專(zhuān)利名稱(chēng)：抗erbb3抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域涉及分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及腫瘤學(xué)。更具體地，該領(lǐng)域是結(jié)合人類(lèi)ErbB3/HER3的人源化抗體。背景
HER3/c-ErbB3 (在此稱(chēng)作ErbB3)是表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)家族的一個(gè)成員。ErbB3結(jié)合神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/heregulin (NRG/HRG)。EGFR家族中的受體是具有細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的單跨膜受體。雖然其他EGFR家族成員(B卩，EGFR/HERl/ErbBl、HER2/ErbB2以及HER4/ErbB4)每個(gè)都具有酪氨酸激酶活性，但是ErbB3具有極少或者沒(méi)有酪氨酸激酶活性，并且因此是“無(wú)活性激酶(kinase-dead)”。EGFR家族的胞外域(EOT)包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域I和3 (也稱(chēng)作結(jié)構(gòu)域LI和L2)負(fù)責(zé)配體結(jié)合。半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域2和4 (也稱(chēng)作結(jié)構(gòu)域LI和L2)涉及與受體配偶體(receptor partners)的二聚體化。在配體結(jié)合時(shí),該E⑶就經(jīng)歷構(gòu)象變化。結(jié)構(gòu)域2和4的相互作用(該作用維持該受體的拘束構(gòu)象(tethered conformation)(無(wú)活性))解除，并且延展構(gòu)象(extended conformation)(活性的)得以采取。該延展構(gòu)象有利于與其他受體配偶體的二聚體化。HER2/ErbB2是這一普遍規(guī)則的唯一例外，即，Herf-EOT是結(jié)構(gòu)性地處于這一延展構(gòu)象。迄今為止還沒(méi)有鑒定出用于HER2的配體。因?yàn)镋rbB3缺乏內(nèi)在激酶活性，所以它必須與要被酪氨酸磷酸化激活的另一活性酪氨酸激酶受體二聚體化。二聚體化可以發(fā)生在兩種不同的受體之間(異二聚體化)，例如ErbB3 和 EGFR/HERl/ErbBl、HER2/ErbB2 或 HER4/ErbB4。最近，還顯示出 ErbB3 與 MET 二聚體化。在與另一酪氨酸激酶受體相結(jié)合時(shí)，則ErbB3就通過(guò)ErbB3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的至少九個(gè)酪氨酸殘基的磷酸化而被激活，并且然后迅速地與受體或下游信號(hào)分子相關(guān)聯(lián)。ErbB3磷酸化的酪氨酸殘基中的六個(gè)直接與磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3)的p85亞基相關(guān)聯(lián)，這導(dǎo)致受PI3K/Akt軸線(xiàn)控制的細(xì)胞存活途徑的激活。由ErbB3的不受調(diào)節(jié)的二聚體化和/或不受調(diào)節(jié)的磷酸化而引起的ErbB3的組成型活化可以導(dǎo)致某些癌癥。ErbB3的過(guò)表達(dá)與多種癌(例如，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌、以及頭頸部癌)的預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)。ErbB3的過(guò)表達(dá)還與肺癌、胃癌、以及結(jié)直腸癌的局部到遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及前列腺癌的骨侵襲相關(guān)聯(lián)(Sithanandam (斯坦南達(dá)姆)等人，2008，《癌癥基因治療》(Cancek Gene Theeapy)15:413))0已經(jīng)將ErbB3的過(guò)表達(dá)與若干癌癥治療的抗性聯(lián)系起來(lái)，包括非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)與頭頸部癌中利用EGFR酪氨酸激酶抑制劑的治療、乳腺癌中利用Her2抑制劑的治療以及胰腺癌中利用放射療法的治療。而且，NRG(ErbB3的一種配體)的過(guò)表達(dá)也與對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療的抗性有關(guān)。Chen (陳)等人描述了抑制NRG功能的抗ErbB3單克隆抗體的用途并且顯示了針對(duì)乳腺癌與卵巢癌的抑制活性中的生長(zhǎng)(Chen等人，1996，《生物化學(xué)雜志》(J. BiolChem. ) 271:7620)。對(duì)于改進(jìn)可以用作治療劑的抗ErbB3抗體存在需要。概述本發(fā)明基于一個(gè)特異性結(jié)合人類(lèi)ErbB3的抗體家族的發(fā)現(xiàn)。這些抗體包含基于特異性結(jié)合人類(lèi)ErbB3的多個(gè)⑶R的ErbB3結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)用作治療劑時(shí)，這些抗體是經(jīng)工程化的(例如，人源化的)以降低或消除施藥于人類(lèi)患者時(shí)的免疫反應(yīng)。在此披露的這些抗體阻止或抑制人類(lèi)ErbB3的激活。在一些實(shí)施方案中，這些抗體阻止ErbB3結(jié)合至一種配體(例如，NRG/HRG)，從而中和ErbB3的生物活性。在其他實(shí)施方案中，這些抗ErbB3抗體抑制ErbB3 二聚體化，從而中和ErbB3的生物活性。在此披露的這些抗體可以用以體外地或體內(nèi)地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)施藥于人類(lèi)癌癥患者(或動(dòng)物 模型，比如小鼠模型)時(shí)，這些抗體抑制或降低人類(lèi)患者(或動(dòng)物模型)中的腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明的這些以及其他方面以及優(yōu)勢(shì)通過(guò)以下的圖、詳細(xì)描述以及權(quán)利要求來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。如在此使用的，“包括”不表示限制，并且引用的實(shí)例是非限制性的。


參考以下附圖可以更完全地理解本發(fā)明。圖I (現(xiàn)有技術(shù))是一種典型抗體的圖示。圖2 是一個(gè)示意圖，顯示顯示了表示為 04D01、09D03、11G01、12A07、18H02、22A02、以及24C05的抗體的完整免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。每一抗體的氨基酸序列彼此對(duì)齊，并且互補(bǔ)決定序列(Complementary Determining Sequences, CDR)(卡巴特定義(Kabat definition)) CDRp CDR2以及CDR3在方框中得以鑒別。未加以方框的序列表示骨架(FR)序列。圖3是一個(gè)示意圖，顯示顯示了圖2中每一免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的CTR1、⑶R2以及⑶R3序列(卡巴特定義)。圖4 是一個(gè)示意圖，顯示顯示了抗體 04D01、09D03、11G01、12A07、18H02、22A02、以及24C05的完整免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。每一抗體的氨基酸序列彼此對(duì)齊，并且⑶R1XDR2以及⑶R3序列(卡巴特定義)在方框中得以鑒別。未加以方框的序列表示骨架(FR)序列。圖5是一個(gè)示意圖，顯示了圖4中每一免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的⑶Rp OTR2以及OTR3序列(卡巴特定義)。圖6A與6B是一個(gè)圖表，總結(jié)了測(cè)量陰性對(duì)照(鼠IgG( Λ ))以及抗ErbB3單克隆抗體(04D01 ( ■ )、12A07 (〇)、18H02 ( O )、22A02 ( ·)以及 24C05 ( □))對(duì)于抑制 NRGl- β I結(jié)合至hErbB3上的中和活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6A)以及測(cè)量通過(guò)抗ErbB3mAb 09D03 ( ▲)與11G0K*), NRGl-β I增強(qiáng)地結(jié)合至rhErbB3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6B)。圖7是一個(gè)圖表，總結(jié)了測(cè)量陰性對(duì)照(鼠IgG)以及抗ErbB3單克隆抗體(04D01、09D03、11G01、12A07、18H02、22A02 以及 24C05)對(duì)于抑制 NRGl-β I 結(jié)合至 hErbB3 上的中和活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8是一個(gè)圖表，總結(jié)了測(cè)量在CHO細(xì)胞表面表達(dá)的嵌合蛋白Her2/3d2的抗ErbB3單克隆抗體的細(xì)胞表面識(shí)別的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖9是一個(gè)圖表，總結(jié)了在NRGl-β I存在下，在表達(dá)Her2與ErbB3的BaF/3細(xì)胞中，測(cè)量陰性對(duì)照IgG (鼠IgG(A))以及抗ErbB3單克隆抗體(04D01 ( ■ )、(Μ)03 (▼)、11G01( )、12Α07(〇)、18Η02( )、22Α02( ·)以及 24C05( □))的抗增殖活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10是一個(gè)圖表，總結(jié)了在NRGl-β I存在下。在MCF7細(xì)胞中測(cè)量抗ErbB3單克隆抗體 04D01( ■ ) ,09D03 ( ▼ }, 11G01 ( )、12A07( O )、18H02( O )、22A02( ·)以及24C05 (口 )的抗增殖活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11是一個(gè)圖表，總結(jié)了在血清存在下、在用5g/ml的抗體進(jìn)行處理的SKBR-3細(xì)胞中，測(cè)量陰性對(duì)照(鼠IgG)以及抗ErbB3單克隆抗體(04D01、09D03、llG01、12A07、18H02、22A02以及24C05)的抗增殖活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖12是一個(gè)圖表，總結(jié)了在SKBR-3細(xì)胞中，測(cè)量陰性對(duì)照IgG以及抗ErbB3單克隆抗體(04D01、09D03、11G01、12A07、18H02、22A02 以及 24C05)對(duì)于由 NRG 引起的 ErbB3 磷 酸化的抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。還顯示了無(wú)抗體/無(wú)配體對(duì)照以及無(wú)抗體對(duì)照。圖13A與13B是圖表，表示了如通過(guò)ELISA確定的那樣，在MCF7細(xì)胞中(圖13A)以及 DU145 細(xì)胞中(圖 13B)測(cè)量抗 ErbB3 單克隆抗體(04D01、09D03、11G01、12A07、18H02、22A02以及24C05)在響應(yīng)NRGl-β I時(shí)，對(duì)Akt磷酸化的抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。還顯示了無(wú)抗體/無(wú)配體對(duì)照以及無(wú)抗體對(duì)照。圖14是一個(gè)圖表，總結(jié)了以20mg/kg的劑量、在CB17 SCID小鼠(空白對(duì)照，PBS( ))BxPC3胰腺腫瘤異種移植模型中，測(cè)量抗ErbB3單克隆抗體(04D01 ( Δ )、09D03 (*)、11G01 (0)、12Α07 (Α)>18Η02 (·)、22Α02 (_)、24C05 (〇))以及人類(lèi) IgG 對(duì)照(一■―)的腫瘤抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖15是一個(gè)示意圖，顯示了 24C05的完整重鏈可變區(qū)以及表示為Sh24C05 Hv3_7、Sh24C05 Hv3-ll、Sh24C05 Hv3_ll N62S、Sh24C05Hv3_21、Sh24C05 Hv3_23、Sh24C05 Hv3_30以及Hu24C05 HvA的完整人源化重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。每一重鏈可變區(qū)的氨基酸序列彼此對(duì)齊，并且互補(bǔ)決定序列(⑶R)(卡巴特定義)OTR1、⑶R2以及⑶R3在方框中得以鑒別。未加以方框的序列表示骨架(FR)序列。圖16是一個(gè)示意圖，顯示了 24C05的完整氫鏈可變區(qū)以及表示為Sh24C05 Kvl_9、Sh24C05 Kvl-16、Sh24C05 Kvl-17、Sh24C05Kvl_33、Sh24C05 Kvl-39 以及 Hu24C05 KvA 的完整人源化輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。每一氫鏈可變區(qū)的氨基酸序列彼此對(duì)齊，并且CDRpCDR2以及CDR3序列(卡巴特定義)在方框中得以鑒別。未加以方框的序列表示骨架(FR)序列。圖17是Biacore傳感圖(Biacore sensorgrams),表不了測(cè)量抗ErbB3單克隆抗體Sh24C05-31 N62S-IgGl、Ab#6、Ul-53以及U1-59的動(dòng)力學(xué)值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖18A是一個(gè)圖表，總結(jié)了測(cè)量陰性對(duì)照(人類(lèi)IgG (□))以及抗ErbB3單克隆抗體(Sh24C05-25 N62S-IgGl (A)>Sh24C05-25N62S-IgG2( Δ )、Sh24C05_31 N62S_IgGl( ·)以及Sh24C05-31N62S-IgG2(〇))的中和活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖18B是一個(gè)圖表，總結(jié)了測(cè)量人類(lèi) IgG (□)以及抗 ErbB3 單克隆抗體 Ab#6 IgG2 ( ▼ ) , U1-53 ( )與 Ul_59 (■)的中和活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖19A是一個(gè)圖表，總結(jié)了在NRGl-β I存在下、在表達(dá)Her2和ErbB3的BaF/3細(xì)胞中，測(cè)量陰性對(duì)照(人類(lèi)IgG(D))以及抗ErbB3單克隆抗體(Sh24C05-25 N62S-IgGl(A)>Sh24C05-25 N62S_IgG2 ( Λ )、Sh24C05_31 N62S_IgGl ( ·)以及 Sh24C05_31 N62S_IgG2(O))的抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖19B是一個(gè)圖表，總結(jié)了在NRGl-βΙ存在下，在表達(dá)Her2和ErbB3的BaF/3細(xì)胞中，測(cè)量人類(lèi)IgG (□)以及抗ErbB3單克隆抗體(Sh24C05_31N62S-IgGl ( · ), Ab#6IgG2 (ψ)% Ul-53 ( )以及 Ul-59 (■))的抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖20是一個(gè)圖表，總結(jié)了在正生長(zhǎng)的SKBR-3細(xì)胞中，測(cè)量陰性對(duì)照(人類(lèi)IgG)以及抗 ErbB3 單克隆抗體(Sh24C05-25 N62S_IgGl、Sh24C05_25 N62S_IgG2、Sh24C05_31N62S-IgGl、以及Sh24C05-31N62S-IgG2)對(duì)于ErbB3的穩(wěn)定狀態(tài)磷酸化的抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖21是一個(gè)圖表，總結(jié)了在正生長(zhǎng) 的SKBR-3細(xì)胞中，測(cè)量通過(guò)陰性對(duì)照(人類(lèi)IgG)以及抗ErbB3 單克隆抗體(Sh24C05-25N62S-IgGl、Sh24C05-25 N62S-IgG2、Sh24C05_31N62S-IgGl以及Sh24C05-31 N62S_IgG2)的ErbB3受體降解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖22是一個(gè)圖表，總結(jié)了以2mg/kg的劑量，在CB17 SCID小鼠BxPC3胰腺腫瘤異種移植模型中，測(cè)量人類(lèi)IgG、鼠IgG或抗ErbB3單克隆抗體的腫瘤抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(鼠24C05 ( Λ )、Sh24C05-31N62S IgGl (·)、Sh24C05_31 N62S IgG2 ( )、Sh24C05_25 N62SIgGl (A)>Sh24C05-25 N62S IgG2 (■)、空白對(duì)照(□)、鼠 IgG (x)、以及人類(lèi) IgG (O))。