專利名稱：一種克氏原螯蝦c-型凝集素基因及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因，同時還涉及一種克氏原螯蝦C-型凝集素基的制備方法，還涉及一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Clec)及其編碼的C-型凝集素多肽的用途。該C-型凝集素多肽制備方法具體涉及將C-型凝集素基因克隆入一種原核表達(dá)載體pET8a及轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)宿主 BL21 (DE3)，通過誘導(dǎo)表達(dá)純化獲得具有凝集功能的重組C-型凝集素多肽。本發(fā)明還涉及該重組C-型凝集素多肽對多種細(xì)菌及兔紅細(xì)胞表現(xiàn)出凝集作用。
背景技術(shù)：
無脊椎動物缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，完全依賴于先天免疫系統(tǒng)抵抗入侵病原體， 包括一系列的細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)[Loker ES, Adema CM, et al. Invertebrate immune systems—nothomogeneous, not simple, not well understood. Immunol Rev 2004 ； 198 10-24.]。作為無脊椎動物抵抗病原體入侵的一線防御屏障，先天免疫系統(tǒng)由模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)組成。在先天免疫系統(tǒng)中，PRRs介導(dǎo)識別“非己”物質(zhì)，與入侵病原體表面的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)結(jié)合，啟動一系列免疫反應(yīng)，激活宿主防御系統(tǒng)[Lou Τ, Yang HJ, et al. Purification, characterization and cDNA cloning of anovel lipopolysaccharide-binding lectin from the shrimp Penaeus monodon. Developmental andComparative Immunology, 2006 ；30 :607-617. ]。PRRs 包括凝集素 (lectin)、脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide (LPS) -binding proteins)、抗脂多糖因子(anti-LPS factors, ALF)、肽聚糖結(jié)合蛋白(peptidoglycan-binding proteins)禾口 β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白(3-l，3-glucan-binding proteins)等等。其中，凝集素是PRRs的典型代表，為無催化活性、能與細(xì)胞表面不同糖類分子特異結(jié)☆的蛋白或H蛋白[Marques MRF, Barracco MA. Lectins, as non-self-recognition factors, incrustaceans. Aquaculture, 2000，191 ；23-44.]，普遍存在于各種生物中，在無脊椎動物免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，具體表現(xiàn)在識別“非己”物質(zhì)與清除入侵物質(zhì)[Dodd RB, Drickamer K. Lectin-Iike proteins in model organisms amplications for evolution of carbohydrate-bindingactivity. Glycobiology,2001 ；11 :71R-9R ；Vasta GRiAhmed H， etc.Structural and functionaldiversity of lectin repertoires in invertebrates, protochordates and ectothermic vertebrates.CurrOpin Struct Biol，2004 ； 14 617-30.]。許多凝集素已被鑒定、報道，它們來自各種生物，包括昆蟲、軟體動物、棘皮動物、 放線菌等等。根據(jù)凝集素結(jié)構(gòu)與功能，可分為鈣聯(lián)結(jié)蛋白、C-、L-、P-、I-、R-和S-型凝集素這幾禾中[Janeway Jr CA, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol，2002，20 :197-216]。C-型凝集素(C-type lectins, CTLs)，即鈣依賴型凝集素 (calcium-dependent 1 ectins)，是被深入研究的主要凝集素之一，均具有相同的結(jié)構(gòu)特點，如糖類識別域(carbohydrate recognition domain, CRD)、二硫鍵位置和鈣結(jié)合位點 [Weis WL, Taylor ME，Drickamer K. The C-type lectin superfamily in the immune system. Immunol Rev，1998，163 :19-34.]，為無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅介導(dǎo)識別病原體，而且參與多種生物反應(yīng)，包括結(jié)節(jié)形成[Koizumi N，Imamura M，etc. The 1 ipopolysaccharide-bindingprotein participating in hemocyte nodule formation in the silkworm Bombyx mori is a novelmember of the C-type lectin superfamily with two different tandem carbohydrate-recognitiondomains. FEBS Lett 1999 ；443 139-143.]、膠囊化、黑化[Yu XQ，Gan H，Kanost MR. Immulectin，an inducible C-type lectin from an insect， Manduca sexta， stimulates activation of ρ1asmapropheno1 oxidase. Insect Biochem Mol Biol 1999 ;29 :585-97]、促進(jìn)吞噬[Jomori T，Natori S.Function of the lipopolysaccharide-binding protein of Periplaneta americana as an opsonin. FEBSLett. 