專利名稱：?？麖?qiáng)心肽及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，尤其涉及一種來(lái)自?？舅氐膹?qiáng)心肽，本發(fā)明還涉及該強(qiáng)心肽的提取方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
?？置＞栈?，屬于腔腸動(dòng)物門(Coelenterata)、珊瑚蟲綱(Anthozoa)、六放珊瑚亞綱(Hexacorallia)，目前已報(bào)道的超過(guò)1000種，其中中國(guó)約占10%。?？饕ㄟ^(guò)刺細(xì)胞分泌毒液捕食魚、貝類、橈足類、甲殼類動(dòng)物以及蠕蟲，其毒液中富含各種多肽成分，是目前生物毒素研究的重要內(nèi)容，也是海洋藥物開(kāi)發(fā)的主要來(lái)源之一。?？舅匕ㄉ窠?jīng)毒素和細(xì)胞毒素，目前已經(jīng)從約40種?？蟹蛛x到超過(guò)300種毒素多肽分子，主要包括鈉離子通道毒素，鉀離子通道毒素，酸敏感質(zhì)子通道毒素，?？芗?xì)胞毒素以及酶抑制劑等，其中?？c離子通道毒素是一類分子量為3-5kDa的多肽分子，通常含有3-4對(duì)二硫鍵， 目前已鑒定的海葵鈉離子通道毒素超過(guò)50種，由于?？c離子通道毒素專一性強(qiáng)，活性特殊，是海葵毒素中最令人感興趣的研究對(duì)象，也是研究鈉離子通道結(jié)構(gòu)與功能以及鈉離子通道相關(guān)疾病的主要工具試劑和潛在的藥物。電壓門控鈉離子通道具有廣泛的生理功能，特別是在可興奮細(xì)胞中介導(dǎo)了動(dòng)作電位的發(fā)放。海葵毒素中富含各種針對(duì)電壓門控離子通道起作用的多肽分子，是篩選離子通道研究相關(guān)工具試劑以及離子通道相關(guān)疾病的藥物先導(dǎo)分子的資源寶庫(kù)。目前已鑒定的?？c離子通道毒素絕大多數(shù)的作用機(jī)制在于抑制電壓門控鈉離子通道的失活，增加鈉離子內(nèi)流，是一類興奮性毒素多肽。?？舅刂械拟c離子通道毒素以其高度特異性和較強(qiáng)的活性，有助于發(fā)現(xiàn)和鑒定新型電壓門控鈉離子通道蛋白、分析鈉離子通道蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、 研究鈉離子通道的組織特異性、治療鈉離子通道相關(guān)疾病等。目前國(guó)際上研究得最多的海葵毒素為Anthopleurin-A(Ap-A)，Ap-A能專一地和興奮組織(如神經(jīng)、心肌、骨骼肌)細(xì)胞膜上電壓依賴Na離子通道結(jié)合，其結(jié)合部位是Na 離子通道3位點(diǎn).毒素與Na離子通道結(jié)合后，能夠延長(zhǎng)Na離子通道的開(kāi)放，增加Na離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Na離子度增高，并進(jìn)一步通過(guò)Na/Ca交換機(jī)制和繼發(fā)的鈣通道開(kāi)放和刺激內(nèi)鈣釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca離子濃度增加，從而增強(qiáng)心肌的收縮.在增強(qiáng)心肌收縮的同時(shí)， 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心率、血壓沒(méi)有影響。另外，Ap-A還具有抗心律失常的作用，能夠延長(zhǎng)心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程，與3類抗心律失常藥的作用機(jī)理類似，因而Ap-A已成為最有希望開(kāi)發(fā)成強(qiáng)心肽的多肽毒素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種新的?？麖?qiáng)心肽。 本發(fā)明中將這種?？麖?qiáng)心肽命名為AX-1。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種海葵強(qiáng)心肽的提取方法。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種海葵強(qiáng)心肽的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種海葵強(qiáng)心肽，其特征在于具有如下氨基酸序列1 6 11 16 21 26 31 36 41 46GGVPC LCDSD GPSVR GNTLS GIIffL RGCPS GffHNC KAHGP TIGffC CKQ。