專利名稱：一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，尤其涉及周圍神經(jīng)、韌帶、肌腱等具有縱行形貌組織的組織工程技術(shù)，具體涉及一種仿生植物組織多孔結(jié)構(gòu)的蜂窩狀絲素蛋白多孔支架及制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程技術(shù)作為一種新興的再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，它主要是通過(guò)在可生物降解的三維多孔支架材料上種植細(xì)胞、繼而進(jìn)行體外/體內(nèi)培養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)對(duì)缺損組織或器官修復(fù)的一類技術(shù)。組織工程技術(shù)在解決目前臨床上組織或器官移植存在的供體來(lái)源不足、免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題方面給予了厚望。在組織工程技術(shù)中，三維多孔支架材料在很大程度上決定著組織工程技術(shù)的成敗，它決定著種植細(xì)胞的粘附、增殖、分化和生長(zhǎng)等行為，進(jìn)而影響細(xì)胞各種功能。為滿足組織工程技術(shù)對(duì)仿生多孔支架的需求，人們已提出多種制備三維多孔支架材料的方法，如發(fā)泡法、靜電紡絲、相分離法、冷凍干燥法、快速成型法、 脫細(xì)胞組織法等，這些方法在組織工程技術(shù)領(lǐng)域均得到了重視并取得了很大進(jìn)展。從孔結(jié)構(gòu)看，多孔支架主要包括泡沫狀、 蜂窩狀和纖維狀三種，其中蜂窩狀孔的制備在技術(shù)上更富挑戰(zhàn)性。在實(shí)際的多孔支架應(yīng)用中，一方面，大量研究表明，蜂窩狀多孔支架可促進(jìn)細(xì)胞-支架共培養(yǎng)期間支架內(nèi)外的物質(zhì)交換速度，有利于維持種植于支架內(nèi)部細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；另一方面，在利用組織工程技術(shù)修復(fù)周圍神經(jīng)、肌腱和韌帶等具有縱行形貌的缺損組織時(shí)，即它們呈現(xiàn)由大量平行基膜管構(gòu)成的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，必須采用具有與其類似結(jié)構(gòu)的多孔支架才能最大程度地實(shí)現(xiàn)組織再生修復(fù)和功能恢復(fù)。為此，申請(qǐng)人在之前申請(qǐng)的發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01010602753. 1)中，提出一種仿生植物組織蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的多孔支架制備方法，并利用該方法制備出聚(乳酸-羥基乙酸)、聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚羥基乙酸等多孔支架。它們都是人工合成的聚酯類生物高分子材料，具有良好的力學(xué)性能、生物可降解性和生物相容性等，然而這些材料自身呈疏水性，并且高分子鏈中缺乏活性基團(tuán)，難以進(jìn)行生物學(xué)修飾。為充分利用這一新技術(shù)的優(yōu)勢(shì)， 通過(guò)將其擴(kuò)大適用于生物相容性更好的天然高分子材料，將可為組織工程技術(shù)的發(fā)展做出貝獻(xiàn)。在各種天然生物高分子材料中，絲素蛋白具有優(yōu)異的生物相容性、力學(xué)性能和生物可降解性，甚至是生物活性。首先，絲素蛋白分子鏈上具有生物活性位點(diǎn)如由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的RGD序列，可促進(jìn)細(xì)胞粘附與生長(zhǎng)；其部分氨基酸序列還可與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，與細(xì)胞產(chǎn)生良性互動(dòng)[Harkin D G，George K A, Madden P W，et al. Biomaterials, 2011, 32 :2445-2358] 其次，絲素蛋白的降解速度可通過(guò)調(diào)節(jié)β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例來(lái)控制，并且絲素蛋白降解產(chǎn)物主要為多肽，對(duì)細(xì)胞和組織生長(zhǎng)無(wú)任何有害影響，這也是絲素蛋白最為顯著的特點(diǎn)。再次，絲素蛋白的強(qiáng)度、韌性和彈性模量與生物體肌腱的接近[王輝，陳雄生，周盛源，等.