專利名稱：豬帶絳蟲microRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種豬帶絳蟲，具體來說是一種豬帶絳蟲micoRNA 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬帶絳蟲是常見的人獸共患寄生蟲，人感染豬帶絳蟲，可引起后果嚴(yán)重的囊尾蚴病(囊蟲病)。我國北部和西部地區(qū)是較嚴(yán)重的流行區(qū)。每年造成的健康危害和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失上百億，是影響西部地區(qū)社會(huì)發(fā)展的一個(gè)公共衛(wèi)生問題。目前，可用于豬帶絳蟲的鑒別方法主要是通過成蟲的形態(tài)學(xué)。但是，由于蟲體發(fā)育的時(shí)期不同，寄生的宿主不同等因素，均對(duì)蟲體的形態(tài)有影響，所以形態(tài)學(xué)的鑒定有一定的局限性，經(jīng)常不能將其與牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲區(qū)分。MicroRNAs (microRNAs)是一類大小長約2(Γ25個(gè)核苷酸，內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在許多真核生物中都曾經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。這類RNA的功能主要是參與機(jī)體或細(xì)胞的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等過程。在寄生蟲研究領(lǐng)域，已有研究表明寄生線蟲存在獨(dú)特的microRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，它們可以通過microRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主和自身基因表達(dá)模式的精確調(diào)控，從而提高感染和自身增殖的幾率并逃避免疫監(jiān)視。通過選擇性地抑制或阻斷某一特定發(fā)育期線蟲的發(fā)育，從而減少和阻斷寄生線蟲的傳播途徑。豬帶絳蟲特異表達(dá)的microRNA有可能成為其免疫預(yù)防和化學(xué)防治的新分子靶標(biāo)，為核酸疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬帶絳蟲microRNA及其應(yīng)用，所述的這種豬帶絳蟲 microRNA及其應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中的抗蠕蟲藥物造成的寄生蟲抗藥性、以及動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境中含有藥物殘留的技術(shù)問題。本發(fā)明一種豬帶絳蟲microRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:η所示， η選自1 150的正整數(shù)；或者與SEQ ID Ν0:η中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。進(jìn)一步的，所述的互補(bǔ)序列為DNA或RNA。進(jìn)一步的，所述互補(bǔ)序列為經(jīng)過修飾的DNA或RNA。進(jìn)一步的，所述互補(bǔ)序列為經(jīng)過硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。本發(fā)明還提供了上述的任一所述的豬帶絳蟲microRNA在制備豬帶絳蟲疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抑制豬帶絳蟲生長發(fā)育的組合物，含有有效量的至少一個(gè)寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的microRNA 序列或者與SEQ ID N0:1 150中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還提供了一種基因芯片，包括一個(gè)固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: 1 150中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明所提供的豬帶絳蟲microRNA均分別克隆豬帶絳蟲的成蟲，成熟的 microRNA序列長度為18-25 nt。對(duì)其microRNA進(jìn)行深度測序，獲得豬帶絳蟲成蟲的 microRNA表達(dá)譜，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO 1-140所示的microRNA只在豬帶絳蟲成蟲中表達(dá)，而在參照基因組日本血吸蟲中不表達(dá)。因此，在豬帶絳蟲體內(nèi)過量表達(dá)SEQ ID N0 1-150分子或采用microRNA反向互補(bǔ)序列抑制SEQ ID NO :1 150的表達(dá)將影響豬帶絳蟲生理功能及器官分化相關(guān)的功能。此外，鑒于豬帶絳蟲與牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的物種相似性，本發(fā)明所提供的豬帶絳蟲microRNA及其反向互補(bǔ)序列亦可應(yīng)該用于影響牛帶絳蟲以及亞洲帶絳蟲的生理功能及分化相關(guān)的功能。因此，本發(fā)明豬帶絳蟲成蟲特異性表達(dá)的microRNA可用于制備帶絳蟲疫苗，特別是豬帶絳蟲疫苗。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是顯而易見的。本發(fā)明的豬帶絳蟲成蟲 microRNA可以選擇性的抑制或阻斷某一特定發(fā)育期蟲體的發(fā)育，從而減少或阻斷寄生蟲， 尤其是豬帶絳蟲的傳播。本發(fā)明microRNA制備成為豬帶絳蟲疫苗時(shí)，作為核酸疫苗，避免了傳統(tǒng)抗蠕蟲藥物造成的全球性分布的寄生蟲抗藥性問題，也不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品或環(huán)境種內(nèi)藥物的殘留。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
microRNA的獲得 1.總RNA抽提
1)將樣本(豬帶絳蟲成蟲孕節(jié)一片)放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg組織/ml Trizol加入Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管；
2)加入250μ L氯仿，劇烈振蕩10s，使液體充分混勻呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5min ；
3)在4°C條件下，以 12000r/min 離心 15min ；