進(jìn)一步，該氨基酸序列中包含6個(gè)半胱氨酸，形成三對(duì)二硫鍵，二硫鍵連接方式分別為I-V、II-IV和III-VI ；所述強(qiáng)心肽的分子量為5018. 2Da。進(jìn)一步，該強(qiáng)心肽空間結(jié)構(gòu)包含三段反平行β-折疊片，分別為3-5號(hào)，21- 號(hào)以及46-47號(hào)氨基酸殘基構(gòu)成的肽段；由三段反平行β-折疊片連接分子中的兩個(gè)大的環(huán)，分別為6-20號(hào)以及25-45號(hào)氨基酸殘基所在肽段。一種?？麖?qiáng)心肽的提取方法，其特征在于包括如下步驟①采用丙酮分級(jí)沉淀法對(duì)?？侄疽哼M(jìn)行初步抽提；②將初步抽提樣品以去離子水溶解，過(guò)濾后，上樣反相高效液相色譜進(jìn)行分離，首先，采用半制備型C8反相柱樣品進(jìn)行分離，收集主峰，冷凍干燥；③利用分析型C18反相柱進(jìn)行精細(xì)分離，獲得所需的強(qiáng)心肽。所述的海葵粗毒液采用反復(fù)凍融法從?？刑崛?。步驟①如下丙酮事先在-20°C條件下進(jìn)行預(yù)冷，之后在?？侄疽褐蟹謩e加入 20%,50%,80%的丙酮進(jìn)行分級(jí)沉淀，得到初步提取樣品。步驟②中半制備型C8反相柱樣品進(jìn)行分離過(guò)程如下采用XBridgeTM C8半制備型反相柱，洗脫液分別為含0. TFA的水以及含0. TFA的乙腈；采用線性梯度洗脫，30 分鐘內(nèi)乙腈濃度由5%上升到45% ；流速為2. 5ml/min收集紫外吸收值最高的主峰。步驟③如下采用反相色譜柱為218TPM C18，洗脫液分別為含0. 1 % TFA的水和乙腈；采用線性梯度洗脫，50min內(nèi)，乙腈濃度從20%上升到40%，流速為lml/min，收集紫外吸收值最高的主峰，經(jīng)冷凍干燥后備用。一種海葵強(qiáng)心肽在制備心血管疾病藥物中的應(yīng)用。一種?？麖?qiáng)心肽在制備心力衰減或心律失常疾病藥物中的應(yīng)用。?？麖?qiáng)心肽AX-I的鑒定利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)質(zhì)譜(Voyager-DETMSTR Biospectromitry workstation，美國(guó) Applied Biosystems 公司)測(cè)定毒素多肽的精確分子量。AX-I的氨基酸序列測(cè)定采用N-端Edman降解法在美國(guó)ABI公司的ftx)cise 491-A 型蛋白質(zhì)測(cè)序儀上進(jìn)行。AX-I的空間結(jié)構(gòu)利用結(jié)構(gòu)模擬軟件ESyPred3D，以來(lái)?？舅谹p-A的空間結(jié)構(gòu) (PDB編號(hào)1AHL)為模板，對(duì)其進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)模擬，獲得AX-I的主鏈空間結(jié)構(gòu)。?？麖?qiáng)心肽的AX-I的活性機(jī)制鈉電流和鈣電流記錄通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用放大器EPC9(HEKA公司Electronic!，Lambrecht, German)在電腦上進(jìn)行。計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用 Pulse+PulsefitS. 0軟件。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)AX-I對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉離子通道蛋白的失活以及對(duì)心肌細(xì)胞鈉離子電流的影響。串聯(lián)電阻控制在5ΜΩ左右，線性電容電流和漏電流用P/4程序差減。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均采用微量注射器(IM-5B，Narishige)將適當(dāng)濃度的
4毒素滴入距實(shí)驗(yàn)細(xì)胞80 100 μ m的周圍，加藥完畢，立即對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行電刺激誘導(dǎo)，觀察毒素對(duì)電流的影響。采用SigmaPlot 8. 0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)?？麖?qiáng)心肽AX-I活性機(jī)制的實(shí)驗(yàn)，證明海葵強(qiáng)心肽AX-I對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉離子通道具有抑制失活，增強(qiáng)鈉離子電流峰值的功能，是一種可用于治療心率衰竭，心律失常等心血管疾病的候選藥物。


