jié)束時患者具有疾病穩(wěn)定跡象或反應(yīng)性NSCLC、以及可接受的毒性(自身免疫〈2級，并且其他身體系統(tǒng)< 2級)，則對其按照相同的劑量和時間表給予第三個療程。
實例實例I-藥物名稱Adl00-gp96Ig-HLAAl，短 gp96_ 疫苗(gp96_Ig 和 HLAAl 轉(zhuǎn)染的 NSCLC 細(xì)胞系)。在美國專利申請序列號11/878，460中描述了這種藥物。一種人肺腺癌細(xì)胞系是在1994年從一位肺癌患者的活組織檢查建立的并被指定為Ad#100。該患者是一位74歲的白人男性，他于1993年出現(xiàn)由于髂嵴的骨侵蝕以及原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肺腺癌的肺結(jié)節(jié)引起的骨盆痛的始發(fā)癥狀。用于培養(yǎng)的癌細(xì)胞是通過骨髓穿刺從髖骨破壞區(qū)獲得的。患者的骨盆接受了放射治療，但在診斷一個月之后終止。衍生自這個患者的該細(xì)胞系被保持在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(在下文中描述)中進(jìn)行培養(yǎng)，并且不受支原體、病毒或其他外源因子的污染。該細(xì)胞系是均質(zhì)的，可粘附于塑料，并且以大約26h的分裂率生長。該細(xì)胞系經(jīng)過檢驗并且確定為沒有下列物質(zhì)HIV-1、HIV-2、HTLV-I、HTLV-2、HBV、腺病毒、多瘤病毒、CMV、EBV、HHV6、HCV、VZV、細(xì)小病毒B19、HPV、以及支原體。用質(zhì)粒cDNA “B45-neo-gp96Ig-HLA Al”轉(zhuǎn)染 AdlOO 并且用 G418 進(jìn)行選擇。B45是一種通過缺失衣殼編碼基因LI和L2并且進(jìn)一步缺失潛在轉(zhuǎn)化基因E5、E6以及E7而衍生自牛乳頭瘤病毒的載體。該載體包含兩個真核cDNA表達(dá)盒；在這種情況下，HLA Al由金屬硫蛋白啟動子驅(qū)動而gp96-Ig由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子驅(qū)動。該穿梭載體還含有用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇的內(nèi)酰胺酶基因以及用于在胸苷激酶啟動子下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的AdlOO細(xì)胞的G418選擇的新霉素抗性基因。該Β45載體的El和Ε2基因編碼兩種病毒蛋白，這些病毒蛋白對于質(zhì)粒的游離型復(fù)制以及編碼的cDNA的高水平表達(dá)是必需的。通過包含人β -珠蛋白基因的一個非編碼部分進(jìn)一步增強(qiáng)cDNA的高水平表達(dá)。該疫苗細(xì)胞系被永久性地轉(zhuǎn)染(無需新的轉(zhuǎn)染)并且保持在G418中在定期再選擇條件下，以確保質(zhì)粒-附加體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的維持。使用特異性抗體通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析來確定人HLA Al的表達(dá)。將在70%或以上的細(xì)胞上表達(dá)HLA Al的制劑用于疫苗接種。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測gp96-Ig融合蛋白的Ig部分來測量gp96-Ig的表達(dá)。將在24小時內(nèi)由IO6個細(xì)胞產(chǎn)生彡60ng的gp96-Ig的細(xì)胞用于疫苗接種。將該細(xì)胞系在無菌條件下于GMP設(shè)備中進(jìn)行擴(kuò)增。針對每批次通過FDA要求和批準(zhǔn)的測定法來確定沒有細(xì)菌、病毒、酵母、以及支原體以及內(nèi)毒素的水平。FCSUMDM、胰蛋白酶EDTA、HBSS以及G418是從GIBCO獲得的并且經(jīng)檢驗不含外源試齊U。DMSO來自Sigma并且同樣不含外源因子。人血清白蛋白以及緩沖鹽水溶液均為醫(yī)藥級。將這些批次的細(xì)胞在組織培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增到大約1-5χ109個細(xì)胞，然后通過FACS來檢測表達(dá)的HLA Al的存在并且通過ELISA檢測gp96Ig的存在。