專利名稱：一種喜樹堿類藥物的新型腫瘤靶向樹狀聚合物納米載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領域，涉及一種新型腫瘤靶向樹狀聚合物納米載體的制備及其在喜樹堿類藥物靶向遞送中的應用。將喜樹堿類藥物用透明質(zhì)酸修飾的樹狀聚合物包合后，有助于喜樹堿類化合物以內(nèi)酯環(huán)閉合的活性形式給藥，與現(xiàn)有市售制劑相比，具有提高生物利用度、增強靶向性、降低毒副作用、延長藥物半衰期，且可穩(wěn)定儲存等優(yōu)點。
背景技術：
喜樹堿(Camptothecin, CPT)為一種吡咯[3，4_b]喹啉生物堿，1966年由Wall 等人首次從我國特有的植物珙桐科喜樹樹干中分離而得。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)喜樹堿對頭頸部腫瘤、膀胱癌和白血病等多種惡性腫瘤均有一定的療效。其衍生物10-羥基喜樹堿 (Hydroxycamptothecin,OPT)對多種動物腫瘤有更明顯的抑制作用，且毒性較小，但部分病人尚有尿血、尿急、尿頻等毒副作用。直至1985年，Hsiang等人發(fā)現(xiàn)喜樹堿及其衍生物是通過靶向性抑制拓樸異構(gòu)酶(Topo I)的DNA合成而發(fā)揮抗癌作用的機理，至此，更多的喜樹堿類衍生物應運而生，成為抗癌領域研究的新熱點，而又一次引起人們的關注。喜樹堿類藥物六元羥基內(nèi)酯環(huán)的完整性是保證其為拓撲異構(gòu)酶抑制劑的必需結(jié)構(gòu)，然而內(nèi)酯型為水難溶性藥物，目前臨床上采用堿化開環(huán)的方法將之制成鈉鹽水針及粉針，雖增加了其水溶性，但活性僅為內(nèi)酯形式的1/10，療效降低且半衰期短。同時，內(nèi)酯型的脂溶性也非常低，制備脂質(zhì)體或微乳等制劑也難以達到臨床所需載藥量。對于油水分配系數(shù)在-0. 3到4. 5之間的難溶性化合物，其脂質(zhì)體載藥量與包封率都很低。喜樹堿類化合物眾多中具有生物活性的化學組分都屬于上述范疇，故制備的脂質(zhì)體載藥量和藥脂比都較低，很難達到臨床用量要求，而且藥物易突釋泄晶，穩(wěn)定性差。聚酰胺-胺樹狀大分子(Polyamide-amine dendrimer, PAMAM)作為一種新型的高分支、三維樹狀結(jié)構(gòu)的大分子，與線性大分子相比，具有規(guī)整的結(jié)構(gòu)、明確的分子量及分子尺寸，并可通過調(diào)控合成過程精確控制分子形狀及功能團等，可以解決抗癌藥物傳輸中生物屏障的多種問題(1)內(nèi)部的大量空腔可包裹小分子化合物，并在一定條件下將其釋出， 使負載的藥物具有緩、控釋性能，有利于藥物在腫瘤部位作用更長的時間。同時對內(nèi)部藥物分子產(chǎn)生有明顯的保護作用，可以防止體內(nèi)環(huán)境對藥物分子的降解，能避免藥物活性喪失， 有利于藥物的貯藏和運輸，而且可以防止藥物分子的聚集，增加藥物與生物膜的接觸等。 (2)高度支化的結(jié)構(gòu)和獨特的單分散特性，使分子表面具有極高的官能團密度，其末端官能團可與許多有機物、無機物發(fā)生化學反應。通過修飾引入疏水基團或靶向配體、抗體等，可提高生物相容性、生物利用度和主動靶向性。(3)利用PAMAM的納米尺寸也可以使得藥物在空隙較大的腫瘤部位達到被動的滲透與蓄積效應(EPR)，并可通過內(nèi)吞、胞飲等方式進入細胞，因此可能增加藥物對生物膜的透過性，尤其是出現(xiàn)耐藥或有特殊屏障時。已有研究證明，PAMAM載藥系統(tǒng)可在一定程度上克服腫瘤藥物的耐藥問題。(4)與脂質(zhì)體、聚合物膠束等傳統(tǒng)的納米載體相比，還具有穩(wěn)定性高、無免疫原性、低毒性、可通過尿和糞便排出體外等特性，是一類有前途的非病毒載體。
3