圖1為80%丙酮沉淀后舟山黃?？侄窘?jīng)半制備型C8反相柱分離后的洗脫曲線圖。圖2為舟山黃?？侄窘?jīng)C8反相柱分離后收集的主峰經(jīng)分析型C18進(jìn)一步分離后的洗脫曲線圖。圖3為最終提取的海葵強(qiáng)心肽AX-I的分子量質(zhì)譜鑒定圖。圖4為不同濃度海葵強(qiáng)心肽AX-I對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉離子通道電流的作用機(jī)制圖。圖5為未加AX-I和加入AX-I后對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉離子通道電流I_V曲線比較圖。圖6為未加AX-I和加入AX-I后對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉離子通道電導(dǎo)曲線比較圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。?？侄镜奶崛∪〕龊？?，用去離子水沖洗干凈，置入IOOOml去離子水(含15ml 0. 5M EDTA, 300 μ L2mg/ml抑肽酶)，混勻后迅速在_80°C條件下冷凍；冷凍12小時(shí)后，取出冷凍的?？谑覝叵氯芙?，待冰凍的?？咳诨?，將?？麡悠吩俅畏胖迷?80°C的冷凍箱內(nèi)，冷凍12小時(shí)；之后取出冷凍的?？麡悠?，置于室溫下充分融化，上述步驟重復(fù)2-3次；將融化后的?？麡悠酚眉啿及鼘?duì)其進(jìn)行粗過(guò)濾，去掉海葵軀體等雜質(zhì)，取其濾液；將濾液置于高速冷凍離心機(jī)中，在4°C、20000 X g條件下，離心20min，取其上清液；重復(fù)過(guò)濾兩次后，上清液備用，即為海葵粗毒樣品，置于4°C保存?zhèn)溆谩２捎帽旨?jí)沉淀法對(duì)?？侄疽哼M(jìn)行初步的抽提。丙酮事先在-20°C條件下進(jìn)行預(yù)冷，之后在?？侄疽褐蟹謩e加入20 %，50%，80 %的丙酮進(jìn)行分級(jí)沉淀，每一步所得沉淀在4°C、15000 X g條件下，離心lOmin，所得沉淀收集后冷凍干燥，保存于_20°C冰箱中?？麖?qiáng)心肽AX-I的提取重點(diǎn)對(duì)?？侄窘?jīng)80%丙酮沉淀所得樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。沉淀樣品以去離子水溶解，經(jīng)0. 45m孔徑濾頭過(guò)濾后，上樣反相高效液相色譜進(jìn)行分離。所有分離步驟均在 Waters 600E型高效液相色譜儀上完成，檢測(cè)器為Waters M87型紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為 280nmo第一步采用XBridgeTM C8半制備型反相柱(10*250mm，美國(guó)waters公司)，洗脫液分別為含0. 1% TFA(ν/ν)的水(Α液)以及含0. 1% TFA(ν/ν)的乙腈(B液)；采用線性梯度洗脫，30分鐘內(nèi)B液濃度由5%上升到45% ；流速為2. 5ml/min收集紫外吸收值最高的主峰，經(jīng)冷凍干燥后置于冰箱中保存?zhèn)溆?，?jiàn)附圖1所示，圖中的“*”號(hào)標(biāo)注為所收集的
5主峰。第二步對(duì)上述步驟中收集紫外吸收值最高的主峰成分進(jìn)行進(jìn)一步反相高效液相色譜分離，反相色譜柱為218TPM C18(4.6X250mm, Vydac公司)，洗脫液分別為含0. 1% TFA的水(A液)和乙腈(B液)；采用線性梯度洗脫，50min內(nèi)，B液從20%上升到40%，流速為lml/min，收集紫外吸收值最高的主峰，經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行鑒定，見(jiàn)附圖2所示，圖中的 “*”號(hào)標(biāo)注為所收集的主峰。?？舅谹X-I的鑒定利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)質(zhì)譜(Voyager-DETMSTRB iospectromitry workstation，美國(guó) Applied Biosystems 公司)測(cè)定毒素多肽的精確分子量。