專利名稱：包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病治療用組合物的制作方法
包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病治療用組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨疾病的預(yù)防或治療用組合物。更詳細(xì)地，涉及一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病的預(yù)防、治療或改善用途的藥劑學(xué)組合物或食品學(xué)組合物。
背景技術(shù)：
正常的骨再建過程由骨形成與骨吸收的均衡構(gòu)成，這種骨形成與骨吸收大體上由三種細(xì)胞的相互作用來實現(xiàn),該三種細(xì)胞分別為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞(osteoblast)及破骨細(xì)胞(osteoclast)。尤其是，成骨細(xì)胞的增殖和分化與骨的鈣化有密切的關(guān)系，如果在成骨細(xì)胞中作為重要轉(zhuǎn)錄因子的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2 (RUNX2)中發(fā)生變異(mutation)或者表達(dá)量被減少，則不會引發(fā)骨的I丐化。核因子K B受體活化因子配體(RANKL, receptor activator of NF- κ B ligand)在成骨細(xì)胞的分化過程中得到表達(dá)而成為促進破骨細(xì)胞的分化的因子，護骨素(0PG，Osteoprotegerin)也在成骨細(xì)胞中得到表達(dá)而抑制RANKL的作用，由此成為抑制破骨細(xì)胞的分化的因子。骨(bone)用于支撐人體的軟組織與體重，并包裹內(nèi)部器官，來保護內(nèi)部臟器不受到外部的沖擊。并且，骨不僅在結(jié)構(gòu)上支撐肌肉或臟器，還儲存體內(nèi)的鈣或其他無機質(zhì)，即為儲存磷或鎂等物質(zhì)的人體重要部分之一。因此，停止成長的成人的骨，不停地活躍并持續(xù)地反復(fù)除去舊骨，用新骨來代替的生成與吸收過程，來維持均衡，直至人死為止。該過程叫做骨再建(bone remodeling) (Yamaguchi A. et al. , Tanpakushitsu Kakusan Koso. , 50(6Suppl) :664-669 (2005))。除去舊骨并用新骨來代替的骨轉(zhuǎn)換(turnover)用于修復(fù)因成長和壓力引起的骨的微傷，而且是適當(dāng)維持骨的功能的必需因素(Cohen-SolalM. etal.,Therapie. , 58 (5) :391-393 (2003))。眾所周知，骨再建大體上參與兩種細(xì)胞。兩種細(xì)胞之一是生成骨的成骨細(xì)胞，另一種是破壞骨的破骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞用于生成NFk B受體活化因子配體及作為其誘導(dǎo)受體(decoy receptor)的護骨素。如果NF κ B受體活化因子配體與位于破骨祖細(xì)胞(osteoclast progenitorcells)的表面的作為受體的NF κ B受體活化因子(RANK)相結(jié)合，則破骨祖細(xì)胞成熟(maturation)為破骨細(xì)胞,而引發(fā)骨吸收(boneresorption)。但是,如果護骨素與NF κ B受體活化因子配體相結(jié)合，則阻斷NF κ B受體活化因子配體與NF κ B受體活化因子之間的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的形成，而且不會引發(fā)不必要的骨吸收(TheillLE.et al. , Annu Rev Immunol. , 20:795-823 (2002)；ffagner EF. et al. , Curr Opin GenetDev.， 11:527-532 (2001))。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是因多種原因?qū)е鹿堑馁|(zhì)量被減少，并且因骨組織的微小結(jié)構(gòu)的退化而持續(xù)增加骨折危險的疾病，一般在構(gòu)成骨的礦物(尤其是鈣)和基質(zhì)被減少的狀態(tài)，或者在因骨再建的均衡被破壞而導(dǎo)致破骨作用比成骨作用得到增加的狀態(tài)下發(fā)生(IqbalME ,South Med J. , 93 (I) :2-18 (2000))。雖然正常的骨的內(nèi)部構(gòu)成像網(wǎng)一樣緊湊的結(jié)構(gòu)，但是在骨質(zhì)疏松癥的情況下，結(jié)構(gòu)之間的間隔變寬，微小結(jié)構(gòu)變薄而脆弱，由此進行到即使受到較小的沖擊也容易導(dǎo)致骨折的狀態(tài)(Stepan JJ. et al. , EndocrRegul. , 37 (4) :225-238 (2003)。骨質(zhì)疏松癥分為以下三種與閉經(jīng)期開始的同時呈現(xiàn)快速的骨損失(年間29Γ3%)，脊椎的壓迫及腕骨容易骨折的危險度增加的閉經(jīng)期以后的骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis);漸漸發(fā)生在70歲以上的男女老人身上(年間O. 5%-1 %),帶來髖骨(hipbone)與脊椎骨的逐漸性骨損失的老年期的骨質(zhì)疏松癥(SenileosteopOTosis);以及與年齡無關(guān)地因疾病(內(nèi)分泌疾病、胃腸道疾病及惡性腫瘤)或藥物(腎上腺皮質(zhì)激素、抗癌化學(xué)療法、甲狀腺激素、抗驚厥劑、抗凝固劑、甲氨蝶呤(methotrexate)、環(huán)孢素(cyclosporine)、促性腺激素釋放激素(GnRH)等)、酒精、吸煙、事故引起的第二次骨質(zhì)疏松癥(Secondary osteoporosis) (Rosen CJ. , N Engl J Med. , 353(6) :595-603 (2005) ;Davidson M. , Clinicain Reviews. , 12 (4) :75-82 (2002))。在患有乳房癌(breast cancer)、前列腺癌(prostate cancer)或者多發(fā)性骨髓瘤(multiple