1992 ;296 :283-286]、激活酚氧化酶原系統(tǒng)(prophenoloxidase system)[Yu XQ, Gan H，Kanost MR. Immulectin, an inducible C-type lectin from an insect，Manduca sexta, stimulatesactivation of plasma prophenol oxidase. Insect Biochem Mol Biol 1999 ;29 :585-97.]、細(xì)胞粘附與聚集[Olafsen JA，F(xiàn)letcher TC, etc. Agglutinin activity in Pacific oyster(Crassostrea gigas)hemolymph following in vivo Vibrio anguillarum challenge. Dev Comp Immunol，1992，16 :123-138 Odintsova NA，Belogortseva Ni，etc. Effect of lectin from the ascidian on the growthand the adhesion of Hela cells. Mol Cell Biochem，2001，221 :133-138]。此外，還有利于各種免疫反應(yīng)，包括清除細(xì)菌[Wang XW, Zhang XW, etc. A novel C-type lectin (FcLec4) facilitates theclearance of Vibrio anguillarum in vivo in Chinese white shrimp. Dev Comp Immunol2009 ;33 :1039-1047]、抗菌活性 Sun YD，F(xiàn)u LD, etc. A hepatopancreas specific C-type lectinfrom the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis exhibits antimicrobial activity. Mol Immunol2008 ；45 :348-361. ] Λ[Zhao ZY, Yin
ZX, etc. A novel C-type lectin from the shrimpLitopenaeus vannamei possesses anti-white spot syndrome virus activity. J Virol. 2009 ；83(1) :347-56.]與抗真菌 [Willment JA, Brown GD. C-type lectin receptors in antifungal immunity. Trends Microbiol 2008;16:27-32.] ο已從十足類甲殼綱動物中分離得到許多凝集素，它們均與疾病反應(yīng)相關(guān)[Pereyra A, Zenteno R, etc. Characterization of lectin aggregates in thehemolymph of freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Biochim. Biophys. Acta 2004,67:122-130.]。尤其在對蝦中，多種CTLs已被成功克隆并開展了廣泛、深入的功能研究，結(jié)果表明它們能與N-乙酰葡萄糖胺、脂多糖特異結(jié)合，凝集紅細(xì)胞，呈現(xiàn)出多種多樣的生物活性。雖然CTLs在先天免疫系統(tǒng)中扮演著抵御病原體入侵的角色，但來自不同對蝦的CTLs在結(jié)構(gòu)、組織特異性表達(dá)、生物活性各方面卻千差萬別，如分離自斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)的PmLT、PmAV及脂多糖結(jié)合凝集素，PmLT與PmAV只有一個CRD， 脂多糖結(jié)合凝集素特異表達(dá)于肝胰腺中[Ma TH, Benzie JA, etc. PmLT, a C-type lectin specific to hepatopancreas isinvolved in the innate defense of the shrimp Penaeus Monodon. J Invertebr Pathol,2008,99 :332-341 ；Luo Τ, Zhang X, Shao Ζ, et al. PmAV,a novel gene involved in virus resistanceof shrimp Penaeus monodon. FEBSLett.，2003，551 :53-57]。在日本對蝦(Penaeus japonicus)中，分離出N-乙酰糖胺特異凝集素(N-acetyglucosamin (GlcNAc) -specific lectin)、PjLec兩禾中[Kondo MiMatsuyama H，Yano Τ. The opsonic effect of lectin on phagocytosis by hemocytes ofKuruma Prawn, Penaeus japonicus. Fish Pathol，1992，27 :217-222 ；Yang HJ, Luo T，Li F，et al.Purification and characterization of a calcium-independent lectin (PjLec) from the haemolymph ofthe shrimp Penaeus japonicus. Fish Shellfish Immunol., 2007，22:88-97·]。凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)中分離出 LvCTL、LvLec、LvCTLl 三種，LvCTL只存在肝胰腺中，具有2個CRD，LvLec是血清中的一種天然凝集素，LvCTLl 在抗病毒對蝦中呈大量表達(dá)，能凝集細(xì)菌，結(jié)合白斑綜合癥病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP95、 VP28、VP^等，提高對蝦血細(xì)胞及對蝦抗WSSV能力[Ma THT, Tiu SHK, et al. Molecular cloning of a C-type lectin(LvCTL)from the shrimp Litopenaeus vannamei early gene down—regulation after WSSVinfection. Fish Shellfish Immunol. 