但是僅僅利用納米效應進行被動靶向的定位效果并不是很理想。而且整代PAMAM 樹狀大分子表面有大量氨基基團，在生理PH條件下易質(zhì)子化而帶正電，因此不可避免具有一定細胞毒性。利用無毒、水溶性好的小分子配體對PAMAM進行修飾是降低其毒性、提高其生物相容性的有效方法之一。而且利用配體和腫瘤內(nèi)受體的相互作用，可以達到更加高效的特異性作用，以彌補單純被動靶向?qū)μ囟ńM織或特定細胞靶向能力的不足，增強給藥系統(tǒng)對腫瘤細胞的特異性。透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)在體內(nèi)廣泛存在，是一種帶負電的線性糖胺聚糖，在潤滑關節(jié)、連接結(jié)締組織中發(fā)揮重要作用，并且在維持細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活動等方面也有重要作用。CD44分子是一種廣泛分布于細胞表面的糖蛋白，在淋巴細胞、成纖維細胞、間質(zhì)和造血源性細胞以及多種惡性瘤細胞表面均能檢測到它的表達，在細胞的黏附和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，是細胞表面上HA重要受體之一。最近的研究表明， HA與其特異性受體CD44之間的相互作用可以作為HA靶向治療惡性瘤的研究基礎。國內(nèi)外已成功運用HA對藥物進行化學修飾或?qū)A搭載于脂質(zhì)體、納米粒外表面實現(xiàn)藥物良好高效的靶向低毒傳遞。本發(fā)明將透明質(zhì)酸接枝于樹狀聚合物表面，利用透明質(zhì)酸的負電中和及其與腫瘤細胞表面CD44受體的相互作用，既可以降低聚合物的毒性，提高其生物相容性，又可以減少PAMAM與細胞表面的非特異性作用，降低藥物在非腫瘤部位的滯留，從而多方面增加病灶局部的藥物濃度，減輕喜樹堿類藥物的不良反應。同時，還可增加藥物在體內(nèi)的水溶性和穩(wěn)定性，提高藥物的緩釋效果及生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一在于提供一種生物相容性好、對腫瘤細胞具有靶向性、可降低藥物毒副作用、增加抗癌療效的樹狀聚合物納米載體。本發(fā)明目的之二在于用新制備的靶向載體包載喜樹堿類藥物，以減少喜樹堿類藥物內(nèi)酯環(huán)開環(huán)，增加療效并同時利用尺寸被動、受體主動作用達到藥物的雙重腫瘤靶向。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種樹狀聚合物靶向載體，特點是該載體為納米粒子，具有以下結(jié)構(gòu)位于中心核的是樹狀聚合物聚酰胺-胺PAMAM，最外端為透明質(zhì)酸靶向基團，并通過物理包裹或靜電結(jié)合包載合適的藥物。通式為PAMAM-HA/drug，其中PAMAM為2. 0-5. 0代聚酰胺-胺樹狀聚合物，HA為不同分子量的透明質(zhì)酸，drug為喜樹堿、10-羥基喜樹堿、拓撲替康等喜樹堿類藥物一種或多種。上述納米載體的制備方法是取適量PAMAM-HA，溶于適量無水甲醇中，50°C下保溫。另取喜樹堿類藥物適量溶于鹽酸溶液中，經(jīng)恒壓滴液漏斗將藥物溶液滴加到PAMAM-HA 溶液中，滴加時間控制在30-45min，氮氣保護條件下避光室溫孵育Mh。用二次蒸餾水透析Mh，凍干得白色粉末PAMAM-HA/drug，低溫避光保存。其中藥物與樹狀聚合物載體PAMAM-HA的摩爾比為10 1-5 1，藥物溶液的濃度為l-2mol/L，樹狀聚合物載體 PAMAM-HA 溶液的濃度為 0. 5-lmg/mL。所述樹狀聚合物載體PAMAM-HA的制備包括以下步驟
A)通過丙烯酸甲酯的邁克爾加成和乙二胺的氨解反應制備整數(shù)代的PAMAM分子；B)聚酰胺胺與透明質(zhì)酸以1 4的官能團摩爾比反應，以1-乙基-(3-二甲氨基 丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC HCl)為縮合劑在二甲基亞砜溶劑中反應48h ；C)反應混合液依次用過量的pH7. 4磷酸緩沖鹽和蒸餾水透析Mh，冷凍干燥后得 白色粉末，即PAMAM-HA，低溫避光保存。上述載體可用于喜樹堿類藥物的靶向傳遞。本發(fā)明的靶向載體具有以下特點1.具有高的生物兼容性，低的免疫原性和細胞毒性；2.核心結(jié)構(gòu)大小精細可調(diào)，表面氨基和透明質(zhì)酸數(shù)目可控；3.被動靶向和主動靶向結(jié)合從而對腫瘤細胞具有高度靶向性能，進一步提高靶向 效率，實現(xiàn)癌癥的高效低毒治療；4.親水高分子表面修飾能夠延長納米復合粒子的血液循環(huán)時間，增強藥物的水溶 性而增強其在血液中的穩(wěn)定性；5.樹狀聚合物載體對包裹于內(nèi)部空腔的喜樹堿類藥物分子產(chǎn)生明顯的保護作用， 可以防止體內(nèi)環(huán)境對藥物分子的降解，能避免藥物內(nèi)酯環(huán)破裂而造成的活性喪失，有利于 藥物在貯藏和運輸過程中的穩(wěn)定性；6.與脂質(zhì)體等納米粒子相比較，樹狀聚合物配體形成的納米粒子在血液流通過程 中不會因解離釋放出藥物而造成藥物的滲漏和突釋。


