專利名稱：紫草在制備抑制甲型h1n1流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，具有流行面廣，傳染性高，發(fā)病率高等特點(diǎn)。流感可通過呼吸道、消化道、眼結(jié)膜等多種途徑傳播。迄今為止，爆發(fā)過5次流感的大流行和若干流感小流行。嚴(yán)重危害人類的健康和生命。1918年爆發(fā)的西班牙流感造成全球30%人感染，而將近2000萬人死于這次大流感。最近全球爆發(fā)的甲型Hmi流感即是人、禽、豬三種不同來源流感病毒的雜合體，其特點(diǎn)是突然出現(xiàn)，傳播迅速。雖然其致死率不高，但未來發(fā)展變化難以預(yù)料。09年6月11日，世界衛(wèi)生組織正式宣布把甲型Hmi 流感警戒級(jí)別升至6級(jí)，世衛(wèi)組織認(rèn)為疫情已經(jīng)發(fā)展為全球性“流感大流行”。紫草，為紫草科紫草屬植物，又名山紫草，紫丹，紫草根。紫草的藥理作用如下1、抗病原微生物作用紫草煎劑、紫草素、β - 二甲基丙烯酰紫草素對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌等具有抑制作用。紫草素對(duì)大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌作用。2、抗炎作用紫草的乙醚、水、乙醇提取物均有一定的抗炎作用。3、對(duì)心血管系統(tǒng)的作用紫草煎劑對(duì)心臟的作用為小量興奮，大量則抑制，最后停止于舒張期。4、避孕作用國(guó)外所產(chǎn)路邊紫草Lithospermum ruderale 50%的醇浸出液，能降低小白鼠的生育率，使正常小白鼠的動(dòng)情間期延長(zhǎng)，對(duì)未成熟的雄性或雌性小鼠，可引起性器官、胸腺、垂體重量減輕，生長(zhǎng)發(fā)育延緩，。5、抗腫瘤作用有報(bào)道指出，紫草素對(duì)肝癌和Lewis肺癌有一定的放射增敏作用.紫草素加放射可能增強(qiáng)Lewis肺癌小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)瘤細(xì)胞的直接殺傷力.帶瘤小鼠生存期的延長(zhǎng)間接增加了放療效果。據(jù)報(bào)道，紫草根對(duì)絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎有一定的療效.用美藍(lán)試管法初篩，紫草根對(duì)急性淋巴細(xì)胞性白血病有極輕度的抑制作用.紫草可減少(鼠)自發(fā)性乳癌的發(fā)病率。迄今為止，尚未有關(guān)于紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)施的紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。所述紫草為生藥材或紫草提取物中的一種。所述的紫草提取物的制備方法為將紫草用蒸餾水浸泡過夜后，過濾，得第一次浸泡過濾后所得液體和過濾后的紫草，將過濾后的紫草再加入蒸餾水浸泡過夜后，以文火加熱煮中藥3-5小時(shí)，過濾，得熬煮過濾后的液體，將第一次浸泡過濾后所得液體和熬煮過濾后所得液體混合，得到混合溶液，凍干混合溶液后得到紫草粉末，所述將苦楝皮用蒸餾水浸泡過夜后和將過濾后的苦楝皮再加入蒸餾水浸泡過夜后的步驟中的蒸餾水替換為甲醇或乙醇中的一種。將所述凍干后的紫草粉末溶解用蒸餾水溶解至濃度為10mg/mL，得紫草溶液。將神經(jīng)氨酸酶溶解在MES緩沖液(PH 6. 5)和CaCl2中，得神經(jīng)氨酸酶溶液，取神經(jīng)氨酸酶溶液和紫草溶液在37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入MUNANA的緩沖溶液，立即用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm，測(cè)定時(shí)間為8min。對(duì)0. 001-0. IU的神經(jīng)氨酸酶，對(duì)其具有抑制作用的紫草溶液濃度為 31. 25-250ug/mLo本發(fā)明的原理本發(fā)明的效果主要是通過對(duì)神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，ΝΑ)的抑制能力來驗(yàn)證的。NA是甲型Hmi流感病毒最重要的蛋白之一，在病毒從感染細(xì)胞中的釋放的過程中，特別是病毒復(fù)制周期后期，NA起主要作用。由于它具有酶功能，能水解細(xì)胞膜上各種糖蛋白受體末端的唾液酸，因此，NA能夠清除病毒顆粒表面糖蛋白末端的唾液酸，防止病毒的自我聚積，促使子代病毒釋放。另外，NA是一個(gè)重要的抗原，并且是病毒穿透呼吸道上皮黏液所必需的。NA—旦發(fā)生突變，可導(dǎo)致甲型Hmi流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑產(chǎn)生抗性作用。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明為紫草發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。2、本發(fā)明以紫草生藥材、紫草提取物抑制甲型Hmi病毒，效果顯著，紫草對(duì)神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為 IC5tl ( μ g/mL) = 184. 3 士 13. 1 和 IC5tl ( μ g/mL)= 0. 76士0. 27，本發(fā)明提供了紫草在作為抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中活性成分的應(yīng)用， 為今后開發(fā)出一種新的抑制甲型Hmi流感病毒的藥物奠定基礎(chǔ)。