2007 ；23 430-437. ；Sun J,Wan L,et al. Purification andcharacterization of a natural lectin from the serum of the shrimp Litopenaeus vannamei. FishShellfish Immunol., 2007,23(2) :292-299 ；Zhao Ti, Yin ZX, et al. A novel C-type lectin from theshrimp Litopenaeus vannamei possesses anti-white spot syndrome virus activity. J Virol, 2009,83(1) :347-6-356.]。中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)含豐富的 CTLs， 現(xiàn)已分離鑒定出 6 種，依次是 Fclectin(FcCLec-I)、Fc-hsL(FcCLec-2)、FC-L、FcLec-3、 FcLec-4、FcLec-5，F(xiàn)cCLec-I 具有雙 CRD，在血淋巴細(xì)胞中表達(dá)[Liu YC, Li FH，Dong B， et al. Molecular cloning, characterization and expression analysis of a putative C-type lectin (Fclectin) gene in Chineseshrimp Fenneropenaeus chinensis. Mol. Immunol.，2007，44 :598-607. ] ；FcCLec-2 只含一個 CRD，在肝胰腺中表達(dá)[Sun YD，F(xiàn)u LD, Jia YP, et al. A hepatopancreas—specific C-type lectin fromthe Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis exhibits antimicrobial activity Mol. Immunol.，2008， 45 :348-361. ] ；FC_L，一種對蝦血漿天然凝集素，能與對蝦致病性G—菌結(jié)合[Sun J，Wang L，Wang B，et al. Purification and characterization of a natural lectin from the plasma of theshrimp Fenneropenaeus chinensis. Fish Shellfish Immunol，2008， 25(3) :290-297] ；Fclec-3含有N端信號肽和一個CRD，能與WSSV病毒的囊膜蛋白VP^相互作用[Wang XW, Xu WT, et al. A C-type lectin is involved in the innate immune response of Chinese white shrimp. Fish ShellfishImmunol 2009 ；27 (4) :556-562.]； Fclec-4能與鰻弧菌(Vibrio anguillarum)緊密結(jié)合，易化體內(nèi)細(xì)菌清除[Wang XW, Zhang XW, XuWT, Zhao XF, Wang JX. A novel C-type lectin(FcLec4)facilitates the clearance of Vibrio anguillarum in vivo in Chinese white shrimp. Dev CompImmunol 2009 ；33 (9) :1039e47] ；Fclec_5是最近報道的一種CTLs，含信號肽與2個CRD，能直接與細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖、脂多糖與脂磷壁酸結(jié)合，在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用[Xu WT, Wang Xff, Zhang Xff, et al. A new C-type lectin (FcLec5) from the Chinese white shrimpFenneropenaeus chinensis. Amino Acids, 2010, 39 (5) :1227-1239.]。在日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)中，用WSSV囊膜蛋白篩選噬菌體呈現(xiàn)文庫(phage display library)，發(fā)現(xiàn)MjLecA、MjLecB, MjLecC三種凝集素可與WSSV相互作用，阻斷WSSV對日本囊對蝦血細(xì)胞的結(jié)合作用，具有廣泛、獨特的糖類結(jié)合譜，能凝集多種G —與G+菌[Song KK, Li DF, Zhang MC, et al. Cloning and characterization of three novel WSSV recognizing lectins from shrimpMarsupenaeus japonicus. Fish Shellfish Immunol., 2010,28(4) :596-603.]。前不久，在墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)中，從肝胰腺克隆出CTLs基因FmLC，其含有2個CRD，一個CRD由一個QPD模序與一個鈣離子結(jié)合位點構(gòu)成，QPD模序與半乳糖特異結(jié)合，另一個CRD由一個EPN模序構(gòu)成，EPN模序是甘露糖特異結(jié)合位點；FmLC特異表達(dá)于肝胰腺中，其他組織中無表達(dá)，哈氏弧菌(Vibrio harveyi) 會邑上調(diào)其表達(dá)[Rattanaporn 0，UtarabhandP. Molecular cloning of a C-type lectin with two CRD domains from the banana shrimp :earlygene up—regulation after Vibrio harveyi infection. J Invertebr Pathol,2011,106(2) :196-204.]。