圖23A是一個(gè)圖表，總結(jié)了以5mg/kg的劑量，在NCR裸鼠Calu_3非小細(xì)胞性肺癌異種移植模型中，測(cè)量鼠IgG或抗ErbB3單克隆抗體的腫瘤抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(空白對(duì)照(□)、鼠 IgG (x)、Sh24C05-31 N62S IgGl (A)>Ab#6IgG2 (·)以及 Ul-59 (·))。圖23Β是一個(gè)圖表，總結(jié)了以10mg/kg的劑量，在NCR裸鼠Calu_3非小細(xì)胞性肺癌異種移植模型中，測(cè)量鼠IgG或抗ErbB3單克隆抗體的腫瘤抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(空白對(duì)照(□)、鼠 IgG (x)、Sh24C05-31 N62S IgGl (A)>Ab#6 IgG2 (·)以及 Ul-59 (·))。圖23C是一個(gè)圖表，總結(jié)了以20mg/kg的劑量，在NCR裸鼠Calu_3非小細(xì)胞性肺癌異種移植模型中測(cè)量鼠IgG或抗ErbB3單克隆抗體的腫瘤抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(空白對(duì)照(□)、鼠 IgG (x)、Sh24C05-31 N62S IgGl (A)>Ab#6 IgG2 (·)以及 Ul-59 (·))。圖24是一個(gè)圖表，總結(jié)了在NOD SCID小鼠MDA-MB-453乳腺癌異種移植模型中，測(cè)量人類(lèi)IgG、鼠或抗ErbB3單克隆抗體的腫瘤抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(空白對(duì)照(□)、人類(lèi)IgG(x)、5mg/kg 劑量的 Sh24C05-31 N62S IgGl(O)、10mg/kg 劑量的 Sh24C05_31 N62SIgGl(Λ )、20mg/kg 劑量的 Sh24C05-31 N62S IgGl (A)UOmgAg 劑量的 Ab#6IgG2 (·)以及l(fā)Omg/kg 劑量的 Ul-59 (·))。詳細(xì)描述在此披露的這些ErbB3抗體是基于某些單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，這些單克隆抗體由于它們中和人類(lèi)ErbB3多肽的生物活性的活性而被選擇。這些抗體包含免疫球蛋白可變區(qū)⑶R序列，這些序列限定一種針對(duì)ErbB3的結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，這些抗體阻止ErbB3結(jié)合至一種配體(例如，NRG/HRG)，從而中和ErbB3的生物活性。在其他實(shí)施方案中，這些抗ErbB3抗體抑制ErbB3 二聚體化，從而中和ErbB3的生物活性。仍在其他實(shí)施方案中，這些抗ErbB3抗體抑制ErbB3的磷酸化和下游信號(hào)。由于這些抗體的中和活性，它們對(duì)于抑制某些癌癥細(xì)胞以及腫瘤的生長(zhǎng)和/或增殖是有用的。這些抗體可以工程化以最小化或消除當(dāng)施藥于人類(lèi)患者時(shí)的免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，這些抗體被融合或接合至其他部分，比如可檢測(cè)的標(biāo)記或效應(yīng)分子(比如小分子毒素)。I.接合ErbB3的抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體包括(a) —種包括OTRm-⑶Rh2-⑶Rh3結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)以及(b)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)和該輕鏈可變區(qū)一起限定一種用于結(jié)合人類(lèi)ErbB3的單結(jié)合位點(diǎn)。CDRhi包括一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)5(04D01)、SEQ ID 號(hào)15 (09D03)、SEQ ID 號(hào)25 (11G01)、SEQ ID號(hào)34(12A07)、SEQ ID 號(hào)41 (18H02)、SEQ ID 號(hào)51 (22A02)、SEQ ID 號(hào)57 (24C05)、以及SEQ ID號(hào)75(24C05) <DRH2包括一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQID 號(hào)6(04D01)、SEQ ID 號(hào)16 (09D03)、SEQ ID 號(hào)26 (11G01)、SEQ ID 號(hào)35 (12A07)、SEQ ID 號(hào)42(18H02)、SEQ ID 號(hào)52 (22A02)、SEQ ID 號(hào)58(24C05)、以及 SEQ ID號(hào)148(Sh24C05Hv3-llN62S);并且CDRh3包括一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下 項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)7(04D01)、SEQ ID 號(hào)17 (09D03)、SEQ ID 號(hào)27 (11G01)、SEQ ID號(hào)36(12A07、22A02)、SEQ ID 號(hào):43 (18H02)、以及 SEQ ID 號(hào)59 (24C05)。貫穿該說(shuō)明書(shū)，一個(gè)具體的SEQ ID號(hào)后跟的括號(hào)里是為那一序列起源的抗體。例如，“SEQ ID號(hào)5(04D01)”意為SEQ ID號(hào)5來(lái)自抗體04D01。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)5(04D01)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào)6(04D01)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào)7(04D01)的氨基酸序列的CDRh3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)15 (09D03)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào)16(09D03)的氨基酸序列的CDRh2,以及一種包括SEQ ID號(hào)17(09D03)的氨基酸序列的 CDRh3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包含SEQ ID號(hào)25(11G01)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包含SEQ ID號(hào):26(11601)的氨基酸序列的⑶Rh2，以及一種包含SEQ ID號(hào):27(11601)的氨基酸序列的 CDRh3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)34(12A07)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào):35(12A07)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào)36 (12A07，22A02)的氨基酸序列的⑶RH3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)41(18H02)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào):42(18H02)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào):43(18H02)的氨基酸序列的 CDRh3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)51 (22A02)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào):52(22A02)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào)36 (12A07，22A02)的氨基酸序列的⑶rH3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括EQ ID號(hào)57(24C05)或SEQ ID號(hào)75 (24C05)的氨基酸序列的CDRhi,一種包括SEQ ID號(hào)58(24C05)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào)59 (24C05)的氨基酸序列的⑶RH3。在某些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)57 (24C05)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào)58(24C05)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào)59(24C05)的氨基酸序列的 CDRh3。在其他實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)75 (24C05)的氨基酸序列的⑶Rhi，一種包括SEQ ID號(hào)58(24C05)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQ ID號(hào)59(24C05)的氨基酸序列 的 CDRh3。
在某些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)57(24C05)或SEQ ID號(hào)75 (24C05)的氨基酸序列的CDRhi,一種包括SEQ ID號(hào)148(Sh24C05 Hv3_ll N62S)的氨基酸序列的CDRh2，以及一種包括SEQID號(hào)59(24C05)的氨基酸序列的⑶RH3。優(yōu)選地，這些⑶RH1、⑶Rh2以及⑶Rh3序列插入在多個(gè)人類(lèi)或人源化免疫球蛋白FR之間。該抗體可以是一種完整的抗體或一種抗原結(jié)合抗體片段。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括(a) —種包括OtRu-OTRu-OTRu結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)以及(b) —種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中該IgG輕鏈可變區(qū)和該IgG重鏈可變區(qū)一起限定一種用于結(jié)合人類(lèi)ErbB3的單結(jié)合位點(diǎn)。CDRu包括一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào):8(04D01, 12A07, 22A02)、SEQ ID 號(hào)18(09D03)、SEQID 號(hào)28 (11G01)、SEQ ID 號(hào)44 (18H02)、以及 SEQ ID 號(hào):60(24C05) ;CDRL2 包括一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID號(hào):9(04D01, 11G01,12A07, 22A02), SEQ ID號(hào)19 (09D03)、SEQ ID 號(hào)45 (18H02)、以及 SEQ ID 號(hào)61 (24C05);并且 CDRu 包括一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID號(hào)10(04D01，12A07，22A02)、SEQ ID號(hào)20(09D03)、SEQ ID 號(hào)29 (11G01)、SEQ ID 號(hào)46 (18H02)、以及 SEQ ID 號(hào)62 (24C05)。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào):8(04D01, 12A07, 22A02)的氨基酸序列的CDRli，一種包括 SEQ ID 號(hào)9(04D01, 11G01, 12A07, 22A02)的氨基酸序列的 CDRl2,—種包含 SEQ ID號(hào):10_01，12A07, 22A02)的氨基酸序列的 CDRlso在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)18(09D03)的氨基酸序列的OTRu, —種包括SEQ ID號(hào)19(09D03)的氨基酸序列的CDRm以及一種包括SEQ ID括20 (09D03)的氨基酸序列的 CDRl3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包含SEQ ID號(hào)28(11G01)的氨基酸序列的⑶Ru，一種包括SEQ ID 號(hào):9(04D01, IIGOI，12A07, 22A02)的氨基酸序列的 CDRl2,以及一種包括 SEQ ID號(hào)29(11G01)的氨基酸序列的CDRw在一些實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)44(18H02)的氨基酸序列的OTRu, —種包括SEQ ID號(hào):45(18H02)的氨基酸序列的CDRl2，以及一種包含SEQ ID號(hào)46(18H02)的氨基酸序列的 CDRl3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)60(24C05)的氨基酸序列的OTRu, —種包括SEQ ID號(hào):61(24C05)的氨基酸序列的CDRl2，以及一種包含SEQ ID號(hào)62(24C05)的氨基酸序列的 CDRl3。優(yōu)選地，這些⑶Ru、以及OTRu序列是插入在多個(gè)人類(lèi)或人源化免疫球蛋白FR之間。該抗體可以是一種完整的抗體或一種抗原結(jié)合抗體片段。