采用線性陽(yáng)離子模式A2光源337nm;離子加速電壓為20000V?；|(zhì)為α-氰基-4-羥基-肉桂酸(α -cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, CCA)，通過(guò)以下方式制備樣品取1 μ L 樣品液加入到9 μ L CCA的50%乙腈飽和溶液(含0. 1 % TFA)，混勻后取1 μ L點(diǎn)樣，室溫干燥后進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，分子量以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。如圖3所示，質(zhì)譜結(jié)果表明，所提取的舟山黃海葵強(qiáng)心肽AX-I的精確分子量為5018. 2Da，且純度較高。AX-I的氨基酸序列測(cè)定采用N-端Edman降解法在美國(guó)ABI公司的ftx)cise 491-A 型蛋白質(zhì)測(cè)序儀上進(jìn)行。采用儀器配備的標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)序，測(cè)50個(gè)循環(huán)，在線反相高效液相色譜檢測(cè)并結(jié)合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜判斷氨基酸種類，最終準(zhǔn)確讀出所測(cè)樣品的氨基酸序列。 序列分析結(jié)果表明，AX-I由48個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其序列如下GGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGIIffLRGCPSGffHNCKAHGP TIGffCCKQ ；序列中包括六個(gè)半胱氨酸，根據(jù)質(zhì)譜分子量和理論分子量差值，判斷AX-I形成三隊(duì)二硫鍵。海葵毒素多肽的空間結(jié)構(gòu)利用結(jié)構(gòu)模擬軟件ESyPred3D，以來(lái)自黃海葵的毒素 Ap-A的空間結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)1AHL)為模板，對(duì)其進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)模擬，獲得舟山黃海葵毒素多肽的主鏈空間結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，AX-I采取了與Ap-A類似的主鏈結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)中包含三段反平行β-折疊片，分別為3-5號(hào)，21-Μ號(hào)以及46-47號(hào)氨基酸殘基構(gòu)成的肽段；由三段反平行β-折疊片連接分子中的兩個(gè)大的環(huán)(loop)，分別為6-20號(hào)以及25-45號(hào)氨基酸殘基所在肽段。其分子中四個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基的分布與Ap-A類似，由ASp8，ASplO，LyS36， His38的側(cè)鏈在空間上聚集分布，形成AX-I的活性位點(diǎn)。海葵強(qiáng)心肽AX-I的活性機(jī)制鈉電流記錄通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用放大器EPC9(HEKA公司Electronic!， Lambrecht, German)在電腦上進(jìn)行。計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8. 0軟件。玻璃電極管為100yL(VWR micropipettes,VffR Company)硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管。玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(Narishige，Japan)拋光后電極尖端直徑約為3 μ m，充灌電極液后電極電阻為1-3ΜΩ。膜片鉗實(shí)驗(yàn)要在室溫條件下進(jìn)行，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度的變動(dòng)上下不超過(guò)2°C。記錄大鼠心肌細(xì)胞鈉電流的細(xì)胞外液(單位mM) :NaCl 145，KCl 5. 