myeloma)的患者身上幾乎經(jīng)常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移(Kozlow ff. et al. , JMammary Gland Biol Neoplasia. , 10 (2) : 169-180 (2005)),已知，這些癌患者能夠活到多久取決于是否進行骨轉(zhuǎn)移。乳房癌患者或前列腺癌患者的死亡率高的理由在于，癌細(xì)胞選擇性地轉(zhuǎn)移到骨。已知，在乳房癌中觀察到的大部分骨轉(zhuǎn)移是破骨的溶骨性骨轉(zhuǎn)移(osteolytic metastasis),這并不是乳房癌細(xì)胞直接影響到骨,而是刺激破骨細(xì)胞而 引起的(Boyde A. et al. , ScanElectron Microsc. , 4:1537-1554 (1986))。相反，在前列腺癌中觀察到的骨轉(zhuǎn)移是成骨性骨轉(zhuǎn)移(osteoblastic metastasis)。已知，成骨性骨轉(zhuǎn)移還與骨溶解密切相關(guān)。轉(zhuǎn)移到骨的多個癌細(xì)胞在骨周圍的微小環(huán)境中增殖而刺激破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的活性，由此決定是否進行到溶骨性骨轉(zhuǎn)移還是進行到成骨性骨轉(zhuǎn)移(Choong PF. et al. , ClinOrthop Relat Res.，415S:S19-S31 (2003))。約 80% 的乳房癌患者身上發(fā)生癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的乳房癌細(xì)胞激活破骨細(xì)胞(Bendre M. , etal. , Clin Orthop Relat Res. , 415 (Suppl): S39-S45 (2003) ;PalmqvistP. et al. , JImmunol. , 169 (6) :3353-3362 (2002))。被激活的破骨細(xì)胞破壞骨周圍的微小環(huán)境的均衡，來引發(fā)骨溶解(osteolysis)，因這種現(xiàn)象，不僅經(jīng)常發(fā)生病性骨折，還引起白細(xì)胞減少癥(leukoerythroblastic anaemia)、骨畸形、高I丐血癥(hypercalcemia)、疼痛(pain)、神經(jīng)壓迫綜合征(nervecompression syndromes)等與骨相關(guān)的疾病(Roodman GD. , N Engl JMed. , 350:1655-1664 (2004))。眾所周知，雌激素的不足現(xiàn)象多見于閉經(jīng)之后的女性，影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨吸收程度比骨形成程度變多，由此成為誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的主要因素。因這種原因，為了治療骨質(zhì)疏松癥，長時間給患者投用如雌激素等激素，但是許多研究認(rèn)為這將成為乳房癌和子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)病原因。目前進行著用于挖掘植物來源的植物雌激素的多項研究，該植物雌激素通過與雌激素受體相結(jié)合來起到與雌激素類似的功能，但沒有副作用，目前正在踴躍進行著對挖掘出的候選物質(zhì)對閉經(jīng)之后因缺乏雌激素而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及治療效果的相關(guān)研究。據(jù)報告，作為實例，植物雌激素在骨與心血管系統(tǒng)中呈現(xiàn)雌激素活性，相反，在乳房與子宮中呈現(xiàn)抗雌激素活性。所有植物雌激素是在結(jié)構(gòu)上與雌激素類似的酚類化合物，植物雌激素的代表性物質(zhì)有異黃酮、木酚素以及酷魔斯坦(cumestran)等。已知，這些植物雌激素的雌激素活性用于防止骨吸收，并維持骨密度。在多項研究中顯示，大豆的異黃酮在切除卵巢的小鼠身上有效防止骨減少。為了預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，民間經(jīng)常服用紅花籽，可見不僅是大豆的異黃酮，而且來源于其他植物的植物雌激素也具有保護骨的效果。作為從大豆中新萃取的植物抗毒素之一的大豆抗毒素(glyceollin)是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM, selective estrogenreceptor modulator),是由大豆苷元所制備的具有抗雌激素效果的物質(zhì)。最近，踴躍實現(xiàn)借助大豆抗毒素的抗雌激素效果來抑制乳房癌與子宮癌的內(nèi)容的研究結(jié)果。這種研究結(jié)果，在能夠代替，誘發(fā)為了治療閉經(jīng)之后女性因缺乏雌激素而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥而需要承受的作為危險的副作用的乳房癌與子宮內(nèi)膜癌的激素的方面上，是十分重要的候選物質(zhì)。本說明書全文中，參照多篇的論文及專利文獻(xiàn)，并表示其引用內(nèi)容。所引用的論文及專利文獻(xiàn)的揭示內(nèi)容，作為參照全部插入于本說明書中，而將更加明確地說明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水準(zhǔn)及本發(fā)明的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明者為了開發(fā)出能夠無副作用且有效地使用于骨疾病的治療或預(yù)防的物質(zhì)而努力研究。