在一些實(shí)施方案中，該抗體包括(a) —種包括⑶Rm-⑶Rh2-⑶Rh3結(jié)構(gòu)的I gG重鏈可變區(qū)以及(b) —種包括^1^-^1^2-^1^3結(jié)構(gòu)的186輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)和該輕鏈可變區(qū)一起限定一種結(jié)合人類(lèi)ErbB3的單結(jié)合位點(diǎn)。該CDRhi是一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID號(hào)5(04D01)、SEQ ID號(hào)15 (09D03)、SEQ ID號(hào)25(11G01)、SEQ ID 號(hào)34(12A07)、SEQ ID 號(hào)41(18H02)、SEQ ID 號(hào)51(22A02)、SEQID號(hào)57(24C05)、以及SEQ ID號(hào)75 (24C05);該CDRh2是一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)6(04D01)、SEQ ID 號(hào)16 (09D03)、SEQ ID 號(hào)26 (11G01)、SEQID 號(hào):35 (12A07)、SEQ ID 號(hào)42 (18H02)、SEQ ID 號(hào):52 (22A02)、SEQ ID 號(hào)58 (24C05)、以及SEQ ID號(hào)148(Sh24C05Hv3-llN62S);并且該CDRh3是一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)7(04D01)、SEQ ID 號(hào)17 (09D03)、SEQ ID 號(hào)27 (11G01)、SEQ ID 號(hào)36(12A07、22A02)、SEQ ID 號(hào)43 (18H02)、以及 SEQ ID 號(hào)59(24C05)。該 CDRu是一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID號(hào)8(04D01，12A07，22A02)、SEQ ID 號(hào)18 (09D03)、SEQ ID 號(hào)28 (11G01)、SEQ ID 號(hào)44(18H02)、以及 SEQ ID號(hào)60(24C05);該⑶Rl2是一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID號(hào)9(04D01, 11G01, 12A07, 22A02)、SEQ ID 號(hào)19 (09D03)、SEQ ID 號(hào)45 (18H02)、以及SEQ ID號(hào)61(24C05);并且該⑶Ru是一種選自下組的氨基酸序列，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)10(04D01, 12A07，22A02)、SEQ ID 號(hào)20(09D03)、SEQ ID 號(hào)29(11G01)、SEQ ID號(hào):46 (18H02)、以及 SEQ ID 號(hào):62 (24C05)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種選自下組的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)2(04D01)、SEQ ID 號(hào)12 (09D03)、SEQ ID 號(hào)22 (11G01)、SEQ ID號(hào)31(12A07)、SEQ ID 號(hào):38 (18H02)、SEQ ID 號(hào)48 (22A02)、SEQ ID 號(hào)54 (24C05)、以及SEQ ID號(hào)154(Sh24C05 Hv3-ll N62S);以及一種選自下組的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)4(04D01)、SEQ ID 號(hào)14 (09D03)、SEQ ID 號(hào)24 (11G01)、SEQ ID號(hào)33(12A07)、SEQ ID 號(hào):40(18H02)、SEQ ID 號(hào)50(22A02)、SEQ ID 號(hào)56(24C05)、SEQID 號(hào):166(Sh24C05 Kvl-16)、以及 SEQ ID 號(hào):168(Sh24C05 Kvl-17)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)2(04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)4(04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)12 (09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)14(09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)22 (11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈 可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)24(11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)31(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)33(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)38(18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)40(18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)48(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)50(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)54(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)56(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)154(Sh24C05 Hv3_llN62S)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)166(Sh24C05Kvl-16)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)154(Sh24C05 Hv3_llN62S)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及一種包括SEQ ID號(hào)168(Sh24C05Kvl-17)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在其他實(shí)施方案中，該抗體包括(i) 一種選自下組的免疫球蛋白重鏈，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID 號(hào)109(04D01)、SEQ ID 號(hào)113 (09D03)、SEQ ID 號(hào)117 (11G01)、SEQ ID號(hào):121 (12A07)、SEQ ID 號(hào):125(18H02)、SEQ ID 號(hào):129(22A07)、SEQ ID 號(hào):133 (24C05)、SEQ ID 號(hào)190(Sh24C05 Hv3_ll N62S IgGl)、以及 SEQ ID 號(hào)192(Sh24C05 Hv3_llN62S IgG2)，以及(ii) 一種選自下組的免疫球蛋白輕鏈，該組由以下項(xiàng)組成SEQ ID號(hào)111(04D01)、SEQ ID 號(hào)115 (09D03)、SEQ ID 號(hào)119(11G01)、SEQ ID 號(hào)123 (12A07)、SEQ ID 號(hào)127(18H02)、SEQ ID 號(hào)131 (22A07)、SEQ ID 號(hào)135 (24C05)、SEQ ID號(hào):204(Sh24C05 Kvl-16 kappa)、以及 SEQ ID 號(hào):206(Sh24C05 Kvl-17 kappa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)109 (04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)111(04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)113 (09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)115(09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)117 (11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)119(11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)121 (12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)123(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)125 (18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)127(18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)129 (22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)131(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)133 (24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)135(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)190(Sh24C05 Hv3_ll N62SIgGl)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)204(Sh24C05 Kvl-16kappa)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包含SEQ ID號(hào)192(Sh24C05 Hv3_ll N62SIgG2)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包含SEQ ID號(hào)204(Sh24C05 Kvl-16kappa)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)190(Sh24C05 Hv3_ll N62SIgGl)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)206(Sh24C05 Kvl-17kappa)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括一種包括SEQ ID號(hào)192(Sh24C05 Hv3_ll N62SIgG2)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一種包括SEQ ID號(hào)206(Sh24C05 Kvl-17kappa)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。如在此使用的，除非另有指明，術(shù)語(yǔ)“抗體”意為一種完整的抗體(例如一種完整的單克隆抗體)或一種抗體的抗原結(jié)合片段(例如，一種單克隆抗體的抗原結(jié)合片段)，包括已經(jīng)過(guò)修飾、工程化或化學(xué)接合的完整抗體或抗原結(jié)合片段。已經(jīng)過(guò)修飾或工程化的抗體的實(shí)例包括嵌合抗體、人源化抗體以及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈抗體(例如，scFv)、微型抗體以及雙體抗體(diabodies)?；瘜W(xué)接合抗體的實(shí)例是一種結(jié)合至毒素部分的抗體。圖I顯示了一種包含四條多肽鏈的完整單克隆抗體的圖示。多肽鏈的其中兩條稱(chēng)作免疫球蛋白重鏈(H鏈)，并且多肽鏈的其中兩條稱(chēng)作免疫球蛋白輕鏈(L鏈)。這些免疫球蛋白重或輕鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)一種鏈間二硫鍵而被連接的。這些免疫球蛋白重鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)鏈間二硫鍵而被連接的。輕鏈由一個(gè)可變區(qū)(圖I中的八)以及一個(gè)恒定區(qū)(圖I中的CJ構(gòu)成。重鏈由一個(gè)可變區(qū)(圖I中的Vh)以及至少三個(gè)恒定區(qū)(圖I中的CHpCH2以及CH3)構(gòu)成。這些可變區(qū)決定該抗體的特異性。每一可變區(qū)包含三個(gè)高可變區(qū)，這些高可變區(qū)已知為決定區(qū)(⑶R)，兩側(cè)有四個(gè)已知為骨架區(qū)(FR)的相對(duì)保守區(qū)域。這三個(gè)⑶R (稱(chēng)作⑶％、OTR2以及OTR3)構(gòu)成抗體結(jié)合特異性。在某些實(shí)施方案中，一種結(jié)合人類(lèi)ErbB3的分離的抗體包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種與SEQ ID號(hào)2(04D01)、SEQ ID號(hào)12 (09D03)、SEQ ID 號(hào)22(11G01)、SEQ ID 號(hào)31 (12A07)、SEQ ID 號(hào)38 (18H02)、SEQ ID 號(hào)48 (22A02)、SEQ ID 號(hào)54(24C05)、以及 SEQ ID 號(hào)154 (Sh24C05Hv3_llN62S)的整個(gè)可變區(qū)或骨架區(qū)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99% —致性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，一種結(jié)合人類(lèi)ErbB3的分離的抗體包括一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種與SEQ ID號(hào)4(04D01)、SEQ ID號(hào)14 (09D03)、SEQ ID 號(hào)24 (11G01)、SEQ ID 號(hào)33 (12A07)、SEQ ID 號(hào)40 (18H02)、SEQ ID 號(hào)50 (22A02)、SEQ ID 號(hào)166(Sh24C05 Kvl-16)、以及 SEQ ID 號(hào)168 (Sh24C05Kvl_17)的整個(gè)可變區(qū)或骨架區(qū)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99% —致性的氨基酸序列。