收集細(xì)胞，洗滌，并且在4° C下再懸浮于緩沖鹽水+10%DMS0+0. 5%人血清白蛋白中，等分為5x107/0. 5ml，并且在4° C下用鈷輻照器在12，000拉德下進(jìn)行輻照。取出樣品用于生物學(xué)和安全性分析。將剩余的等分部分在-135° C下冷凍并儲存。為了確保經(jīng)輻照之后該疫苗細(xì)胞系雖然失去復(fù)制能力但仍保持生物活性，對在12，000拉德輻照之后的AD100-gp96-Ig-HLA Al細(xì)胞系進(jìn)行如下測試在軟瓊脂中的集 落形成在鋪板的IO8個輻照細(xì)胞中未檢測到集落；Gp96-Ig分泌在隨后的輻射14天之后接近Ong，而未輻照的對照組保持gp96-Ig產(chǎn)生；對于最早的48h，在這些輻照細(xì)胞中的胸腺嘧啶摻入是增加的(與對照組相比)，這是由于DNA修復(fù)引起的(輻照細(xì)胞在一周后顯示沒有胸腺嘧啶攝取，而與此相反，對照組細(xì)胞繼續(xù)增殖并攝取胸腺嘧啶)；并且在裝配以及衰變的年度調(diào)整時對該鈷輻照器進(jìn)行校準(zhǔn)。該鈷輻照器是一個全景輻照器(panoramicirradiator),其福射劑量僅取決于每年調(diào)整的福照源的自然衰退(physical decay)。待注射的該疫苗含有輻照的AdlOO細(xì)胞，這些細(xì)胞在至少70%的細(xì)胞上表達(dá)HLAAl并且產(chǎn)生彡60ng gp96-Ig/24hxl百萬個細(xì)胞；經(jīng)臺盼藍(lán)拒染法測得的生存力彡70%。將這些細(xì)胞再懸浮于具有O. 5%人血清白蛋白、10%DMS0的緩沖鹽水中。實例II-CD8應(yīng)答⑶8細(xì)胞是用來自干細(xì)胞技術(shù)(Stem Cell Technologies)(加拿大,溫哥華)的Rosette-Sep試劑盒從15ml血液中純化得到的。這個過程通過陰性選擇產(chǎn)生大約150萬個純度大約85%的CD8細(xì)胞，還消除了具有抗CD56的NK細(xì)胞。主要的污染細(xì)胞是B細(xì)胞。將⑶8細(xì)胞(20，000)分為一式三份在酶聯(lián)免疫斑點(ELI-spot)平板中用1，000個細(xì)胞激發(fā)48h，這些細(xì)胞各自為自體腫瘤細(xì)胞、AD100-HLA Al_gp96Ig (疫苗)、AD100 (未轉(zhuǎn)染)、Mel_Al(HLAAI轉(zhuǎn)染的黑色素瘤)、SCLC-A1(A1轉(zhuǎn)染的小細(xì)胞肺癌)、以及K562(NK靶)，或者對于⑶8細(xì)胞無激發(fā)。使用適當(dāng)?shù)拿嘎?lián)免疫斑點抗體(Becton&Dickinson)測定IFN-Y、IL_4以及顆粒酶B的分泌。樣品被分為一式三份來進(jìn)行并且通過來自C. T. L (CellularTechnologiesLtd,克利夫蘭，俄亥俄州)的自動酶聯(lián)免疫斑點分析儀(ELI-spot reader)進(jìn)行定量。實例III-臨床結(jié)果通過Kaplan-Meier法估計無進(jìn)展存活期和總存活期，利用施用方案隊列進(jìn)行分層。確定了相應(yīng)的中位存活時間(具有90%的置信限)，正如在參與試驗6、12、18、24、以及36個月后保持存活的患者的累積百分比。在可能的范圍內(nèi)，使用比例風(fēng)險回歸分析來評定無進(jìn)展存活期和總存活期與施用方案分配、所接受的治療(如總劑量、疫苗接種次數(shù))、基線特征以及免疫應(yīng)答的各種度量(如CD8成倍增加)的關(guān)系。實例IV :患有IIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)并且具有多種預(yù)治療方案的患者的I階段研究。