4)將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，然后在 4°C條件下靜置10- 15min ；
5)在4°C條件下，以12000r/min離心15min，小心并盡可能去掉上清；
6)用ImL75%乙醇洗滌RNA沉淀和管壁，在4°C條件下，以12000r/min離心8min，然后小心棄去乙醇；
7)將RNA沉淀進(jìn)行干燥(不能完全干燥)處理后，用10μ L RNase - free水將RNA溶解， 直接用于反轉(zhuǎn)錄。2.總RNA純度和完整性檢測
1)純度檢測取ι μ L RNA樣品50倍稀釋，在BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀上測定OD值，OD 260/0D 280的比值大于1. 8。2)總RNA完整性取RNA樣品1 μ L，1%瓊脂糖凝膠電泳80 VX 20 min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA 5S rRNA, 18S rRNA和^S rRNA條帶，三條帶條帶完整。3. small RNA序列的獲得和篩選用15% PAGE膠回收20-30 nt的small RNA，加上5，和3，端接頭(購自Illumina公司)后實(shí)施RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自hvitrogen公司)。產(chǎn)物經(jīng)6 %TBE PAGE膠純化后進(jìn)行Solexa測序。然后屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測序質(zhì)量差的序列(例如測序信號(hào)很低等)及長度小于18 nt的序列獲得clean reads。4. microRNA 的鑒定
用 BLAST 程序(NCBI，www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast) M clean reads 與 GenBank 禾口 Rfam database (version 9.0) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA) 進(jìn)行比對(duì)分析，去除非編碼RNA序列，包括rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA，和other ncRNA ； 通過Repeatmasker (http://www. repeatmasker. org)去除轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列；然后搜索 Sanger miRBase (version 13. 0)數(shù)據(jù)庫，尋找序列相似性microRNA。將豬帶絳蟲所表達(dá)的microRNA與已報(bào)道的日本血吸蟲進(jìn)行比較，分別屏蔽掉兩兩共有相關(guān)的序列，獲得豬帶絳蟲microRNA (例舉150條)。此外，為了提高反向互補(bǔ)序列的作用和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性，上述豬帶絳蟲特異性 microRNA的反向互補(bǔ)序列可以是DNA或RNA，還可以對(duì)反向互補(bǔ)序列進(jìn)行硫代、甲氧基等修飾。實(shí)施例2
本發(fā)明一種基因芯片，包括一個(gè)固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的 microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 150中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。由于芯片的制造技術(shù)屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種豬帶絳蟲microRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:η所示，η選自 1 150的正整數(shù)；或者與SEQ ID Ν0:η中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬帶絳蟲microRNA，其特征在于所述的互補(bǔ)序列為DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬帶絳蟲microRNA，其特征在于所述互補(bǔ)序列為經(jīng)過修飾的 DNA 或 RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬帶絳蟲microRNA，其特征在于所述互補(bǔ)序列為經(jīng)過硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的豬帶絳蟲microRNA在制備豬帶絳蟲疫苗中的應(yīng)用。
6.一種抑制豬帶絳蟲生長發(fā)育的組合物，其特征在于含有有效量的至少一個(gè)寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 150中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
7.一種基因芯片，包括一個(gè)固相載體，其特征在于在所述的固相載體上固定有至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 150中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬帶絳蟲microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:n所示，n選自1－150的正整數(shù)；或者與SEQIDNO:n中的任何一條序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還提供了上述的任一所述的豬帶絳蟲microRNA在制備豬帶絳蟲疫苗中的應(yīng)用。還提供了一種抑制豬帶絳蟲生長發(fā)育的組合物。本發(fā)明還提供了一種基因芯片。本發(fā)明首次從豬帶絳蟲分離獲得一類新的microRNA，這些microRNA在豬帶絳蟲生活史中的表達(dá)具有重要意義，可用于影響豬帶絳蟲幼蟲生理功能，發(fā)育，分化相關(guān)等功能，并為制備豬帶絳蟲基因工程疫苗以及防治豬帶絳蟲病提供了新的途徑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102337265SQ20111031801
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者周曉農(nóng), 周洋, 張永年, 張玲玲, 徐民俊, 朱興全, 田利光, 艾琳, 蔡玉春, 陳家旭, 陳木新, 陳韶紅 申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所