5，MgCl2 1， CdCl22, glucose 10，HERES 10，用 IMNaOH 和 IMHCl 將 pH 值調(diào)至 7. 4 ；電極內(nèi)液(mM) KCl 155，MgCl2 1，Na2-ATP 3，Tris phosphocreatine 5，HERES 10，用 IM KOH 禾口 IM HCl 將 PH值調(diào)至7.4。以上細(xì)胞內(nèi)液和外液均經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾。室溫下，倒置顯微鏡下挑選合適細(xì)胞，當(dāng)鉗制微玻璃管封接上細(xì)胞形成了高阻(1-5G)后，自動(dòng)執(zhí)行C-fast電容補(bǔ)償，預(yù)鉗制于_60mV，進(jìn)一步抽吸微電極，使細(xì)胞膜破裂從而形成全細(xì)胞鉗制記錄模式(Whole-cell patchclamp) 0自動(dòng)執(zhí)行C-slow電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻(R series)補(bǔ)償，鉗制于目標(biāo)電位，形成電壓鉗，膜電流應(yīng)用IOKHz濾波，穩(wěn)定4-6min后，施加去極化脈沖，測(cè)試通道電流情況。膜片鉗放大器為 EPC-9 型(List-Electronic，German)，使用 Pulse/Pulsef it 8· 0 軟件(ΗΕΚΑ Electronics, Germany)收集和分析記錄數(shù)據(jù)。串聯(lián)電阻控制在5ΜΩ左右，線性電容電流和漏電流用P/4程序差減。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均采用微量注射器(IM-5B，Narishige)將適當(dāng)濃度的毒素滴入距實(shí)驗(yàn)細(xì)胞80 IOOym的周圍，加藥完畢，立即對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行電刺激誘導(dǎo)， 觀察毒素對(duì)電流的影響。采用SigmaPlot 8. 0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。?？舅谹X-I對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元鈉通道的作用。將細(xì)胞膜電位鉗制在_80mV，以 50ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓-10mV，每隔5s重復(fù)一次。結(jié)合圖4所示，1 μ M，10 μ MAX-I均能增大鈉通道電流，同時(shí)也能延緩鈉離子通道的失活。1 μ MAX-I能增加大鼠心肌細(xì)胞的鈉通道電流約149. 29 士 ；35. 24%，10 μ M AX-1增大鈉通道電流約340. 73 士四.79%，同時(shí)也能明顯延緩鈉通道的快速失活時(shí)間。在空白對(duì)照條件下，鈉電流在去極化5ms時(shí)幾乎完全失活，但加毒素后，去極化5ms時(shí)鈉電流并未失活，這表明海葵毒素AX-I不僅能增加大鼠心肌細(xì)胞上的鈉電流強(qiáng)度，同時(shí)能延緩鈉通道的失活。?？舅谹X-I對(duì)鈉通道動(dòng)力學(xué)影響。細(xì)胞鉗制電位_80mV，測(cè)試電壓變化范圍從-80mV +50mV，測(cè)試電壓持續(xù)時(shí)間50ms，躍遷步幅+10mV。圖5為未加毒素和加入毒素后I-V曲線變化，10 μ M毒素使鈉通道的I-V曲線往超極化方向漂移。圖6為未加毒素和加入毒素后電導(dǎo)曲線變化，10 μ M毒素使鈉通道的電導(dǎo)曲線往超極化方向漂移。在全細(xì)胞模式下，檢測(cè)AX-I對(duì)心肌細(xì)胞上鈉離子通道電流-電壓曲線影響(I-V)，以判斷毒素對(duì)鈉離子通道開(kāi)放的影響。細(xì)胞鉗制電位_80mV，測(cè)試電壓變化范圍從-80mV +50mV，測(cè)試電壓持續(xù)時(shí)間50ms，躍遷步幅+10mV。在沒(méi)有加毒素對(duì)照條件下，心肌鈉通道的起始激活電壓為_(kāi)30mV，最大峰值電流激活電壓為-10mV，逆轉(zhuǎn)電位為+25mV左右。加入IOyM毒素后，鈉通道的起始激活電壓為-40mV，最大峰值電流激活電壓為-20mV，10 μ M的毒素使鈉離子通道I-V曲線往超極化方向漂移10mV，同時(shí)也大幅度增加鈉通道I-V曲線峰值電流幅度。電導(dǎo)曲線同樣顯示，10 μ MAX-I毒素能使鈉通道的激活往超極化方向漂移。本實(shí)施例中的舟山黃?？植紡V泛，材料易得，利用本實(shí)施例提供的提取方法，可以從一公斤?？刑崛X-I大約20毫克。