其結(jié)果，通過實驗已確認(rèn)，作為一種從大豆中萃取的植物抗毒素(phytoalexin)的大豆抗毒素(glyceollin),在通過動物細(xì)胞模型的實驗中，抑制由成骨 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞以及活性，并在骨質(zhì)疏松癥引發(fā)動物模型中具有治療骨質(zhì)疏松癥的功效，由此證明有可能開發(fā)為對如骨質(zhì)疏松癥等多種骨疾病的治療有效的活性成分，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病預(yù)防或治療用組合物。本發(fā)明的再一個目的在于，提供一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病改善用食品學(xué)組合物。本發(fā)明的還有一個目的在于，提供一種用于制備骨疾病的預(yù)防或治療用組合物的大豆抗毒素的用途。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種包括將包含大豆抗毒素作為有效成分的藥劑學(xué)組合物投用給骨疾病患者的步驟的骨疾病的預(yù)防或治療方法。將通過發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容、權(quán)利要求書及附圖，更明確地說明本發(fā)明的目的及優(yōu)點。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病預(yù)防或治療用組合物。根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方式，本發(fā)明提供一種骨疾病預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，該骨疾病預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物包含Ca)大豆抗毒素的治療學(xué)有效劑量；以及(b)藥劑學(xué)上許可的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，本發(fā)明提供一種骨疾病改善用食品學(xué)組合物，該骨疾病改善用食品學(xué)組合物包含(a)大豆抗毒素的食品學(xué)有效劑量；以及(b)食品學(xué)上許可的載體。
根據(jù)本發(fā)明的還有一個實施方式，本發(fā)明提供一種用于制備骨疾病的預(yù)防或治療用組合物的大豆抗毒素的用途。根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，本發(fā)明提供一種包括將包含大豆抗毒素作為有效成分的藥劑學(xué)組合物投用給骨疾病患者的步驟的骨疾病的預(yù)防或治療方法。本發(fā)明者為了開發(fā)出能夠無副作用且有效地使用于骨疾病的治療或預(yù)防的物質(zhì)而努力研究。其結(jié)果，通過實驗已確認(rèn)，作為一種從豆中萃取的植物抗毒素的大豆抗毒素，在通過動物細(xì)胞模型的實驗中，抑制由成骨細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞以及活性，并在骨質(zhì)疏松癥引發(fā)動物模型中具有治療骨質(zhì)疏松癥的功效，由此證明有可能開發(fā)為對如骨質(zhì)疏松癥等多種骨疾病的治療有效的活性成分，從而完成了本發(fā)明。作為本發(fā)明的有效成分的“大豆抗毒素”是大豆發(fā)生過敏性反應(yīng)或者真菌脅迫(fungal stress)期間生成的一種植物抗毒素(phytoalexin)物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的具體的一實施例，上述大豆抗毒素化合物是通過純化方法，例如通 過層析(chromatography)分離方法，從在浸水的大豆(soybean)處理曲霉(Aspergillussp.)菌株來培養(yǎng)的大豆萃取物中分離及純化而得的。就上述大豆抗毒素而言，在自然界中，大豆抗毒素I為最主要的形態(tài)，作為其兩種異構(gòu)體(isomer)的大豆抗毒素II及大豆抗毒素III微量存在(Clinical Cancer Research2006;12(23)December I, 2006, 7159-7164, Antiestrogenic Glyceollins Suppress HumanBreast andOvarian Carcinoma Tumorigenesis)。在本發(fā)明中，活性成分“大豆抗毒素”意味著均包含大豆抗毒素I、大豆抗毒素II、大豆抗毒素III或者這些大豆抗毒素的混合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述大豆抗毒素是大豆抗毒素I、大豆抗毒素II、大豆抗毒素III，或者這些大豆抗毒素的混合物。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實例，上述大豆抗毒素為大豆抗毒素I。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的大豆抗毒素抑制破骨細(xì)胞的分化。破骨細(xì)胞是在血液細(xì)胞(造血干細(xì)胞)中產(chǎn)生的細(xì)胞,具有當(dāng)血液內(nèi)缺I丐或者需要進行骨再建時破壞骨的功能。并且，本說明書的術(shù)語“骨吸收”意味著破骨細(xì)胞向骨分泌較強的酸(acid)及蛋白質(zhì)降解酶來降解骨。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實例，本發(fā)明的大豆抗毒素在成骨細(xì)胞或者前成骨細(xì)胞(preosteoblast)中促進成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的降解。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例，本發(fā)明的大豆抗毒素具有在成骨細(xì)胞中抑制NFkB受體活化因子配體的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水準(zhǔn)來抑制破骨細(xì)胞的分化的功效。結(jié)果，本發(fā)明的大豆抗毒素，通過抑制成骨細(xì)胞或前成骨細(xì)胞的分化，來減少骨的循環(huán)或者骨轉(zhuǎn)換率(bone turnover rate),由此具有治療或預(yù)防骨疾病的功效。并且，作為本發(fā)明的有效成分的大豆抗毒素，通過如上所述的抑制破骨細(xì)胞的分化的作用，具有治療或預(yù)防骨疾病的功效。根據(jù)本發(fā)明的還有一個優(yōu)選實例，作為利用本發(fā)明的組合物而可以治療或者預(yù)防的骨疾病的例子，有因癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的骨損傷、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化癥、佝僂病、纖維性骨炎、骨發(fā)育不全或者代謝性骨疾病、骨溶解、白細(xì)胞減少癥、骨畸形、高鈣血癥或者神經(jīng)卡壓綜合癥等。