在每一前述實(shí)施方案中，在此考慮到，一起結(jié)合人類(lèi)ErbB3的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列在該重和/或輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)中可以包含氨基酸改變(例如，至少1、2、3、4、5、或10個(gè)氨基酸置換、缺失或添加)。在一些實(shí)施方案中，一種分離的抗體以350pM、300pM、250pM、200pM、150pM、ΙΟΟρΜ、75pM、50pM、20pM、IOpM或更低的Kd結(jié)合hErbB3。除非另外說(shuō)明，否則Kd值由表面等離子體共振方法來(lái)確定。這些表面等離子體共振方法可以使用描述在例如實(shí)例3與12(其中這些測(cè)量分別是在25° C與37° C下進(jìn)行)中的條件來(lái)執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，這些抗體抑制hErbB3結(jié)合至NRGl-β I。例如，當(dāng)使用描述于實(shí)例4與13中的方案來(lái)測(cè)定時(shí)，這些抗體可以具有大約5ηΜ、2ηΜ或更低的IC5tl (最大抑制的50%時(shí)的濃度)。II.抗體的產(chǎn)牛在此披露的生產(chǎn)抗體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。例如，編碼輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)的DNA分子可以使用在此提供的序列信息進(jìn)行化學(xué)合成。合成的DNA分子可以連接至其他適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄?包括，例如恒定區(qū)編碼序列以及表達(dá)控制序列)，以產(chǎn)生編碼所希望的抗體的常規(guī)的基因表達(dá)構(gòu)建體。所定義的基因構(gòu)建體的產(chǎn)生是在本領(lǐng)域內(nèi)的慣常技術(shù)之內(nèi)?？商娲?，在此提供的序列可以使用合成核酸探針，通過(guò)常規(guī)雜交技術(shù)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來(lái)從雜種瘤中進(jìn)行克隆，這些合成核酸探針的序列是基于在此提供的序列信息，或有關(guān)編碼雜交瘤細(xì)胞中的鼠抗體的重和輕鏈的基因的現(xiàn)有技術(shù)序列信息。編碼在此披露的抗體的核酸可以合并(連接)進(jìn)入表達(dá)載體，這些表達(dá)載體可以通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化技術(shù)引入宿主細(xì)胞。示例性宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉(HeLa)細(xì)胞、幼侖鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎(COS)細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞細(xì)胞(例如，Ifep G2)以及不另外地產(chǎn)生IgG蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在準(zhǔn)許這些宿主細(xì)胞表達(dá)編碼這些免疫球蛋白輕和/或重鏈可變區(qū)的基因的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)。具體的表達(dá)與純化條件將取決于所采用的表達(dá)系統(tǒng)而變化。例如，如果一種基因有待于在大腸桿菌中表達(dá)，則首先通過(guò)將該工程化的基因定位于一種合適的細(xì)菌啟動(dòng)子(例如，Trp或Tac)以及一種原核生物信號(hào)序列的下游而將它克隆進(jìn)入一種表達(dá)載體。該表達(dá)的分泌蛋白以折射體或包涵體而積累，并且可以在利用弗氏細(xì)胞壓碎器或聲處理的破裂之后進(jìn)行收集。然后將這些折射體溶解，蛋白并且通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法將這些蛋白重折疊并且切割。如果一種編碼在此披露的抗體的DNA構(gòu)建體有待于在真核生物宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)中表達(dá)，則首先將它插入一種包含合適的真核生物啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、IgG增強(qiáng)子以及不同內(nèi)含子的表達(dá)載體之中。這該表達(dá)載體可任選地包含編碼一種恒定區(qū)的所有或部分的序列，使一種重和/或輕鏈的全部或一部分能夠得以表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，一種單表達(dá)載體包含有待表達(dá)的重和輕鏈可變區(qū)這二者。該基因構(gòu)建體可以使用常規(guī)技術(shù)引入真核生物宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞表達(dá)八或Vh片段、'-Vh異二聚體、Vh-'或單鏈多肽、完整的重或輕免疫球蛋白鏈、或其部分，它們中的每一個(gè)都可以被附接至一種具有另外的功能(例如，細(xì)胞毒性)的部分。在一些實(shí)施方案中，用表達(dá)一種多肽的單載體(single vector)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,該多肽表達(dá)一種重鏈(例如一種重鏈可變區(qū))或一種輕鏈(例如一種輕鏈可變區(qū))的全部或部分。在其他實(shí)施方案中，用編碼(a)包括一個(gè)重鏈可變區(qū)的多肽和包括一個(gè)輕鏈可變區(qū)的多肽，或(b) —個(gè)整個(gè)的免疫球蛋白重鏈和一個(gè)整個(gè)免疫球蛋白輕鏈的單載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。仍在其他實(shí)施方案 中，用多于一種的表達(dá)載體(例如，一種表達(dá)包括一種重鏈或重鏈可變區(qū)的全部或部分的一種多肽的表達(dá)載體，以及另一表達(dá)包括一種輕鏈或輕鏈可變區(qū)的全部或部分的一種多肽的表達(dá)載體)共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。產(chǎn)生包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的一種多肽或包含一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一種多肽的方法可以包括在準(zhǔn)許包含該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的該多肽或包含該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的該多肽表達(dá)的條件下，生長(zhǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。然后可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知技術(shù)(例如，親和標(biāo)簽，比如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽與組氨酸標(biāo)簽)純化包括一種重鏈可變區(qū)的多肽或包括輕鏈可變區(qū)的多肽。生產(chǎn)結(jié)合人類(lèi)ErbB3的一種單克隆抗體或該抗體的一種抗原結(jié)合片段的方法，可以包括生長(zhǎng)經(jīng)以下項(xiàng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞(a) —種編碼完整或部分免疫球蛋白重鏈的表達(dá)載體，以及一種編碼完整或部分免疫球蛋白輕鏈的分開(kāi)的表達(dá)載體；或(b) —種編碼兩種鏈(例如，完整或部分的鏈)的單一的表達(dá)載體，在允許兩種鏈表達(dá)的條件下?？梢允占撏暾贵w(或抗原結(jié)合片段)，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)已熟知技術(shù)(例如，蛋白A (Protein A)、蛋白G(Protein G)、親和標(biāo)簽比如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽與組氨酸標(biāo)簽)進(jìn)行純化。從一種單一的表達(dá)載體或從兩種分開(kāi)的表達(dá)載體表達(dá)該重鏈與該輕鏈?zhǔn)窃诒绢I(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)之內(nèi)。III.對(duì)抗體的修飾用于降低或消除抗體與抗體片段的抗原性的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。當(dāng)這些抗體是有待施藥于人類(lèi)時(shí)，這些抗體優(yōu)選地是“人源化的”以降低或消除在人類(lèi)中的抗原性。優(yōu)選地，一種人源化抗體具有與其衍生自的非人源化小鼠抗體相同的或?qū)嵸|(zhì)上相同的抗原親和力。在一個(gè)人源化方法中，產(chǎn)生嵌合蛋白，其中用人類(lèi)免疫球蛋白恒定區(qū)替代小鼠免疫球蛋白恒定區(qū)。參見(jiàn)例如Morrison (莫里森)等人，1984，《美國(guó)科學(xué)院院刊》(PR0C. NAT.ACAD. SCI. )81:6851-6855 ；Neuberger (紐伯格)等人，1984，《自然》(Nat臟)312:604-608 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，893，625 (Robinson (羅賓遜))，5，500，362 (Robinson (羅賓遜))以及 4，816，567(CabiIIy (凱比利))。在一種已知為⑶R移植的方法中，這些輕或重鏈可變區(qū)的⑶R是移植進(jìn)入來(lái)自另外物種的骨架序列之中。例如,可以移植鼠⑶R進(jìn)入人FR。在一些實(shí)施方案中，抗ErbB3抗體的輕和重鏈可變區(qū)的⑶R可以被移植到人類(lèi)FR或共有人類(lèi)FR (consensus human FRs)上。為了產(chǎn)生共有人類(lèi)FR，將從若干人類(lèi)重鏈或輕鏈氨基酸序列而來(lái)的FR進(jìn)行對(duì)齊以鑒定共有氨基酸序列。CDR移植描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，022, 500 (Queen (昆));6，982，321 (Winter(溫特));6，180，370 (Queen (昆));6，054，297 (Carter (卡特));5，693，762 (Queen (昆));5, 859, 205 (Adair (亞代爾));5，693，761 (Queen (昆));5，565，332 (Hoogenboom (胡根伯姆))；5，585，089 (Queen (昆))；5，530，101 (Queen (昆))Jones (瓊斯)等人(1986)《自然》321:522-525 ;Riechmann (利赫曼)等人(1988)《自然》332:323-327 ；Verhoeyen (沃霍恩)等人(1988)《科學(xué)》(Science) 239:1534-1536 ;以及Winter (溫特)(1998)《歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟快訊》(FEBSLett) 430:92-94。
在一種稱(chēng)作“SUPERHUMANIZATION ”的方法中，人⑶R序列是基于這些人⑶R與那些有待于人源化的小鼠抗體的結(jié)構(gòu)相似性，從人生殖細(xì)胞基因中選擇。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?，881，557 (Foote (富特));以及Tan (譚)等人，2002，《免疫學(xué)雜志》(J. IMMUNOL)169:1119-1125。降低免疫原性的其他方法包括“重塑(reshaping)”^超嵌合(hyperchimerization)” 以及“壤面 / 表面重修(veneering/resurfacing)”。參見(jiàn)例如Vaswami (瓦斯瓦米)等人，1998,《過(guò)敏、哮喘及免疫學(xué)年鑒》(ANms OF Alleegy, Asthma, (^Immun0L-)81:105 ；Roguska (羅固斯卡)等人，1996，《蛋白工程》(PR0T. Enhneek) 9:895-904 ;以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，072，035 (Hardman (哈德曼))。在該鑲面/表面重修方法中，該鼠抗體中的易接近表面的氨基酸殘基被在人類(lèi)抗體中的相同位置更常發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基替代。這種類(lèi)型的抗體表面重修描述于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，639，641 (Pedersen (佩德森))中。用于將小鼠抗體轉(zhuǎn)化成一種適合人類(lèi)醫(yī)學(xué)用途的形式的另一方法已知為ACTIVMAB 技術(shù)(Vaccinex 公司，紐約州羅徹斯特(Vaccinex, Inc. , Rochester, NY)),該技術(shù)涉及一種牛痘病毒基載體，用來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)抗體。據(jù)說(shuō)要產(chǎn)生IgG重和輕鏈的高水平的組合多樣性。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，706，477 (Zauderer (藻德?tīng)?);6，800，442(Zauderer (藻德?tīng)?)；以及 6，872，518 (Zauderer (藻德?tīng)?)。用于將小鼠抗體轉(zhuǎn)化成一種適合在人類(lèi)中使用的形式的另一方法是由KaloBios制藥公司(KaloBios Pharmaceuticals, Inc.)(加利福尼亞帕洛阿爾托)(Palo Alto, CA)商業(yè)化運(yùn)作的技術(shù)。這種技術(shù)涉及使用一種專(zhuān)利性的人類(lèi)“受體”文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生一種用于抗體選擇的“表位聚焦的表位表位”文庫(kù)。用于將小鼠抗體修飾成一種適合人類(lèi)醫(yī)學(xué)用途的形式的另一方法是由HUMANENGINEERING 技術(shù)，該技術(shù)由XOMA(US)公司(XOMA(US)LLC)商業(yè)化運(yùn)作。參見(jiàn)，例如，PCT公開(kāi)號(hào) W093/11794 以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，766,886 ;5，770，196 ;5，821，123 ;以及 5，869，619。任何適合的方法(包括任何以上的方法)可以用以降低或消除在此披露的抗體的人免疫原性。制造多特異性抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。多特異性抗體包括雙特異性抗體。雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同表位表位的結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體結(jié)合至感興趣的抗原的兩種不同表位表位。雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩個(gè)不同表位的結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體結(jié)合至感興趣的抗原的兩個(gè)不同表位。雙特異性抗體可以制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab’)2|特異性抗體與雙體)，如描述于例如Milstein (米爾斯坦)等人，《自然》305:537-539 (1983)；WO 93/08829 ;Traunecker(巢奈克爾)等人，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)，10:3655-3659(1991) ；W0 94/04690 ;Suresh (蘇雷什)等人，《酶學(xué)方法》(Methqds IN Enzymology),121:210(1986) ；W096/27011 ;Brennan (布倫南)等人，《科學(xué)》，229:81 (1985) ; Shalaby 等人，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J. Exp Med. ),175:217-225 (1992) ;Kostelny (克斯特爾尼)等人，《免疫學(xué)雜志》，148(5) :1547-1553(1992) ；Hollinger (霍林格)等人，PNAS，90:6444-6448 ;Gruber (格魯伯)等人，《免疫學(xué)雜志》，152:5368 (1994) ；ffu (吳)等人，《自然生物技術(shù)》(Nat.B皿E_L. ),25(11) :1290-1297 ;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2007/0071675 ;以及 Bostrom (博斯特羅姆)等人，《科學(xué)》323:1640-1644(2009)中的。