限定參與試驗的患者群的特征為局部晚期或轉(zhuǎn)移性IIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌，ECOG體力狀態(tài)0-2，以及多種預(yù)治療，包括化學(xué)療法、放射療法和生物調(diào)節(jié)劑治療?；颊弑环值饺齻€組中的一個。被編入到組I中的患者每兩周一次接受9個劑量的AD100-gp96-Al，被編入到組2中的患者每周一次接受18個劑量的AD100-gp96-Al，而被編入到組3中的患者每周兩次接受36個劑量的AD100-gp96-Al。對3個組的每一個來說，AD100-gp96_Al的總劑量在治療過程中是恒定的。在用AD100-gp96-Al治療的同時不給予任何另外的佐劑或治療。實例V :在一個時期(One Time Period)的結(jié)果在參與本研究的最早的12位患者中，I位在接受疫苗接種之前去世，9位被編入組I (每兩周一次的劑量)，I位被編入組2 (每周一次的劑量)，并且I位被編入組3 (每周兩次的劑量)。所有患者均無與疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良事件(SAE)報告，但都經(jīng)歷了注射疫苗部位反應(yīng)，包括紅斑和輕微腫脹。一位患者在接受疫苗后一個月之內(nèi)去世，然而該患者的SAE報告確定其死亡是由于疾病的進(jìn)展而不是疫苗治療引起的。12位已經(jīng)接受至少一個疫苗劑量 的患者的總存活期繪制在圖I中。圖I將該研究數(shù)據(jù)與來自Massarelli研究(肺癌39:55061,2002)的歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行疊加。由于Massarelli研究是根據(jù)患者已經(jīng)接受的先前治療的次數(shù)來分析病人的存活期和反應(yīng)的最佳研究之一，對于本研究它是一個優(yōu)異的比較標(biāo)準(zhǔn)(comparator)。Massarelli研究提供了針對已經(jīng)進(jìn)行了4線治療的患者的存活數(shù)據(jù)。圖I數(shù)據(jù)自其推導(dǎo)出的患者在用AD100-gp96-Al治療之前平均在5. 3線治療時失敗(中位數(shù)為4線，不包括外科手術(shù)和放射療法)。為了評價患者的免疫應(yīng)答，在接受疫苗之前以及隨后每隔6周的時間間隔(在每個療程之間)從每位患者抽取外周血樣。然后評價了外周血淋巴細(xì)胞響應(yīng)于AD100疫苗細(xì)胞或其他不相關(guān)細(xì)胞系的刺激的細(xì)胞因子如干擾素-Y以及顆粒酶B的產(chǎn)生。還通過流式細(xì)胞術(shù)分析了外周血的淋巴細(xì)胞亞群組成。參考圖2，從被編入組I中的四位患者收集的數(shù)據(jù)證明了由⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素Y與總存活期之間的關(guān)聯(lián)。若干患者在沒有完成全療程時實現(xiàn)了疾病穩(wěn)定。一位患者在這個時間點治療后存活了超過20個月，另一位患者在治療后存活了 18個月。在治療過程中測量的AD100-gp96-Al特異性T細(xì)胞應(yīng)答的量值顯得是存活期增加的預(yù)測?；颊?003在參與試驗時具有局部晚期和進(jìn)行性疾病，伴隨著顯著的胸腔積液。患者1006在整個一側(cè)肺部具有一個大的擴(kuò)散的腫塊，該腫塊對于氣管隆凸(carina)是局部侵襲性的。這兩位患者歸入IIIB/IV期NSCLC的T4胸腔積液和T4侵襲性亞型。迄今為止進(jìn)行的最大規(guī)模的將IIIB/IV期NSCLC與各種亞型的相對存活期進(jìn)行比較的研究(WiIIiamffN等人，Chest 2009; 136)確定了只有具有改善的總存活期的IIIB/IV期NSCLC的亞型是患有T4衛(wèi)星疾病(T4-Satellite disease)的患者。發(fā)現(xiàn)了具有T4侵襲性或胸腔積液的患者具有與IV期疾病患者無差別的總存活期。因此，并沒有證據(jù)表明，與其他參與試驗的患者相t匕，在參與試驗時這些患者的疾病具有改善的總體預(yù)后。另外，對這個小群體的患者來說，再陽性淋巴結(jié)或者轉(zhuǎn)移病灶的數(shù)目和部位與總存活期之間似乎沒有清楚的關(guān)聯(lián)。盡管患者1011與任何參與的患者相比具有最晚期的疾病，他已經(jīng)實現(xiàn)了疾病穩(wěn)定并且他幾乎完成了所有3個療程。
實例VI :在后面時期(Later Time Period)的結(jié)果19位患者參與了試驗并且在經(jīng)過18周的期間以三個給藥方案被接種了總量為