權(quán)利要求
1.一種?？麖?qiáng)心肽，其特征在于具有如下氨基酸序列1 6 11 16 21 26 31 36 41 46GGVPC LCDSD GPSVR GNTLS GIIffL RGCPS GffHNC KAHGP TIGffC CKQ。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海葵強(qiáng)心肽，其特征在于該氨基酸序列中包含6個(gè)半胱氨酸，形成三對(duì)二硫鍵，二硫鍵連接方式分別為I-V、II-IV和III-VI ；所述強(qiáng)心肽的分子量為 5018.2Da0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海葵強(qiáng)心肽，其特征在于該強(qiáng)心肽空間結(jié)構(gòu)包含三段反平行 β-折疊片，分別為3-5號(hào)，21-Μ號(hào)以及46-47號(hào)氨基酸殘基構(gòu)成的肽段；由三段反平行 β -折疊片連接分子中的兩個(gè)大的環(huán)，分別為6-20號(hào)以及25-45號(hào)氨基酸殘基所在肽段。
4.權(quán)利要求1 3中任意一種海葵強(qiáng)心肽的提取方法，其特征在于包括如下步驟①采用丙酮分級(jí)沉淀法對(duì)?？侄疽哼M(jìn)行初步抽提；②將初步抽提樣品以去離子水溶解，過(guò)濾后，上樣反相高效液相色譜進(jìn)行分離，首先， 采用半制備型C8反相柱樣品進(jìn)行分離，收集主峰，冷凍干燥；③利用分析型C18反相柱進(jìn)行精細(xì)分離，獲得所需的強(qiáng)心肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于所述的?？侄疽翰捎梅磸?fù)凍融法從海葵中提取。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟①如下丙酮事先在-20°C條件下進(jìn)行預(yù)冷，之后在?？侄疽褐蟹謩e加入20 %，50 %，80 %的丙酮進(jìn)行分級(jí)沉淀，得到初步提取樣品。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟②中半制備型C8反相柱樣品進(jìn)行分離過(guò)程如下采用XBridgeTM C8半制備型反相柱，洗脫液分別為含0. 1 % TFA的水以及含0. TFA的乙腈；采用線性梯度洗脫，30分鐘內(nèi)乙腈濃度由5%上升到45% ；流速為 2. 5ml/min收集紫外吸收值最高的主峰。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟③如下采用反相色譜柱為 218TP54C18，洗脫液分別為含0. 1% TFA的水和乙腈；采用線性梯度洗脫，50min內(nèi)，乙腈濃度從20%上升到40%，流速為lml/min，收集紫外吸收值最高的主峰，經(jīng)冷凍干燥后備用。
9.權(quán)利要求1 3中任意一種海葵強(qiáng)心肽在制備心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1 3中任意一種?？麖?qiáng)心肽在制備心力衰減或心律失常疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種?？麖?qiáng)心肽，具有如下氨基酸序列GGVPC LCDSD GPSVR GNTLS GIIWL RGCPS GWHNC KAHGP TIGWC CKQ。本發(fā)明還公開(kāi)了該?？麖?qiáng)心肽的提取方法和應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)海葵強(qiáng)心肽AX-1活性機(jī)制的實(shí)驗(yàn)，證明海葵強(qiáng)心肽AX-1對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈉離子通道具有抑制失活，增強(qiáng)鈉離子電流峰值的功能，是一種可用于治療心率衰竭，心律失常等心血管疾病的候選藥物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102399280SQ201110370900
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者劉少華, 廖智, 楊林, 石戈 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院