在一些實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)的體外共軛化學(xué)劑(conjugation chemistries)將該抗體共軛至一種效應(yīng)物劑(比如一種小分子毒素或一種放射性核素)。如果該效應(yīng)物劑是 一種多肽，則該抗體可以化學(xué)共軛至該效應(yīng)物或連接至該效應(yīng)物作為一種融合蛋白。融合蛋白的構(gòu)建在本領(lǐng)域普通技術(shù)內(nèi)IV.抗體的用途在此披露的抗體可以用以治療不同形式的癌癥，例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌(非小細(xì)胞性肺癌)、胰腺癌、胃癌、皮膚癌、腎癌、以及頭頸部癌以及神經(jīng)鞘瘤癌。這些癌細(xì)胞被暴露于一個(gè)治療有效量的該抗體，以抑制或降低該癌細(xì)胞的增 殖。在一些實(shí)施方案中，這些抗體抑制癌細(xì)胞增殖至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或 100%。在一些實(shí)施方案中，該抗體通過(guò)抑制人ErbB3結(jié)合至ErbB3配體(例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 /heregulin，尤其是 NRGP l/NRGl-β I/NRG^ I/HRG^ I 以及 NRG a 1/NRG1- a I/NRGa 1/HRGa I)來(lái)抑制或降低腫瘤細(xì)胞的增殖。該抗體可以在一種抑制人類(lèi)患者中的腫瘤生長(zhǎng)的方法中使用。該方法包括將一個(gè)治療有效量的該抗體給藥于該患者。與ErbB3過(guò)表達(dá)和/或激活相關(guān)的癌癥包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、肺癌(例如，非小細(xì)胞性肺癌)、一些形式的腦癌(例如，神經(jīng)鞘瘤)、黑素瘤、皮膚癌、腎癌、以及腸胃癌(例如，結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌、頭頸部癌)。如在此所使用的，“治療”(treat、treating和treatment)意為對(duì)哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))的疾病的治療。這包括(a)抑制該疾病，即，遏制其發(fā)展；以及(b)緩解該疾病，SP，使該疾病狀態(tài)退行；以及(C)治愈該疾病。一般地,一個(gè)治療有效量的活性組分是在O. lmg/kg至100mg/kg的范圍內(nèi)，例如，lmg/kg至100mg/kg, lmg/kg至10mg/kg。給藥量將取決于各種變量，比如疾病的類(lèi)型與程度或有待治療的征候、該患者的總體健康、該抗體的體內(nèi)效能、藥物配方以及給藥途徑?？梢栽黾映跏加?jì)量超出以上的水平以快速達(dá)到所希望的血液水平或組織水平?？商娲?，該初始劑量可以比該最適宜的更低，并且可以在治療過(guò)程中漸進(jìn)地增加每日劑量。在例如設(shè)計(jì)以從0. 5mg/kg至20mg/kg進(jìn)行的常規(guī)性階段I劑量逐步提高研究中，人類(lèi)劑量可以被最優(yōu)化。取決于各種因素(比如給藥途徑、劑量以及在治療的疾病)，給藥頻率可以變化。示例性的給藥頻率是每天一次，每周一次或每?jī)芍芤淮?。?yōu)選的給藥途徑是腸胃外給藥，例如靜脈輸注?；趩慰寺】贵w的藥物的配制品在本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，該單克隆抗體被低壓凍干并且在給藥時(shí)，在緩沖鹽水中復(fù)原。 對(duì)于治療用途，抗體優(yōu)選結(jié)合一種藥學(xué)上可接受的載體。如在此所用的，“藥學(xué)上可接受的載體”意為適合用于和人類(lèi)以及動(dòng)物的組織相接觸而沒(méi)有過(guò)度的毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)或其他問(wèn)題或并發(fā)癥的緩沖液、載體以及賦形劑，與合理的獲益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)。在與該配制品的其他成分相容的意義上，這一種或多種載體應(yīng)該是“可接受的”，并且不會(huì)對(duì)它的接受者有害。藥學(xué)上可接受的載體包括與藥學(xué)給藥相容的緩沖液、溶劑、分散介質(zhì)、涂層、等滲劑和吸收延遲劑、以及類(lèi)似物。針對(duì)藥學(xué)活性物質(zhì)的此類(lèi)介質(zhì)與試劑的用途在本領(lǐng)域是已知的。包含在此披露的抗體的藥物組合物可以按劑量單位形式存在，并且可以通過(guò)任何合適的方法來(lái)制備。藥物組合物應(yīng)該配制以與其預(yù)期的給藥途徑相容。給藥途徑的實(shí)例 是靜脈(IV)、皮內(nèi)、吸入、經(jīng)皮、局部、經(jīng)粘膜以及直腸給藥。單克隆抗體的優(yōu)選給藥途徑是IV輸注。有用的配制品可以通過(guò)制藥領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法來(lái)制備。例如，參見(jiàn)《雷明頓的藥物科學(xué)第 18 版》(Remington, s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. ) (Mack 出版公司，1990) (Mack Publishing Company, 1990)。適合用于腸胃外給藥的配制品組分包括無(wú)菌稀釋液，例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如EDTA ;緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于張力調(diào)整的用劑，比如氯化鈉或右旋糖。對(duì)于靜脈給藥,合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF,新澤西州派西派尼市(Parsippany,NJ))或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。該載體應(yīng)該在制造和儲(chǔ)存的條件下是穩(wěn)定的，并且應(yīng)該抗微生物保存。該載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，它包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液體聚乙二醇)，以及它們的適合的混合物。藥物配制品優(yōu)選是無(wú)菌的。滅菌可以例如通過(guò)經(jīng)由無(wú)菌濾膜的過(guò)濾來(lái)完成。在該組合物被低壓凍干的情況下，過(guò)濾滅菌可以在低壓凍干與復(fù)原之前或之后進(jìn)行。實(shí)例以下實(shí)例僅是說(shuō)明性的，并且不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。實(shí)例I-抗hErbB3單克隆抗體的產(chǎn)生在緬因州生物技術(shù)服務(wù)公司(Maine Biotechnology Services Inc.)進(jìn)行免疫、融合以及初篩選，接著是多位點(diǎn)重復(fù)免疫(RIMMS)方案。用重組人類(lèi)ErbB3/Fc(R&D Systems公司，Cat.號(hào)348-RB)免疫三只AJ小鼠以及三只Balb/c小鼠。用切割的rhErbB3 (免疫A)亦或用與其配體重組人類(lèi)NRG1-1/HRG1-1-EGF結(jié)構(gòu)域(R&D Systems公司，Cat.號(hào)396-RB)交聯(lián)的切割的rhErbB3 (免疫B)進(jìn)行兩組免疫。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，每一免疫中，選擇具有顯示高抗ErbB3活性的血清的兩只AJ小鼠用于隨后的融合。收集來(lái)自適當(dāng)小鼠的脾臟與淋巴結(jié)。然后收集B細(xì)胞，并將其與一種骨髓瘤細(xì)胞系融合。將融合產(chǎn)物連續(xù)地稀釋到40個(gè)96孔平板上，以接近克隆性。使用ELISA，篩選了來(lái)自生成的融合的總共5280份上清液，用于結(jié)合至重組rhErbB3/Fc。還篩選了相同的上清液，用于使它們結(jié)合至在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的人類(lèi)ErbB3 (利用中尺度電化學(xué)發(fā)光測(cè)定(Mesoscaleelectrochemiluminescence assay))。如以下討論的，通過(guò)體外生物化學(xué)測(cè)定和基于細(xì)胞的測(cè)定，對(duì)鑒定為包含針對(duì)ErbB3的抗體的三百份上清液進(jìn)行進(jìn)一步的特征化。選擇一組雜交瘤，并亞克隆并且擴(kuò)增這些雜交瘤。將雜交瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)移至BioXCell (原來(lái)的Bio-Express公司)，用于抗體表達(dá)，以及通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)條件下的蛋白G樹(shù)脂上的親和色譜進(jìn)行純化?？筯ErbB3單克隆抗體04D01產(chǎn)生自上述免疫A。抗hErbB3單克隆抗體09D03、11G01、12A07、18H02, 22A02 以及 24C05 產(chǎn)生自上述免疫 B。實(shí)例2-抗hErbB3單克隆抗體的序列分析根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(羅氏應(yīng)用科學(xué)(Roche Applied Science)),使用IsoStrip 小鼠單克隆抗體同種型試劑盒，對(duì)實(shí)例I中每一單克隆抗體的輕鏈同種型與重鏈同種型進(jìn)行確定。所有的抗體都被確定為Kappa輕鏈以及IgGl或IgG2b IgG重鏈。使用5’ RACE (cDNA末端快速擴(kuò)增)對(duì)這些小鼠單克隆抗體的重鏈與輕鏈可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)提供商的說(shuō)明書(shū)(Qiagen)，使用RNeasy'h量制備試劑盒從每一單克隆雜交瘤細(xì)胞系提取總RNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用5’ RACE隨機(jī)引物，使用GeneRacer 試劑盒(Invitrogen公司)亦或SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech),產(chǎn)生包含5’末端的全長(zhǎng)第一鏈cDNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用KOD熱啟動(dòng)聚合酶(Novagen)或高級(jí)2聚合酶混合物(Clontech)，通過(guò)PCR擴(kuò)增該Kappa以及重(IgGl或IgG2b) IgG鏈的可變區(qū)。為了結(jié)合GeneRacer 試劑盒，擴(kuò)增5’ cDNA末端，使用GeneRacer 5’引物5，cgactggagcacgaggacactga 3，(SEQ ID 號(hào)136)( Invitrogen 公司)作為 5，引物。為了結(jié)合SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，擴(kuò)增5’cDNA末端，使用通用引物混合物A(UniversalPrimer Mix A)引物(Clontech)(5，CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3，(SEQ ID 號(hào)137)和 5’ CTAATACGACTCACTATAGGGC 3’ (SEQ ID 號(hào):138)的混合物)作為 5’引物。使用以上5’引物和3’IgGl恒定區(qū)特異引物(5’TATGCAAGGCTTACAACCACA 3，(SEQ ID號(hào)3’ (SEQ ID 號(hào)140))擴(kuò)增重鏈可變區(qū)。用 5’AGGACAGGGGTTGATTGTTGA 3’ (SEQ ID 號(hào)141)、5’GGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGTTGT3’(SEQ ID 號(hào)142)亦或 5’ GGAGGAACCAGTTGTATCTCCACACCCA 3，(SEQ ID 號(hào)143)擴(kuò)增IgG2b序列。用以上5’引物和3’Kappa恒定區(qū)特異引物(5’CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT3，(SEQ ID 號(hào)3，(SEQ ID 號(hào):145))擴(kuò)增 Kappa鏈可變區(qū)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離單個(gè)PCR產(chǎn)物，并且使用Oiaquickx凝膠純化試劑盒(Qiaqilick Gel Purification kit) (Qiagen)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。使用Zero BluntwTOPOw PCR 克隆試劑盒(Zero Blunt TOPO*PCR Cloning KU)，根據(jù)制造商(Invitrogen公司)的說(shuō)明書(shū),將這些PCR產(chǎn)物相繼地克隆進(jìn)入|)('R “ 4Blunt質(zhì)粒，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5-α細(xì)菌(Invitrogen公司)。由BeckmanGenomics 公司，使用 M13 正向(5，GTAAAACGACGGCCAGT 3’)(SEQ ID 號(hào)146)和 M13 反向(5’CAGGAAACAGCTATGACC 3’)(SEQ ID號(hào)147)引物，使用標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧DNA測(cè)序方法對(duì)從轉(zhuǎn)化細(xì)菌克隆中分離而來(lái)的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，以鑒定這些可變區(qū)序列的序列。使用VectorNTI軟件(Invitrogen公司)以及IMGT/V-Quest軟件對(duì)這些序列進(jìn)行分析，以鑒定并且確定可變區(qū)序列。
編碼這些鼠單克隆抗體的可變區(qū)的核酸序列與定義這些鼠單克隆抗體的可變區(qū)的蛋白序列總結(jié)于下(氨基末端信號(hào)肽序列未展示)。CDR序列(Kabat定義)以這些氨基酸序列中的粗體/下劃線(xiàn)來(lái)展示。編碼04D01抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)I)I caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg61 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agccactggt tgcactgggt gaagcagagg121 cctggacaag gccttgagtg gatcggagtg cttgatcctt ctgattttta tagtaactac181 aatcaaaact tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac
241 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc acgaggccta301 ctatccgggg actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca定義04D01杭體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)2)I qvqlqqpgae lvrpgtsvkl sckasgytft shwlhwvkqr pgqglewigv ldpsdfysny61 nqnfkgkatl tvdtssstay mqlssltsed savyycargl lsgdyamdyw gqgtsvtvss編碼04D01杭體的KaDDa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)3)I gatgttttga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc61 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag tccctgatct acaaagtttc taaccgattt181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc atatgttccg301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa定義04D01抗體的Kappa鏈可變區(qū)的蛋白序歹丨J (SEQ ID號(hào):4)I dvlmtqipls lpvslgdqas iscrssqsiv hsngntylew ylqkpgqspk sliykvsnrf61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgsyvp wtfgggtkle ik編碼09D03抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)11)I caggttactc taaaagagtc tggccctggg atattgcggc cctcccagac cctcagtctg61 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttttggtt tgagtgtagg ctggattcgt121 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac181 tataacccag cccttaagag tcggctcaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta241 ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata301 ggggcggacg cccttccttt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca定義09D03抗體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)12)I qvtlkesgpg ilrpsqtlsl tcsfsgfsls tfglsvgwir qpsgkglewl ahiwwdddky61 ynpalksrlt iskdtsknqv flkianvdta dtatyycari gadalpfdyw gqgttltvss編碼09D03抗體的Kappa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)13)I gatattgtgt tgactcagac tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc61 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg121 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc
181 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc241 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcct301 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa定義09D03抗體的Kappa fi車(chē)可變IX的蛋白序歹I」(SEQ ID號(hào)14)I divltqtaps vpvtpgesvs iscrssksll hsngntylyw flqrpgqspq lliyrmsnla61 sgvpdrfsgs gsgtaftlri srveaedvgv yycmqhleyp ftfgsgtkle ik編碼11G01抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)21) I caggttcagc tgcaacagtc tgacgctgag ttggtgaaac ctggagcttc agtgaagata61 tcctgcaagg tttctggcta caccttcact gaccatatta ttcactggat gaagcagagg121 cctgaacagg gcctggaatg gattggatat atttatccta gagatggtta tattaagtac181 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac241 atgcaggtca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aaggggttac301 tattatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a定義11G01抗體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)22)I qvqlqqsdae lvkpgasvki sckvsgytft dhiihwmkqr peqglewigy iyprdgyiky61 nekfkgkatl tadkssstay mqvnsltsed savyfcargy yyamdywgqg tsvtvss編碼11G01杭體的Kappa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)23)I gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc61 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtattg gaaacaccta tttagaatgg121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt181 tctggggtcc cagagaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca301 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa定義11G01抗體的Kappa鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)24)I dvlmtqtpls lpvslgdqas iscrssqsiv hsigntylew ylqkpgqspk lliykvsnrf61 sgvperfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgshvp ftfgsgtkle ik編碼12A07抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)30)I caggtccaac tgctgcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg61 tcctgcaaga cttctggcta caccttctcc agctactgga tgcactgggt aaagcagagg121 cctggacaag gccttgagtg gatcggaatg attgatcctt ctgatgttta tactaactac181 aatccaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca catcctccag cacagcctac241 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaactac301 tctggggact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca定義12A07抗體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)31)I qvqllqpgae lvrpgtsvkl scktsgytfs sywmhwvkqr pgqglewigm idpsdvytny61 npkfkgkatl tvdtssstay mqlssltsed savyycarny sgdywgqgtt ltvss編碼12A07抗體的Kappa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)32)I gatgttttga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc61 atctcttgta gatctagtca gagcattgtc catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg
121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc atatgttccg301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa定義12A07杭體的Kamm鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)33)I dvlmtqipls lpvslgdqas iscrssqsiv hsngntylew ylqkpgqspk lliykvsnrf61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgsyvp wtfgggtkle ik編碼18H02抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào):37) I cagatccagt tggtacagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggagaggc agtcaagatc61 tcctgcaagt cttctgggta taccttcaca acctatggaa tgagctgggt gaaacaggct121 ccaggaaggg ctttaaagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat181 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaat cctctgccag cactgcctat241 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagggagg301 gatggttacc aagtggcctg gtttgcttac tggggccaag ggacgctggt cactgtctct361 gca定義18H02抗體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)38)I qiqlvqsgpe lkkpgeavki sckssgytft tygmswvkqa pgralkwmgw intysgvpty61 addfkgrfaf slessastay lqinnlkned tatyfcargr dgyqvawfay wgqgtlvtvs121 a編碼18H02抗體的Kappa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)39)I gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga taaagtcacc61 atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggttcca gcagaagcca121 ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc181 cgattctccg gcagtggcta tggtacagat tttattttta caattgaaaa catgctctct241 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgccgtacac gttcggaggg301 gggaccaagc tggaaataaa a定義18H02抗體的Kappa鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)40)I ettvtqspas lsmaigdkvt ircitstdid ddmnwfqqkp geppkllise gntlrpgvps61 rfsgsgygtd fiftienmls edvadyyclq sdnlpytfgg gtkleik編碼22A02抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)47)I caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg61 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tgcactgggt aaagcagagg121 cctggacaag gccttgagtg gatcggaatg attgatcctt ctgatagtta tactaactac181 aatccaaagt tcaagggtaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac241 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaactac301 tctggggact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca定義22A02抗體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)48)I qvqlqqpgae lvrpgtsvkl sckasgytft nywmhwvkqr pgqglewigm idpsdsytny61 npkfkgkatl tvdtssstay mqlssltsed savyycarny sgdywgqgtt ltvss