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(34) 6381-6384]。最后，絲素蛋白良好的氧/水滲透性[Talukdar S, Mandal M, Hutmacher DW, et al. Biomaterials, 2011, 32 :2149-2159]，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。這些優(yōu)點(diǎn)，使絲素蛋白在韌帶、肌腱、周圍神經(jīng)等組織工程技術(shù)中呈現(xiàn)出美好的應(yīng)用前景。目前，絲素蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用形式主要是膜、纖維狀多孔體和多孔泡沫等[(a)Perry H，Gopinath A, Kaplan D L, et al. Advanced Materials, 2008, 20 :3070-3072 ； (b)Liu H F, Fan H B, Wang Y, et al.Biomaterials,2008,29 :662-674]，鮮見(jiàn)有關(guān)蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)絲素蛋白支架的報(bào)道。因此，制備仿生植物組織蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多孔支架，不僅可擴(kuò)大已專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?01010602753. 1)中支架制備技術(shù)的適用材料種類范圍，即應(yīng)用于天然生物高分子材料，而且豐富了絲素蛋白的應(yīng)用形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在之前(申請(qǐng)?zhí)枮?01010602753. 1)的發(fā)明專利申請(qǐng)基礎(chǔ)之上， 通過(guò)工藝和技術(shù)上的改進(jìn)，提供一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架及制備方法，制備出綜合性能更加優(yōu)異的絲素蛋白多孔支架，制得多孔支架不僅可應(yīng)用于具有縱行形貌組織的組織工程技術(shù)，而且可廣泛應(yīng)用于體外三維細(xì)胞培養(yǎng)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的制備方法如下1)制備具有植物組織結(jié)構(gòu)的負(fù)模氯化鈉多孔體；此多孔氯化鈉負(fù)模制備為現(xiàn)有技術(shù)，詳細(xì)制備過(guò)程見(jiàn)發(fā)明專利“一種蜂窩狀聚合物基仿生多孔支架材料及制備方法”(申請(qǐng)?zhí)枮?01010602753)；2)絲素蛋白制備以蠶繭為原料，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的碳酸鈉水溶液煮沸脫膠、 無(wú)機(jī)鹽水溶液溶解、透析、冷凍干燥，得到絲素蛋白；3)將絲素蛋白制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 15%的非水相溶液，用其浸漬氯化鈉多孔體，經(jīng)室溫真空干燥后得到絲素蛋白/鹽復(fù)合物；4)將絲素蛋白/鹽復(fù)合物在促β化溶劑中處理12小時(shí)，然后置于30°C的蒸餾水中M小時(shí)，在超聲或者機(jī)械振動(dòng)輔助下脫除水溶性的氯化鈉，每4小時(shí)置換一次蒸餾水，最后在30°C下真空干燥獲得蜂窩狀絲素蛋白多孔支架。所述的無(wú)機(jī)鹽為硫氰酸鋰、溴化鋰、硝酸鈣或氯化鈣。所述的非水相溶劑為無(wú)水甲酸或六氟異丙醇。所述的促β化溶劑為甲醇、乙醇或異丙醇。按本發(fā)明的制備方法制成的蜂窩狀絲素蛋白多孔支架的孔隙率大于80 %，孔徑范圍為50 μ m 300 μ m，壓縮強(qiáng)度為lOOkPa。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果1)本發(fā)明采用蠶繭為原料制得的絲素蛋白作為支架材料，其生物相容性優(yōu)異、力學(xué)性能良好、降解速率可調(diào)且降解產(chǎn)物無(wú)毒；此外此原料易得、成本低，可批量制備；2)制得蜂窩狀絲素蛋白多孔支架具有仿生的多孔結(jié)構(gòu)，與生物體中肌腱、韌帶和周圍神經(jīng)等組織具有的平行排列的基膜管結(jié)構(gòu)十分相似，具有高度仿真特性，可用于這些組織的組織工程技術(shù)。