尤其是，本發(fā)明的組合物對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及治療發(fā)揮顯著的功效。骨質(zhì)疏松癥可分為原發(fā)性(第一性)骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性(第二性)骨質(zhì)疏松癥。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥意味著主要發(fā)生在不適當(dāng)攝取鈣和維生素D，或者不進行適當(dāng)?shù)慕∩磉\動，閉經(jīng)期后女性或吸煙的老年期男性身上的骨質(zhì)疏松癥。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥意味著因特定疾病或藥物而誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥。這種情況下，年輕人身上也會誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥，骨強度的減少及骨折的發(fā)生率的增加與疾病或藥物的嚴(yán)重性與暴露在疾病或藥物的期間成正比例。作為疾病，可列舉甲狀腺功能亢進癥、甲狀旁腺功能亢進癥、庫欣綜合征(腎上腺皮質(zhì)激素過度分泌疾病)、早期閉經(jīng)、人工手術(shù)(卵巢切除)導(dǎo)致的閉經(jīng)、性功能下降癥、慢性肝病(肝硬化癥)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎衰竭癥及胃切除手術(shù)等，作為藥物，可列舉類固醇(腎上腺皮質(zhì)激素)、抗驚厥劑(癲癇藥)及肝素等。本發(fā)明的組合物在癌細(xì)胞或者癌組織的骨轉(zhuǎn)移引起的骨疾病的預(yù)防及治療上呈現(xiàn)顯著效果。例如，上述癌細(xì)胞或者癌組織包含胃癌、肺癌、乳房癌、卵巢癌、肝癌、直腸癌、支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、胰臟癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腦癌、前列腺癌、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、甲狀旁腺癌及尿·道癌細(xì)胞或者組織，但并不局限于此。本發(fā)明的組合物可制備為藥劑學(xué)組合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的組合物是一種藥劑學(xué)組合物，其包含(a)大豆抗毒素的治療學(xué)有效劑量；以及(b)藥劑學(xué)上許可的載體。本說明書中的術(shù)語“治療學(xué)有效劑量”意味著上述大豆抗毒素的用于達(dá)成骨疾病治療或預(yù)防功效而充分的量。在本發(fā)明的組合物制備為藥劑學(xué)組合物的情況下，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物包含藥劑學(xué)上許可的載體。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物中所包含的藥劑學(xué)上許可的載體為在制劑時通常利用的載體，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿膠、磷酸鈣、藻酸鹽、凝膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、丙基苯甲酸甲酯、滑石、硬脂酸鎂以及礦油等，但并不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分以外，還可包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保存劑等。藥劑學(xué)上許可的合適的載體及制劑詳細(xì)記載于雷明登氏藥學(xué)全書(Remington’sPharmaceutical Sciences, 19th ed.，1995)。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能夠以口服或非口服方式進行投用，優(yōu)選為應(yīng)用口服投用方式。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的合適的投用量根據(jù)制劑化方式、投用方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、投用時間、投用途徑、排泄速度及反應(yīng)敏感性等因素，能夠以多種方式進行處方。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的普通投用量，以成人為基準(zhǔn)，在O. 001mg/kg-100mg/kg體重范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易實施的方法，并利用藥劑學(xué)上許可的載體和/或賦形劑來進行制劑化，由此能夠以單位容量形態(tài)制備，或者內(nèi)裝于多容量容器內(nèi)進行制備。此時，劑型可以是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液、糖漿劑或者乳化液形態(tài)，還可以是浸膏劑、散劑、粉末劑、顆粒劑、錠劑或者膠囊劑形態(tài)，還可以包含分散劑或者穩(wěn)定化劑。