編碼22A02杭體的KaDDa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)49)I gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc61 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg121 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt181 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc241 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattattgct ttcaaggttc atatgttccg301 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 定義22A02抗體的Kappa fi車(chē)可變IX的蛋白序歹I」(SEQ ID號(hào):50)I dvlmtqtpls lpvslgdqas iscrssqsiv hsngntylew ylqkpgqspk lliykvsnrf61 sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedlgv yycfqgsyvp wtfgggtkle ik編碼24C05杭體的重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)53)I gaggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc61 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatgcca tgtcttgggt tcgccagact121 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtactta cacctactat181 ccagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac241 ctgcaaatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagagaatgg301 ggtgattacg acggatttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcg定義24C05杭體的重鏈可變區(qū)的蛋白序列(SEQ ID號(hào)54)I evqlvesggg lvkpggslkl scaasgftfs dyamswvrqt pekrlewvat isdggtytyy61 pdnvkgrfti srdnaknnly lqmshlksed tamyycarew gdydgfdywg qgttltvss編碼24C05抗體的Kappa鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQ ID號(hào)55)I gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt61 ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca121 gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa181 aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcggcag ccttgagtct241 gaagatcttg cagactatta ctgtctacaa tatgatagtt atccgtacac gttcggaggg301 gggaccaagc tggaaataaa a定義24C05抗體的Kappa鏈可變區(qū)的蛋白序歹丨J (SEQ ID號(hào):56)I diqmtqspss lsaslgervs ltcrasqeis Rylswlqqkp dgtikrliya astldsRvpk61 rfsgsrsgsd ysltigsles edladyyclq ydsypytfRR gtkleik定義實(shí)例I中產(chǎn)生的這些抗體的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的氨基酸序列在圖2中進(jìn)行了比對(duì)。氨基末端信號(hào)肽序列(用于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)/分泌)沒(méi)有展示出。OTR1、⑶R2以及⑶R3(Kabat定義)通過(guò)方框來(lái)鑒別。圖3展示了每一抗體的分開(kāi)的OTR1、⑶R2以及OTR3序列的比對(duì)。定義實(shí)例I中的這些抗體的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列在圖4中進(jìn)行了比對(duì)。氨基末端信號(hào)肽序列(用于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)/分泌)沒(méi)有展示出。OTR1XDR2以及⑶R3通過(guò)方框來(lái)鑒別。圖5展示了每一抗體的分開(kāi)的⑶Rp OTR2以及OTR3序列的比對(duì)。表I是一個(gè)索引表，展示了在這一實(shí)例中所討論的每一序列的SEQ ID號(hào).。表I
權(quán)利要求
1.一種分離的結(jié)合人類(lèi)ErbB3的抗體，包括選自以下組的一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該組由以下項(xiàng)組成 (a)⑴一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括選自由SEQID號(hào)57(24C05)以及SEQ ID號(hào)75(24C05)組成的組的氨基酸序列的CDRH1，一種包括選自由SEQ ID號(hào)58(24C05)以及SEQ ID號(hào)148 (Sh24C05Hv3_llN62S)組成的組的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)59(24C05)的氨基酸序列的CDRH3 ; ( ) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)60(24C05)的氨基酸序列的CDRL1，一種包括SEQ ID號(hào)61 (24C05)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包含SEQ ID號(hào)62(24C05)的氨基酸序列的CDRL3以及 (b)(i)—種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)5(04D01)的氨基酸序列的CDRHl，一種包括SEQ ID號(hào)6 (04D01)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)7(04D01)的氨基酸序列的CDRH3 ;并且 ( ) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)8(04D01)的氨基酸序列的CDRLl，一種包括SEQ ID號(hào)9(04D01)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包括SEQ ID號(hào):10(04D01)的氨基酸序列的CDRL3 ； (c)(i) 一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)15(09D03)的氨基酸序列的CDRHl，一種包括SEQ ID號(hào)16(09D03)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)17(09D03)的氨基酸序列的CDRH3 ;以及 ( ) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)18(09D03)的氨基酸序列的CDRLl，一種包括SEQ ID號(hào)19(09D03)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包括SEQ ID號(hào)20(09D03)的氨基酸序列的CDRL3 ； (d)⑴一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQID號(hào)25(11G01)的氨基酸序列的CDRHl，一種包括SEQ ID號(hào)26(11G01)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào):27(1 IGO I)的氨基酸序列的CDRH3 ;以及 ( ) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)28(11G01)的氨基酸序列的CDRLl，一種包括SEQ ID號(hào)9 (11G01)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包含SEQ ID號(hào)29(11G01)的氨基酸序列的⑶RL3 ； (e)(i) 一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)34(12A07)的氨基酸序列的CDRH1，一種包括SEQ ID號(hào)35(12A07)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)36(12A07)的氨基酸序列的CDRH3 ;以及 ( ) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)8(12A07)的氨基酸序列的CDRLl，一種包括SEQ ID號(hào):9 (12A07)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包括SEQ ID號(hào):10(12A07)的氨基酸序列的CDRL3 ； (f)(i) 一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)41(18H02)的氨基酸序列的CDRHl，一種包括SEQ ID號(hào)42(18H02)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)43(18H02)的氨基酸序列的CDRH3 ;以及 (a)(i) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)44(18H02)的氨基酸序列的CDRLl，一種包括SEQ ID號(hào)45(18H02)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包括SEQ ID號(hào)46(18H02)的氨基酸序列的CDRL3 ;以及(g)(i) 一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)51(22A02)的氨基酸序列的CDRHl，一種包括SEQ ID號(hào)52(22A02)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)36(22A02)的氨基酸序列的CDRH3 ;以及 ( ) 一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括一種包括SEQ ID號(hào)8(22A02)的氨基酸序列的CDRL1，一種包括SEQ ID號(hào)9(22A02)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包括SEQ ID號(hào)10(22A02)的氨基酸序列的CDRL3。
2.如權(quán)利要求I所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括SEQID號(hào):57(24C05)的氨基酸序列的CDRH1，一種包括SEQ ID號(hào):58(24C05)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)59(24C05)的氨基酸序列的CDRH3 ;并且 該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)60(24C05)的氨基酸序列的CDRL1，一種包括SEQ ID號(hào)61(24C05)的氨基酸序列的CDRL2，以及一種包括SEQ ID號(hào)62(24C05)的氨基酸序列的⑶RL3。
3.如權(quán)利要求I所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括一種包括選自由SEQ ID號(hào)57(24C05)與SEQ ID號(hào)75 (24C05)組成的組的氨基酸序列的CDRHl，一種包括SEQ ID號(hào)148(Sh24C05Hv3-llN62S)的氨基酸序列的CDRH2，以及一種包括SEQ ID號(hào)59(24C05)的氨基酸序列的CDRH3 ;并且 其中該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括一種包括SEQ ID號(hào)60(24C05)的氨基酸序列的CDRLl，一種包括SEQ ID號(hào)61 (24C05)的氨基酸序列的CDRL2，一種包括SEQ ID號(hào)62(24C05)的氨基酸序列的⑶RL3。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中這些CDR序列是在人類(lèi)與人源化框架序列之間插入。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中該抗體是一種抗原結(jié)合片段
6.一種分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的一個(gè)核苷酸序列。
7.一種分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一個(gè)核苷酸序列。
8.—種表達(dá)載體,包括權(quán)利要求6所述的核酸。
9.一種表達(dá)載體,包括權(quán)利要求7所述的核酸。
10.如權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步地包括權(quán)利要求6所述的核酸。
11.一種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體。
12.—種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
13.—種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體。
14.如權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，進(jìn)一步地包括權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體。
15.生產(chǎn)包括一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一種多肽的一種方法，該方法包括 (a)在多種條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求11或12所述的宿主細(xì)胞，以使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽；并且 (b)純化包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽。
16.生產(chǎn)結(jié)合人類(lèi)ErbB3的一種抗體或該抗體的一個(gè)抗原結(jié)合片段的一種方法，該方法包括 (a)在多種條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求13或14所述的宿主細(xì)胞，以使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包含該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和/或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽，從而生產(chǎn)該抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段；并且 (b)純化該抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段。
17.一種分離的結(jié)合人類(lèi)ErbB3的抗體，包括選自以下組的一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該組由以下項(xiàng)組成 (a)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)54(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)56(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (b)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)154(Sh24C05Hv3-llN62S)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)168(Sh24C05Kvl-17)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (c)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)154(Sh24C05Hv3-llN62S)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)166(Sh24C05Kvl-16)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (d)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)2(04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；和 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)4(04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (e)—個(gè)包括SEQ ID號(hào)12(09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)14(09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (f)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)22(11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)24(11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (g)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)31(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)33(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)； (h)—個(gè)包括SEQ ID號(hào)38(18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；以及 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)40(18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；以及 (i)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)48(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；和 一個(gè)包括SEQ ID號(hào)50(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。