這是除生物組織衍生法外的其他方法無(wú)法得到的，同時(shí)又避免了生物組織衍生法的免疫原性和潛在的傳染病風(fēng)險(xiǎn)；3)相互連通的蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)特有的毛細(xì)作用與絲素蛋白固有的良好的氧/水滲透性一起，將為細(xì)胞培養(yǎng)期間多孔支架內(nèi)外的物質(zhì)交換提供保障，有助于解決支架內(nèi)部細(xì)胞易壞死的問(wèn)題。4)本發(fā)明制備的絲素蛋白多孔支架孔隙率不低于80%，孔徑范圍為50μπι 300 μ m,壓縮強(qiáng)度約IOOkPa,能滿足包括組織工程技術(shù)在內(nèi)的各種體外三維細(xì)胞培養(yǎng)的需要。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1 1)制備具有植物組織結(jié)構(gòu)的負(fù)模氯化鈉多孔體，此多孔氯化鈉負(fù)模制備為現(xiàn)有技術(shù)，原始植物模板為紫藤，詳細(xì)制備過(guò)程見(jiàn)發(fā)明專利“一種蜂窩狀聚合物基仿生多孔支架材料及制備方法”(申請(qǐng)?zhí)枮?01010602753. 1)，在此不再贅述；2)絲素蛋白制備將蠶繭放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的碳酸鈉水溶液中，于90°C攪拌 30分鐘取出，用蒸餾水洗滌4次，重復(fù)這一過(guò)程3次，得到脫膠蠶絲；再將其溶解于70°C的氯化鈣水溶液中，然后在透析袋中對(duì)水透析3天，去除下層沉淀物后進(jìn)行凍干，即得到絲素蛋白；3)將絲素蛋白溶于無(wú)水甲酸中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的絲素蛋白溶液，用其浸漬氯化鈉多孔體，具體浸漬方法如下將氯化鈉多孔體在常壓下浸漬于絲素蛋白溶液中0. 5 小時(shí)后置于真空度為_(kāi)4kPa的環(huán)境中，保持1. 5小時(shí)后將真空度升高至-0. 098MPa，保持1 小時(shí)后恢復(fù)常壓，取出試樣后真空干燥獲得絲素蛋白/鹽復(fù)合物；4)將絲素蛋白/鹽復(fù)合物在乙醇中浸泡12小時(shí)，隨后在30°C蒸餾水中浸泡M小時(shí)，在機(jī)械振動(dòng)輔助下脫除水溶性的氯化鈉，每4小時(shí)置換一次蒸餾水，最后在30°C下真空干燥M小時(shí)，獲得具有蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多孔支架。實(shí)施例2 1)同實(shí)施例1的步驟；2)絲素蛋白制備將蠶繭放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的碳酸鈉水溶液中，于90°C攪拌 10分鐘取出，用蒸餾水洗滌3次，重復(fù)這一過(guò)程3次，得到脫膠蠶絲；再將其溶解于65°C的硝酸鈣水溶液中，然后在透析袋中對(duì)水透析3天，去除下層沉淀物后進(jìn)行凍干，即得到絲素蛋白；3)將絲素蛋白溶于六氟異丙醇中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的絲素蛋白溶液，用其浸漬氯化鈉多孔體，具體浸漬方法如下將氯化鈉多孔體在常壓下浸漬于絲素蛋白溶液中 0. 5小時(shí)后置于真空度為_(kāi)4kPa的環(huán)境中，保持1. 5小時(shí)后將真空度升高至_0. 098MPa，保持1小時(shí)后恢復(fù)常壓，取出試樣后真空干燥獲得絲素蛋白/鹽復(fù)合物；4)將絲素蛋白/鹽復(fù)合物在甲醇中浸泡12小時(shí)，隨后在30°C蒸餾水中浸泡M小時(shí)，在機(jī)械振動(dòng)輔助下脫除水溶性的氯化鈉，每4小時(shí)置換一次蒸餾水，最后在30°C下真空干燥獲得具有蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多孔支架。實(shí)施例3 1)同實(shí)施例1的步驟；2)絲素蛋白制備將蠶繭放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的碳酸鈉水溶液中，于90°C攪拌 30min取出，用蒸餾水洗滌4次，重復(fù)這一過(guò)程3次，得到脫膠蠶絲；再將其溶解于70°C的LiBr水溶液中，然后在透析袋中對(duì)水透析3天，去除下層沉淀物后進(jìn)行凍干，即得到絲素蛋白；3)將絲素蛋白制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的無(wú)水甲酸溶液中制成絲素蛋白溶液，用其浸漬氯化鈉多孔體，具體浸漬方法如下將氯化鈉多孔體在常壓下浸漬于絲素蛋白溶液中 0. 5小時(shí)后置于真空度為_(kāi)4kPa的環(huán)境中，保持1. 5小時(shí)后將真空度升高至_0. 