本發(fā)明的組合物可提供為食品組合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的組合物是食品學(xué)組合物，其包含(a)大豆抗毒素的食品學(xué)有效劑量；以及(b)食品學(xué)上許可的載體。本發(fā)明的組合物制備為食品組合物的情況下，作為有效成分不僅包含大豆抗毒素，還包含制備食品時通常添加的成分，例如，包含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、營養(yǎng)素、調(diào)味劑及香味劑。上述碳水化合物的例子，有單糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麥芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖，例如糊精、環(huán)糊精等常規(guī)的糖以及木糖醇、山梨糖醇及赤蘚糖醇等糖醇。作為香味劑可使用天然香味劑(索馬甜、甜葉菊萃取物例如，萊鮑迪甙A、甘草素等)及合成香味劑(糖精、阿斯巴甜等)。例如，在本發(fā)明的食品組合物制備為保健飲料的情況下，除了本發(fā)明的大豆抗毒素以外，還可包含檸檬酸、液態(tài)果糖、食糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲萃取液、大棗萃取液、甘草萃取液等。有利的效果如下對本發(fā)明的特征及優(yōu)點進行簡略。 (i)本發(fā)明提供一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病的治療或預(yù)防用組合物。(ii)作為本發(fā)明的有效成分的大豆抗毒素在成骨細(xì)胞用于促進成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的降解，通過減少NFk B受體活化因子配體的信使核糖核酸水準(zhǔn)來抑制成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的分化，并且大大緩解因投用高容量的維生素D而被誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的動物模型的骨質(zhì)疏松癥狀。(iii)本發(fā)明的組合物具有預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥等，因破骨細(xì)胞的過度增殖及活性而導(dǎo)致的骨疾病的功效。

圖Ia是在MC3T3E1細(xì)胞增殖期間，以20 μ M的濃度處理大豆抗毒素，來測定細(xì)胞的形狀的結(jié)果。表示細(xì)胞的形狀在經(jīng)過大豆抗毒素處理的情況與未經(jīng)過大豆抗毒素處理的情況類似。圖Ib是在MC3T3E1細(xì)胞增殖期間，以10 μ M及20 μ M的濃度處理大豆抗毒素之后測定細(xì)胞的數(shù)量的結(jié)果。表示細(xì)胞的數(shù)量為與未經(jīng)過大豆抗毒素處理的情況類似的水準(zhǔn)。圖Ic是在MC3T3E1細(xì)胞增殖期間，以10 μ M及20 μ M的濃度處理大豆抗毒素之后，經(jīng)過MTT測定的結(jié)果。表示細(xì)胞的數(shù)量為與未經(jīng)過大豆抗毒素處理的情況類似的水準(zhǔn)。圖Id是在誘導(dǎo)MC3T3E1細(xì)胞分化的同時以O(shè) μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ、25 μ Μ、50 μ M的濃度處理大豆抗毒素來測定成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)的結(jié)果。并表示隨著大豆抗毒素的處理濃度增加，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)減少的結(jié)果。圖Ie是在誘導(dǎo)MC3T3細(xì)胞分化的同時以10 μ M及20 μ M的濃度處理大豆抗毒素來測定成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的信使核糖核酸水準(zhǔn)的結(jié)果。表示成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的信使核糖核酸水準(zhǔn)與大豆抗毒素的處理濃度無關(guān)地沒有變化。圖If是在誘導(dǎo)MC3T3細(xì)胞分化的同時以20 μ M的濃度處理大豆抗毒素，并比較在此處理作為蛋白酶體抑制劑的MG132的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)與未處理作為蛋白酶體抑制劑的MG132的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)的結(jié)果。表示處理作為蛋白酶體抑制劑的MG132的情況，針對未經(jīng)過處理的情況，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)重新恢復(fù)。
圖2a是誘導(dǎo)從小鼠的頭蓋骨分離出的成骨細(xì)胞分化，并以0μΜ、10μΜ、20μΜ的濃度處理大豆抗毒素，并測定成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)的結(jié)果。并表示成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)隨著大豆抗毒素的處理濃度增加而減少。D21意味著誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化之后的第21天。圖2b是在與圖2a相同的條件下測定成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的信使核糖核酸的水準(zhǔn)的結(jié)果。表示成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的信使核糖核酸水準(zhǔn)與大豆抗毒素的處理濃度無關(guān)地沒有變化。但是，作為成骨細(xì)胞的分化標(biāo)記物的骨I丐素(Osteocalcin)的信使核糖核酸(mRNA)水準(zhǔn)隨著大豆抗毒素的處理濃度而被減少。