圖1為細(xì)胞相對(duì)活力與紫草溶液濃度的關(guān)系；圖2為紫草溶液濃度與病毒產(chǎn)量的MTT檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)例形式的具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1稱取IOg粉碎的紫草，IOOml蒸餾水浸泡過夜，過濾，得第一次浸泡過濾后所得液體和過濾后的紫草，在過濾后的紫草中再加入IOOml蒸餾水，浸泡過夜后，以文火加熱煮中藥4小時(shí)，過濾，得熬煮過濾后的液體，將第一次浸泡過濾后所得液體和熬煮過濾后所得液體混合，得到混合溶液，凍干混合溶液后得到紫草粉末。將紫草粉末用蒸餾水溶解至濃度為 10mg/mL，得紫草溶液。實(shí)施例2將神經(jīng)氨酸酶(A/California/7/2009(HlNl) NYMC X-179A c 流感病毒株，經(jīng)雞胚傳代，收尿囊液，_70°C保存?zhèn)溆?溶解在32. 5mmol/L的MES緩沖液(PH 6. 5)和4mmol/L CaCl2中，得神經(jīng)氨酸酶溶液，取49 μ L神經(jīng)氨酸酶溶液和1 μ 1紫草溶液在37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入終濃度為20 μ mol/L的MUNANA的緩沖溶液50 μ 1，立即用Bio-RedFLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm，測(cè)定時(shí)間為8min。檢測(cè)結(jié)果為，紫草對(duì)神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為IC50(yg/mL) = 184. 3 士 13. 1。實(shí)施例3將神經(jīng)氨酸酶(Clostridiumperfringens (C. welchii)，擬876，購(gòu)于 Sigma)溶解在32. 5mmol/L的MES緩沖液(PH 6. 5)和4mmol/L CaCl2中，得神經(jīng)氨酸酶溶液，取49 μ 1神經(jīng)氨酸酶溶液和1 μ 1紫草溶液在37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入終濃度為20 μ mol/ L的MUNANA的緩沖溶液50 μ 1，立即用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng) 360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm，測(cè)定時(shí)間為8min。抑制程度的強(qiáng)弱可以從加或不加紫草的初始反應(yīng)速率來決定檢測(cè)結(jié)果為，紫草對(duì)神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為IC5(l(yg/mL)= 0. 76 士 0. 27。實(shí)施例4結(jié)合圖1圖2說明本實(shí)施例。為了檢測(cè)紫草在細(xì)胞水平的抗流感作用，我們將由實(shí)施例1得到的紫草溶液按梯度稀釋成不同的濃度，分別為31. 25ug/ML、62. 5ug/ML、125ug/ML和250ug/ML，將上述紫草溶液分別與100TCID50的病毒等體積孵育2小時(shí)，總體積為200 μ L，并且稀釋液都用維持液(即無血清，含10ug/ml胰酶的DMEM)，然后將上述一系列紫草溶液與100TCID50的病毒的混合物接種到已經(jīng)長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)板上，2小時(shí)后，換不含F(xiàn)BS的維持液，24小時(shí)后換含2% FBS的維持液，連續(xù)觀察2-3天，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞病變效果。同時(shí)設(shè)只加維持液、只加同稀釋度的病毒液或者只加不同濃度藥物稀釋液作為對(duì)照組，于371、5%0)2培養(yǎng)，對(duì)中藥紫草進(jìn)行抗病毒活性研究。結(jié)果如圖1所示，在沒有加入Hmi病毒時(shí)，細(xì)胞活力隨著紫草濃度的增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，說明紫草提取物具有細(xì)胞毒性；在同時(shí)加入紫草提取物和Hmi病毒時(shí)，隨著紫草提取物濃度的增加，細(xì)胞活力也隨著增加。說明紫草可以抑制流感病毒，保護(hù)MDCK細(xì)胞免受病毒破壞，而且保護(hù)效應(yīng)隨著紫草提取物濃度的增加而增加即呈現(xiàn)濃度依賴性。圖2為紫草溶液濃度與病毒產(chǎn)量的MTT檢測(cè)圖，由圖可見，隨藥物濃度的提高，病毒產(chǎn)量逐漸下降，這同時(shí)輔證了紫草有較好抗流感病毒作用。
權(quán)利要求
1.紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述紫草為生藥材或紫草提取物中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草提取物的制備方法為將紫草用蒸餾水浸泡過夜后，過濾，得第一次浸泡過濾后所得液體和過濾后的紫草，將過濾后的紫草再加入蒸餾水浸泡過夜后，以文火加熱煮中藥3-5小時(shí)，過濾，得熬煮過濾后的液體，將第一次浸泡過濾后所得液體和熬煮過濾后所得液體混合，得到混合溶液，凍干混合溶液后得到紫草粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紫草在制備抑制甲型Hmi流感病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述紫草提取物的制備方法中，所述將紫草用蒸餾水浸泡過夜后和將過濾后的紫草再加入蒸餾水浸泡過夜后的步驟中的蒸餾水替換為甲醇或乙醇中的一種。
全文摘要
紫草在制備抑制甲型H1N1流感病毒藥物中的應(yīng)用，屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)施的首先制備紫草溶液，取神經(jīng)氨酸酶溶液和紫草溶液在37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入MUNANA的緩沖溶液，用Bio-Red FLx-800熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明為紫草發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域；本發(fā)明以紫草生藥材、紫草提取物抑制甲型H1N1病毒，效果顯著，為今后開發(fā)出一種新的抑制甲型H1N1流感病毒的藥物奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K36/30GK102293807SQ20111025308
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者徐經(jīng)緯, 房學(xué)迅, 楊衛(wèi), 楊艷琴, 王晨旭, 田莉, 肖延蒙 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所