圖1本發(fā)明PAMAM G4. O-HA (6900)樹狀聚合物載納米靶向載體系統(tǒng)示意圖
其中
權(quán)利要求
1.一種用于包載喜樹堿類化合物的靶向納米載體，其特征在于該載體是以聚酰胺-胺 (PAMAM)樹狀大分子為母核，與靶向性功能因子透明質(zhì)酸實現(xiàn)化學偶聯(lián)后得到，可與喜樹堿類藥物通過靜電吸附或物理包裹而實現(xiàn)載藥。
2.如權(quán)利要求1所述的納米載體，其特征在于所述的聚酰胺-胺樹狀大分子，其代數(shù)是 3-5 代。
3.如權(quán)利要求1所述的納米載體，其特征在于所述的靶向性功能因子可以是不同聚合度(n = 60-120)的小分子透明質(zhì)酸。
4.如權(quán)利要求1所述的喜樹堿類藥物，可以是喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、 7-乙基-10-羥基喜樹堿、拓撲替康或伊立替康等喜樹堿類衍生物一種或多種。
5.如權(quán)利要求1所述的靶向納米載體，其特征在于所述球形納米粒的粒徑為 50-300nm，其粒徑可通過采用不同代數(shù)的聚酰胺-胺和不同分子量的透明質(zhì)酸來進行調(diào)控。
6.如權(quán)利要求1所述的樹狀聚合物納米載體的制備方法，包括以下步驟第一步以乙二胺作為核心，氨基端用發(fā)散法反復和丙烯酸甲酯(MA)邁克爾加成，再和乙二胺(EDA)胺解，得到以氨基結(jié)尾的整數(shù)代PAMAM分子；第二步第一步得到的聚酰胺-胺與透明質(zhì)酸在1-乙基-(3- 二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)催化下反應，純化后凍干得白色粉末，即PAMAM-HA，低溫避光保存。
7.如權(quán)利要求6所述的樹狀聚合物載體的制備方法，其特征在于第一步整數(shù)代樹狀聚合物的純化，可于減壓蒸餾過程中，在防爆球中加入少量濃硫酸，借助與乙二胺的成鹽反應加速乙二胺的析出；且隨著代數(shù)的增加，丙烯酸甲酯、乙二胺的過量倍數(shù)分別從初始的2 倍、6倍呈幾何倍數(shù)增加，半代、整代的反應時間分別從最初的M小時、18小時逐漸延長，以利于后續(xù)反應的最大進行及產(chǎn)品的最大純化；第二步中PAMAM與透明質(zhì)酸的投料比按官能團摩爾比1 4折算，而EDC需過量14倍。
8.如權(quán)利要求1所述的喜樹堿類藥物載入方法是取權(quán)利要求6中得到的PAMAM-HA， 溶于適量甲醇中，并在一定溫度下保溫；另取適量藥物溶于鹽酸溶液，經(jīng)恒壓滴液漏斗緩慢滴加，氮氣保護下室溫孵育M小時；透析純化，凍干得白色粉末PAMAM-HA/drug，低溫避光保存。
9.如權(quán)利要求7所述的喜樹堿類藥物的包載方法，其特征在于藥物和納米載體的比例要通過微柱離心法包封率的測定確定，使達到最大包合。
10.如權(quán)利要求5所述制備的包載喜樹堿類藥物的樹狀聚合物納米載體可以凍干粉的方式儲存或使用，或者經(jīng)注射用水稀釋并過濾除菌以用于靜脈注射，或者以適當吸附劑吸附后摻入其它輔料進一步加工成顆粒劑、丸劑、膠囊或片劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物制劑領域，涉及一種新型靶向納米載體的制備及其在喜樹堿類藥物靶向傳遞系統(tǒng)中的應用。該系統(tǒng)可表示為PAMAM-HA/drug，其中PAMAM為不同代數(shù)的聚酰胺-胺樹狀大分子，HA為不同分子量的透明質(zhì)酸，drug為喜樹堿、10-羥基喜樹堿、拓撲替康等喜樹堿類抗癌藥物一種或多種。該類載體用于包載喜樹堿類藥物，可起到延長藥物血液循環(huán)時間，提高其生物利用度，減少藥物非腫瘤部位濃集，降低其細胞毒性的作用，同時保護喜樹堿類藥物內(nèi)酯環(huán)不被破壞，從而從多方面提高腫瘤治療效率。本發(fā)明在促進喜樹堿類藥物的安全遞送及腫瘤的有效治療中具有重要意義。
文檔編號A61K47/34GK102429870SQ201110431870
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者丑曉華, 何環(huán), 吳正紅, 張淼, 焦芳, 祁小樂, 趙可, 顧琳, 馬曉麗 申請人:中國藥科大學, 揚子江藥業(yè)集團有限公司