圖2c是通過實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定NF κ B受體活化因子配體和護骨素的信使核糖核酸水準(zhǔn)的結(jié)果。就NF κ B受體活化因子配體而言，雖然隨著大豆抗毒素的處理濃度而減少，但是，就護骨素而言，呈現(xiàn)出類似或者有所增加的傾向。圖3a是在誘導(dǎo)從小鼠的頭蓋骨分離出的成骨細(xì)胞分化的同時，以0μΜ、10μΜ、 20 μ M的濃度處理大豆抗毒素并進行堿性磷酸酶(ALP)染色來測定的結(jié)果。通過堿性磷酸酶染色(分化后7天)的減少可確認(rèn)隨著大豆抗毒素的處理濃度增加而抑制成骨細(xì)胞的分化。圖3b是在與圖3a相同的條件下，通過茜素紅(Alizarin Red)染色(分化后21天)來測定成骨細(xì)胞的分化的結(jié)果。可知，隨著大豆抗毒素的處理濃度增加，成骨細(xì)胞的分化隨之減少的結(jié)果。圖3c是在與圖3a相同的條件下，在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化之后第21天測定鈣濃度的結(jié)果?？芍S著大豆抗毒素的處理濃度增加，鈣濃度隨之減少。圖4&是在誘導(dǎo)狀胃264.7細(xì)胞分化的同時以(^] 、5 4]\1、1(^]\1、25 4]\1的濃度處理大豆抗毒素，通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色確認(rèn)分化為破骨細(xì)胞的結(jié)果。并表示隨著大豆抗毒素的處理濃度增加而抑制分化為破骨細(xì)胞的結(jié)果。圖5a及圖5b和圖6a及圖6b表示利用通過高容量的維生素D投用而確立的骨質(zhì)疏松癥小鼠動物模型，來證明大豆抗毒素的骨保護效果的實驗結(jié)果。圖5a是通過微計算機斷層掃描技術(shù)來分析動物模型小鼠的頭蓋骨的三維照片。圖5b是通過微計算機斷層掃描技術(shù)來分析動物模型小鼠的頭蓋骨之后，執(zhí)行BMC分析、BMD分析及TMD分析的結(jié)果。可知，因投用高容量的維生素D而被誘導(dǎo)的小鼠的頭蓋骨的骨質(zhì)疏松癥狀，通過投用大豆抗毒素而明確得到恢復(fù)。圖6a是通過三色染色方法，在因投用高容量的維生素D而被確立的骨質(zhì)疏松癥動物模型中，測定因投用大豆抗毒素而致使膠原蛋白合成受到影響的結(jié)果?？芍?，隨著大豆抗毒素的投用，膠原蛋白合成隨之增加。并且，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色測定因投用大豆抗毒素而致使破骨細(xì)胞的增殖受到影響的結(jié)果，可知，根據(jù)大豆抗毒素投用，破骨細(xì)胞的數(shù)量被減少。圖6b對圖6a中的測定結(jié)果進行數(shù)值化來用曲線圖來表示。
具體實施方式下面，通過實施例對本發(fā)明進行更詳細(xì)地說明。這些實施例僅用于更具體地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的主旨，本發(fā)明的范圍不局限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。實施例實驗方法及材料實施例I:細(xì)胞培養(yǎng)將從新生18. 5天的小鼠頭蓋骨分離出的成骨細(xì)胞和小鼠來源的MC3T3E1細(xì)胞，與包含10%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基一起放入到培養(yǎng)容器中，并在含有5%二氧化碳的37°C恒溫器中進行培養(yǎng)。為了誘導(dǎo)成骨細(xì)胞與MC3T3E1細(xì)胞的分化，在包含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基中添加50 μ g/ml的抗壞血酸(ascorbic acid)和IOmM的β-甘油憐酸酯(beta-glycerophosphate)。RAW264. 7 (小鼠單核細(xì)胞 / 巨卩遼細(xì)胞(murine monocyte/macrophage))細(xì)胞在包含10%胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)，為了誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞的分化，在包含10%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基中添加200ng/ml的NF κ B受體活化因 子配體。實施例2:骨質(zhì)疏松癥小鼠模型為了誘導(dǎo)正常小鼠(C57BL/6 )成為骨質(zhì)疏松癥小鼠，以皮下注射方式，一天注射一次高容量的維生素D(60X 104IU/kg體重)，如此共注射三天之后，從首次注射當(dāng)天開始觀察10天。通過投用高容量的維生素D，破骨細(xì)胞的活性得以增加，據(jù)此減少小鼠的骨量。實施例3:準(zhǔn)備大豆抗毒素用0. 5%曲霉(Aspergillus spp.)菌株處理市場上銷售的浸水10小時左右的Ikg豆芽之后，用甲醇(5L)溶劑，從在20°C下培養(yǎng)3天的豆中獲取含有1300ppm大豆抗毒素的210g萃取物。將獲取的含有大豆抗毒素的萃取物溶解于CH2C12之后，對所溶解的分餾物進行減壓蒸懼，利用將娃膠用作填充劑的柱層析(column chromatography)法,并使用CH2C12與甲醇的比率為97 3的溶劑，分離成純大豆抗毒素I、II、III或者這些混合物形態(tài)，并將這些用于實驗。實施例4:處理大豆抗毒素就MC3T3E1細(xì)胞而言，在分化誘導(dǎo)過程期間，以O(shè) μ M、5 μ M、10 μ M、25 μ M、50 μ M的濃度，在MC3T3E1細(xì)胞處理了大豆抗毒素。就RAW264. 7細(xì)胞而言，在分化誘導(dǎo)過程期間，以O(shè) μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ、25 μ Μ、50 μ M的濃度，在RAW264. 7細(xì)胞處理了大豆抗毒素。就從小鼠頭蓋骨中分離的成骨細(xì)胞而言，在分化誘導(dǎo)過程期間，以0μΜ、10μΜ、20μΜ的濃度,在該成骨細(xì)胞處理了大豆抗毒素。