098MPa，保持1小時(shí)后恢復(fù)常壓，取出試樣后經(jīng)室溫真空干燥得到絲素蛋白/鹽復(fù)合物；4)將絲素蛋白/鹽復(fù)合物在異丙醇中處理12小時(shí)，然后置于30°C的蒸餾水中M 小時(shí)，在超聲輔助下脫除水溶性的氯化鈉，每4小時(shí)置換一次蒸餾水，最后在30°C下真空干燥獲得具有蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多孔支架。實(shí)施例4 1)同實(shí)施例1的步驟；2)絲素蛋白制備將蠶繭放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的碳酸鈉水溶液中，于90°C攪拌 30分鐘取出，用蒸餾水洗滌4次，重復(fù)這一過(guò)程3次，得到脫膠蠶絲；再將其溶解于40°C的硫氰酸鋰水溶液中，然后在透析袋中對(duì)水透析3天，去除下層沉淀物后進(jìn)行凍干，即得到絲素蛋白；3)將絲素蛋白制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的無(wú)水甲酸溶液中制成絲素蛋白溶液，用其浸漬氯化鈉多孔體，具體浸漬方法如下將氯化鈉多孔體在常壓下浸漬于絲素蛋白溶液中 0. 5小時(shí)后置于真空度為_(kāi)4kPa的環(huán)境中，保持1. 5小時(shí)后將真空度升高至_0. 098MPa，保持1小時(shí)后恢復(fù)常壓，取出試樣后經(jīng)室溫真空干燥得到絲素蛋白/鹽復(fù)合物；4)將絲素蛋白/鹽復(fù)合物在乙醇中處理12小時(shí)，然后置于30°C的蒸餾水中M小時(shí)，在超聲輔助下脫除水溶性的氯化鈉，每4小時(shí)置換一次蒸餾水，最后在30°C下真空干燥獲得具有蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多孔支架。
權(quán)利要求
1.一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)制備具有植物組織結(jié)構(gòu)的負(fù)模氯化鈉多孔體；2)絲素蛋白制備以蠶繭為原料，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉水溶液煮沸脫膠、無(wú)機(jī)鹽水溶液溶解、透析、冷凍干燥，得到絲素蛋白；3)將絲素蛋白制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 15%的非水相溶液，用其浸漬氯化鈉多孔體，經(jīng)室溫真空干燥后得到絲素蛋白/鹽復(fù)合物；4)將絲素蛋白/鹽復(fù)合物在促β化溶劑中處理12小時(shí)，然后置于30°C的蒸餾水中M 小時(shí)，在超聲或者機(jī)械振動(dòng)輔助下脫除水溶性的氯化鈉，每4小時(shí)置換一次蒸餾水，最后在 30 V下真空干燥獲得蜂窩狀絲素蛋白多孔支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架的制備方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽為硫氰酸鋰、溴化鋰、硝酸鈣或氯化鈣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架的制備方法，其特征在于所述的非水相溶劑為無(wú)水甲酸或六氟異丙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架的制備方法，其特征在于所述的促β化溶劑為甲醇、乙醇或異丙醇。
5.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法制成的蜂窩狀絲素蛋白多孔支架，其特征在于 該支架的孔隙率大于80%，孔徑范圍為50 μ m 300 μ m,壓縮強(qiáng)度為lOOkPa。
全文摘要
一種蜂窩狀絲素蛋白多孔支架及制備方法，首先以蠶繭為原料，經(jīng)脫膠、溶解、透析、冷凍干燥，得到絲素蛋白；接著以植物組織結(jié)構(gòu)的負(fù)模氯化鈉多孔體為模板，浸漬絲素蛋白溶液，再經(jīng)室溫真空干燥、β化處理、脫鹽過(guò)程，獲得仿生植物組織蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多孔支架。本發(fā)明制備的蜂窩狀絲素蛋白多孔支架，孔隙率大于80％、蜂窩狀孔孔徑范圍為50μm～300μm，具有良好的生物相容性、力學(xué)性能、降解性能以及物質(zhì)滲透性等。該支架特別適用于周圍神經(jīng)、肌腱和韌帶等具有縱行結(jié)構(gòu)組織的組織工程技術(shù)，也可廣泛用于體外三維細(xì)胞培養(yǎng)。
文檔編號(hào)A61L27/56GK102430155SQ20111040726
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者喬冠軍, 楊騰飛, 金欣霞, 錢(qián)軍民 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)