4.5xl08個疫苗細(xì)胞給藥方案(DS-1)為9次疫苗接種(每次5xl07個細(xì)胞)，每2周接種一次(組I);給藥方案(DS-2)為18次疫苗接種(每次2. 5xl07個細(xì)胞)，每周接種一次(組2)；以及給藥方案(DS-3)為36次疫苗接種(每次I. 25xl07個細(xì)胞)，每周接種兩次(組3)。在6、12、以及18周之后測量了在基線的免疫應(yīng)答和臨床反應(yīng)。該疫苗在所有的給藥方案中均良好耐受，在接種部位具有最低限度的預(yù)期副作用。它產(chǎn)生了在IFN-Y的ELI斑點(圖3，左)中檢測的顯著的⑶8CTL頻率，并且在一些患者中產(chǎn)生了在血液中的降低的FoxP3 (+)⑶4細(xì)胞頻率的趨勢(圖3，中)。估計中位存活期為8. O個月(95%置信區(qū)間6. 7到18. 2)，是預(yù)期存活期估計值的兩倍(圖3，右)。雖然由于DS-2和DS-3的不完全自然增長(incompleteaccrual)使上述比較結(jié)果受到限制，在DS-2 (每周疫苗接種)中的四位患者中的兩位以及在DS-3 (每周兩次疫苗接種)中的三位患者中的兩位均存活了比在DS-I中的11位患者的 中位存活時間(7. I個月)更長的時間。確切地說，有兩位患者在8. 3和20個月時死亡(分別在DS-2和DS-3中)并且有兩位患者在9. 7和11. 5個月時仍然存活(分別在DS-3和DS-2中)。
其它實施方案應(yīng)當(dāng)理解的是，雖然結(jié)合其詳細(xì)說明描述了本發(fā)明，前述的說明旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附權(quán)利要求書的范圍來限定的。其他方面、優(yōu)點、以及修改落在以下的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種包含多個宿主細(xì)胞的疫苗用來治療人類受試者中的癌癥的用途，其中每個宿主細(xì)胞共同表達(dá)至少一種腫瘤抗原以及被修飾以便從每個宿主細(xì)胞分泌的一種熱休克蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中該受試者的存活時間相比于患有相同類型和階段的癌癥的其他受試者的預(yù)期存活時間是增加的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中該宿主細(xì)胞是一種癌細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中在該人類受試者中的癌癥是一種肺癌并且這些宿主細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中該肺癌是非小細(xì)胞肺癌并且這些宿主細(xì)胞是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中這些宿主細(xì)胞對于該受試者是異基因的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中這些宿主細(xì)胞是被輻照的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中該疫苗是皮內(nèi)施用的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中該疫苗是在一天之內(nèi)在受試者的皮膚的多個部位施用的。
全文摘要
一種基于細(xì)胞的疫苗延長了癌癥患者的存活期。該疫苗包括一個劑量的轉(zhuǎn)染有HLA A1與gp96-Ig(人gp96，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL被人IgG1的Fc部分代替)的輻照培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞(AD100)，并且被皮內(nèi)注射到患有晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的患者體內(nèi)。與用安慰劑治療相似患者相比，該疫苗的施用增加了患者的平均存活時間。而且，患者對該疫苗的免疫應(yīng)答(由T細(xì)胞產(chǎn)生的抗原誘導(dǎo)的干擾素γ)與存活時間相關(guān)。
文檔編號A61K39/385GK102883746SQ201180023216
公開日2013年1月16日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者埃克哈德·R·波達(dá)克 申請人:邁阿密大學(xué)