就投用高容量的維生素D來誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的小鼠而言，以O(shè) μ g/kg、0. 5 μ g/kg、5 μ g/kg體重的濃度，一天處理一次大豆抗毒素,如此共處理9天。實驗結(jié)果實驗例I:在成骨細(xì)胞增殖與分化過程中大豆抗毒素的效果為了揭示與大豆抗毒素的成骨細(xì)胞增殖相關(guān)的功能，用大豆抗毒素處理MC3T3細(xì)胞之后，執(zhí)行MTT分析，其結(jié)果可知，細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的數(shù)量與未用大豆抗毒素來處理的情況類似(參照圖la、圖Ib及圖lc)。并且，誘導(dǎo)MC3T3細(xì)胞的增殖及分化，以O(shè) μ M、5 μ M、10 μ M、25 μ M、50 μ M的濃度處
理大豆抗毒素，測定成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)，其結(jié)果可知，隨著經(jīng)過處理的大豆抗毒素的濃度增加，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn)隨之減少(參照圖Id)。接著，為了確認(rèn)通過大豆抗毒素處理導(dǎo)致成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)水準(zhǔn)減少是否起源于成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的信使核糖核酸水準(zhǔn)減少，而在處理大豆抗毒素之后，勘察了成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的信使核糖核酸水準(zhǔn)。其結(jié)果可知，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的信使核糖核酸量與大豆抗毒素的處理無關(guān)地沒有變化(參照圖le)。其次，勘察了大豆抗毒素在成骨細(xì)胞的增殖及分化過程中減少成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的量的效果是否通過促進泛素結(jié)合的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的降解來降低成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的機制來實現(xiàn)。通過利用作為蛋白酶體抑制劑(proteasomeinhibitor)的MG132處理成骨細(xì)胞,來確認(rèn)Runx2蛋白質(zhì)的水準(zhǔn),其結(jié)果已確認(rèn)，因大豆抗毒素而被減少的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的量借助MG132的處理而得到恢復(fù)(參照圖If)。這些結(jié)果證實了大豆抗毒素促進在成骨細(xì)胞中與泛素結(jié)合的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的降解，由此具有抑制成骨細(xì)胞的分化的效果。就大豆抗毒素的功能而言，對從小鼠的頭蓋骨分離出的成骨細(xì)胞進行分化(誘導(dǎo)分化后，經(jīng)21天)，以O(shè) μ Μ、10 μ Μ、20 μ M的濃度處理大豆抗毒素之后，分離與成骨細(xì)胞的分化相關(guān)的蛋白質(zhì)和信使核糖核酸，來勘察這些的水準(zhǔn)。如同上述，在MC3T3細(xì)胞中再次證明了，隨著大豆抗毒素的處理濃度增加，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)水準(zhǔn)隨之減少(參照圖 2a)，然而信使核糖核酸水準(zhǔn)無任何變化(參照圖2b )?？梢姡b于隨著大豆抗毒素的處理濃度增加，作為成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物的骨鈣素的信使核糖核酸水準(zhǔn)隨之減少，可知分化為成骨細(xì)胞的過程將被大豆抗毒素抑制(參照圖2b)。并且，通過實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)勘察到，在成骨細(xì)胞分化過程中分泌而促進破骨細(xì)胞的分化的NF κ B受體活化因子配體及作為NF κ B受體活化因子配體的受體的護骨素的信使核糖核酸表達(dá)水準(zhǔn)。其結(jié)果，已確認(rèn)到NF κ B受體活化因子配體的信使核糖核酸水準(zhǔn)隨著大豆抗毒素的濃度增加而被減少，但是存在護骨素的信使核糖核酸水準(zhǔn)沒有變化或者有所增加的傾向(參照圖2c)。結(jié)果已確認(rèn)，大豆抗毒素在成骨細(xì)胞的分化過程中減少NF κ B受體活化因子配體/護骨素比(參照圖2c)。其結(jié)果，推定為，雖然大豆抗毒素在成骨細(xì)胞的增殖過程中沒有太大影響，但在分化過程中通過促進成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2的蛋白質(zhì)降解來抑制分化，由此減少NFk B受體活化因子配體/護骨素比，從而抑制破骨細(xì)胞的分化。實驗例2:大豆抗毒素的成骨細(xì)胞分化抑制效果在誘導(dǎo)從小鼠頭蓋骨分離出的成骨細(xì)胞分化的過程中，以0μΜ、10μΜ、20μΜ的不同濃度處理大豆抗毒素，通過ALP染色(誘導(dǎo)分化后7天)和茜素紅染色(誘導(dǎo)分化之后21天)來測定分化程度，其結(jié)果已確認(rèn)，隨著大豆抗毒素的濃度增加，成骨細(xì)胞的分化隨之抑制(參照圖3a、圖3b)。并且，測定鈣濃度(誘導(dǎo)分化之后21天)，其結(jié)果已確認(rèn)，隨著大豆抗毒素的濃度增加，鈣濃度隨之減少(參照圖3c)。這些結(jié)果與實驗例I所示的在成骨細(xì)胞的分化過程中勘察功能基因的結(jié)果一致。實驗例3:大豆抗毒素的破骨細(xì)胞分化抑制效果在誘導(dǎo)將狀1264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的過程中，以0“] 、54]\1、1(^]\1、254]\1的不同濃度處理大豆抗毒素，經(jīng)過4天之后，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色法觀察了破骨細(xì)胞。其結(jié)果已確認(rèn)，隨著大豆抗毒素的濃度增加，經(jīng)過抗酒石酸酸性磷酸酶染色的破骨細(xì)胞隨之減少(參照圖4a)。這些結(jié)果與實驗例I所示的在成骨細(xì)胞分化過程中勘察功能基因的