18.如權(quán)利要求17所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括SEQID號(hào)54(24C05)的氨基酸序列，并且該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID號(hào)56 (24C05)的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求17所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括SEQID號(hào)154(Sh24C05Hv3-llN62S)的氨基酸序列，并且該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID號(hào)168 (Sh24C05Kvl_17)的氨基酸序列。
20.如權(quán)利要求17所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包括SEQID號(hào)154(Sh24C05Hv3-llN62S)的氨基酸序列，并且該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID號(hào)166 (Sh24C05Kvl-16)的氛基酸序列。
21.一種分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的一個(gè)核苷酸序列。
22.—種分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一個(gè)核苷酸序列。
23.—種表達(dá)載體,包含權(quán)利要求21所述的核酸。
24.一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求22所述的核酸。
25.如權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步地包括權(quán)利要求21所述的核酸。
26.—種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求23所述的表達(dá)載體。
27.—種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體。
28.—種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體。
29.如權(quán)利要求27所述的宿主，進(jìn)一步地包括權(quán)利要求23所述的表達(dá)載體。
30.生產(chǎn)包括一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一種多肽的一種方法，該方法包括 (a)在多種條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求26或27所述的宿主細(xì)胞，以使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽；并且 (b)純化包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽。
31.生產(chǎn)結(jié)合人類(lèi)ErbB3的一種抗體或該抗體的一個(gè)抗原結(jié)合片段的一種方法，該方法包括 (a)在多種條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求28或29所述的宿主細(xì)胞，以使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和/或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一個(gè)多肽，從而生產(chǎn)該抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段；并且 (b)純化該抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段。
32.—種分離的結(jié)合人類(lèi)ErbB3的抗體，包括選自以下組的一個(gè)免疫球蛋白重鏈和一個(gè)免疫球蛋白輕鏈，該組由以下項(xiàng)組成 (a)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)133(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)135(24C05)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (b)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)190(Sh24C05Hv3-llN62S IgGl)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQ ID號(hào)206(Sh24C05Kvl-17kappa)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (c)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)190(Sh24C05Hv3-llN62S IgGl)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQ ID號(hào)204(Sh24C05Kvl-16kappa)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (d)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)109(04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)111 (04D01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (e)—個(gè)包括SEQ ID號(hào)113(09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)115(09D03)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (f)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)117(11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)119(11G01)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (g)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)121(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)123(12A07)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； (h)—個(gè)包括SEQ ID號(hào)125(18H02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)127(18H024)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈；以及 (i)一個(gè)包括SEQ ID號(hào)129(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈，和一個(gè)包括SEQID號(hào)131(22A02)的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
33.如權(quán)利要求32所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈包括SEQID號(hào)133(24C05)的氨基酸序列，并且該免疫球蛋白輕鏈包括SEQ ID號(hào)135(24C05)的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求32所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈包括SEQID號(hào)190(Sh24C05Hv3-llN62S IgGl)的氨基酸序列，并且該免疫球蛋白輕鏈包括SEQ ID號(hào)206 (Sh24C05Kvl_17kappa)的氛基酸序列。
35.如權(quán)利要求32所述的抗體，其中該免疫球蛋白重鏈包括SEQID號(hào)190(Sh24C05Hv3-llN62S IgGl)的氨基酸序列，并且該免疫球蛋白輕鏈包括SEQ ID號(hào)204 (Sh24C05Kvl_16kappa)的氛基酸序列。
36.如權(quán)利要求17-20或32-35中任一項(xiàng)所述的抗體，其中該抗體是一個(gè)抗原結(jié)合片段。
37.一種分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求32-35中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白重鏈的一個(gè)核苷酸序列。
38.一種分離的核酸，包括編碼權(quán)利要求32-35中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白輕鏈的一個(gè)核苷酸序列。
39.一種表達(dá)載體,包含權(quán)利要求37所述的核酸。
40.—種表達(dá)載體,包含權(quán)利要求38所述的核酸。
41.如權(quán)利要求40所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步地包括權(quán)利要求37所述的核酸。
42.一種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體。
43.一種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求40所述的表達(dá)載體。
44.一種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體。
45.如權(quán)利要求43所述的宿主，進(jìn)一步地包括權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體。
46.生產(chǎn)包含一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的一種多肽的一種方法，該方法包括 (a)在多種條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求42或43所述的宿主細(xì)胞，以使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽；并且 (b)純化包括該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽。
47.生產(chǎn)結(jié)合人類(lèi)ErbB3的一種抗體或該抗體的一個(gè)抗原結(jié)合片段的一種方法，該方法包括 (a)在多種條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求44或45所述的宿主細(xì)胞，以使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包含該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和/或該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽，從而生產(chǎn)該抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段；并且 (b)純化該抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段。
48.如權(quán)利要求1-5、17-20或32-36中任一項(xiàng)所述的抗體，其中該抗體具有如通過(guò)表面等離子體共振測(cè)量的200pM或更低的Kd。
49.一種抑制或降低腫瘤細(xì)胞增殖的方法，包括將該細(xì)胞暴露于有效量的權(quán)利要求1-5、17-20或32-36中任一項(xiàng)所述的抗體，以抑制或或降低該腫瘤細(xì)胞增殖。
50.一種抑制或降低哺乳動(dòng)物中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括將該哺乳動(dòng)物暴露于有效量的權(quán)利要求1-5、17-20或32-36中任一項(xiàng)所述的抗體，以抑制或或降低該腫瘤增殖。
51.一種治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包括將有效量的權(quán)利要求1-5、17-20或32-36中任一項(xiàng)所述的抗體給予需要其的哺乳動(dòng)物。
52.權(quán)利要求51所述的方法，其中該癌癥是選自下組，該組由以下項(xiàng)組成乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、皮膚癌、腎癌、以及頭頸部癌以及神經(jīng)鞘瘤癌。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該癌癥是選自下組，該組由以下項(xiàng)組成乳腺癌、肺癌以及胰腺癌。
54.權(quán)利要求51所述的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類(lèi)。
全文摘要
披露了結(jié)合并抑制表皮生長(zhǎng)因子相關(guān)成員ErbB3/HER3的激活的單克隆抗體。這些抗體可以用以治療細(xì)胞增殖性疾病和紊亂，包括某些形式的與ErbB3/HER3的激活相關(guān)的癌癥。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102884085SQ201180018228
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者S·文森, W·M·小溫斯頓, 王芳, S·威勒, K·米特澤, L·布利奧爾特, S.波特加, 陳挺, M·德普里馬, C·弗里特, S·泰勒, J-K·吳, J·約里斯 申請(qǐng)人:Aveo制藥公司