結(jié)果一致。
實驗例4:大豆抗毒素在骨質(zhì)疏松癥誘導(dǎo)小鼠模型中起到的保護骨效果為了通過體內(nèi)(in vivo)實驗驗證在體外(in vitro)所驗證的大豆抗毒素的破骨細(xì)胞分化抑制效果，給小鼠一天注射一次高容量的維生素D，如此共注射3天，來誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥。從首次注射維生素D的當(dāng)天開始，將大豆抗毒素按一天一次以不同濃度注射9天之后，第10天致死小鼠，通過微計算機斷層掃描技術(shù)分析、三色(TrichiOme)染色及抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察了頭蓋骨。其結(jié)果已確認(rèn)，骨礦含量(bone mineral contents, BMC)、骨礦密度(bone mineral density, BMD)、組織礦物含量(tissue mineral contents, TMC)隨著大豆抗毒素的濃度增加而增加(參照圖5a及圖5b)。通過三色染色已確認(rèn)，作為骨的細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白隨著投用大豆抗毒素而增加，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察破骨細(xì)胞的結(jié)果，已確認(rèn)根據(jù)大豆抗毒素，破骨細(xì)胞的數(shù)量會減少(參照圖6a及圖6b)。以上，詳細(xì)說明了本發(fā)明的特定部分，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，這些具體的說明僅作為優(yōu)選實例，本發(fā)明的范圍并不局限于此是顯而易見的。因此，應(yīng)視為本發(fā)明的實質(zhì)性范圍根據(jù)所附的權(quán)利要求書及其等價物來定義?！?br> 權(quán)利要求
1.一種骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，包含大豆抗毒素作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述骨疾病是由癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移引發(fā)的骨損傷、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化癥、佝僂病、纖維性骨炎、骨發(fā)育不全或代謝性骨疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述大豆抗毒素用于抑制破骨細(xì)胞的分化。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述大豆抗毒素在成骨細(xì)胞或者前成骨細(xì)胞中促進成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的降解。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述大豆抗毒素在成骨細(xì)胞中抑制核因子K B受體活化因子配體的信使核糖核酸表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述大豆抗毒素通過抑制成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的分化來減少骨的循環(huán)比或骨轉(zhuǎn)換率。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述大豆抗毒素是大豆抗毒素I。
8.一種骨疾病預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，其特征在于，包含 Ca)大豆抗毒素的治療學(xué)有效劑量；以及 (b)藥劑學(xué)上許可的載體。
9.一種骨疾病改善用食品學(xué)組合物,其特征在于,包含 Ca)大豆抗毒素的食品學(xué)有效劑量；以及 (b)食品學(xué)上許可的載體。
10.一種大豆抗毒素的用途，其特征在于，用于制備骨疾病的預(yù)防或治療用組合物。
11.一種骨疾病的預(yù)防或治療方法，其特征在于，包括將包含大豆抗毒素作為有效成分的藥劑學(xué)組合物投用給骨疾病患者的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含大豆抗毒素作為有效成分的骨疾病的治療或預(yù)防用組合物。作為本發(fā)明的有效成分的大豆抗毒素在成骨細(xì)胞中促進成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2蛋白質(zhì)的降解，并減少核因子κB受體活化因子配體的信使核糖核酸水準(zhǔn)，來抑制破骨細(xì)胞的分化，并且，大大緩解因投用高容量的維生素D而患有骨質(zhì)疏松癥的動物模型的骨質(zhì)疏松癥狀。本發(fā)明的組合物開發(fā)為因骨質(zhì)疏松癥及癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生骨疾病等的預(yù)防及治療用食品的可能性巨高。
文檔編號A61K31/585GK102883717SQ201180020939
公開日2013年1月16日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者崔齊容, 韓慜洙, 鄭在煥, 林景恩, 金容訓(xùn), 黃永鉉, 金仁謙 申請人:慶北大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團