而且，許多編碼凝集素的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed-sequence tags，ESTs)已從日本對蝦、白濱對蝦(Litopenaeus setiferus)、凡納濱對蝦健康蝦的cDNA文庫中鑒定出來，它們是重要免疫器官肝胰腺中最大的免疫相關(guān)ESktGross PS, Bartlett TC， et al. Immune gene discoveryby expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp, Litopenaeus vannamei, and the Atlantic White Shrimp，L setiferus. Dev. Comp. Immunol. 2001，25 :565-577 ；Astrofsky KM，Roux MM, et al. Isolation of differentially expressed genesfrom white spot virus (WSV) infected Pacific blue shrimp(Penaeus stylirostris). Arch. Virol.2002， 147 :1799-1812.]，同時，部分編碼CTLs的cDNA也從感染W(wǎng)SSV與健康的凡納濱對蝦中獲得，篩選出1000多個合格的ESiTs,與病毒易感蝦相比較，病毒抵抗蝦中編碼CTLs的ESiTs 明顯地被上調(diào)[Zhao ZY, Yin ZX, et al. Profiling of differentially expressed genes inhepatopancreas of white spot syndrome virus-resistant shrimp (Litopenaeus vannamei)bysuppression subtractive hybridization. Fish Shellfish Immunol·，2007， 22:520-534.]。對于克氏原螯蝦(Procambarus clakii)，已建立了 WSSV 感染蝦的 cDNA 文庫，鑒定出多個編碼 CTLs 的 ESTs[Shi XZ, Li XC，et al. . Transcriptome analysis of hemocytes and hepatopancreas in redswamp crayfish, Procambarus clarkii， challenged with white spot syndrome virus.InvertebrateSurvival Journal，2010， 7 :119-131 ；Zeng Y，Lu CP. Identification of differentially expressed genesin haemocytes of the crayfish (Procambarus clarkii)infected with white spot syndrome virus bysuppression subtractive hybridization and cDNA microarrays. Fish Shellfish Immunol. 2009,26(4) :646-650.]。目前，關(guān)于克氏原螯蝦 CTLs (Pc-CTLs) 的研究報道很少，總的來說，只有2種Pc-CTLs被鑒定、研究，它們是Pc-Lecl與WJX，關(guān)于 Pc-Lecl的研究已被報道，在各種正常蝦組織中，尤其是肝胰腺與鰓中，Pc-Lecl為構(gòu)成性表達(dá)，被當(dāng)受到鰻弧菌、金葡菌或WSSV攻擊時，肝胰腺與鰓中的Pc-Lecl表達(dá)可被上調(diào)， Pc-Lecl能與肽聚糖、脂膜酸與脂多糖結(jié)合，但不能凝集細(xì)菌，可促進(jìn)體內(nèi)清除鰻弧菌，起調(diào)理功能[Zhang Xff, WangXff, Sun C, Zhao XF, Wang JX. C-type lectin from red swamp crayfish Procambarus clarkiiparticipates in cellular immune response. Arch Insect Biochem Physiol. 2011,76(3) :168-84]；另一Pc-CTLs，即 WJX，其 cDNA序列被注冊 (GenBank Accession NO. HM005300. 1)，但無相關(guān)研究報道。
上述研究表明，CTLs是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在免疫反應(yīng)、疾病反應(yīng)及生物反應(yīng)方面具有重要作用，能清除入侵病原體與病毒、激活酚氧化酶原系統(tǒng)、促進(jìn)吞噬、 結(jié)節(jié)形成、膠囊化、黑化、細(xì)胞粘附與聚集，調(diào)理各種生物反應(yīng)。甲殼類動物，尤其是對蝦，是水產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)物種，具有重大的商業(yè)價值，嚴(yán)重影響著水生生物的生態(tài)平衡。由于缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，只能完全依賴于先天性免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵，CTLs的作用尤顯重要。 近年來，由于WSSV的流行感染，水產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重受創(chuàng)，損失巨大，使WSSV的研究刻不容緩，但無對蝦細(xì)胞系，且對蝦價格昂貴，不易飼養(yǎng)，相關(guān)研究難以開展?？耸显r，與對蝦的親緣關(guān)系很近，都是開放性的體內(nèi)系統(tǒng)，體內(nèi)存在一些非致病菌或條件致病菌，在疾病狀態(tài)下都存在并發(fā)感染和繼發(fā)感染的可能性，是對蝦病毒、藥物篩選和免疫反應(yīng)研究的理想模式動物 [朱建中，陸承平.對蝦白斑綜合征病毒在螯蝦動物模型的感染特性[J].水產(chǎn)學(xué)報，2001， 25(1) :47-51 ；朱建中，陸承平.用動物模型檢驗消毒劑對對蝦白斑綜合征病毒的滅活效果 [J].中國獸藥雜志，2001,35 ) 6-7]. ο開展克氏原螯蝦CTLs的研究，有助于深入了解甲殼類動物先天免疫功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制，對免疫學(xué)研究的完整性和學(xué)科發(fā)展具有重要意義，同時可更系統(tǒng)、更全面地掌握各種疾病病情，為經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中的的病害防治提供切實可行、有效的方法與措施。因此，進(jìn)行克氏原螯蝦CTLs的研究具有重要的理論和實際應(yīng)用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因，該基因有利于各種免疫反應(yīng)，包括清除細(xì)菌、抗菌活性、抗病毒感染、與抗真菌。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因的制備方法，通過該方法可在知道基因部分核苷酸序列的情況下，快速而有效獲得該基因的完整核苷酸序列。一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因的克隆方法及一種能表達(dá)該C-型凝集素的原核表達(dá)菌株，同時提供該菌株所表達(dá)的重組C-型凝集素蛋白的純化與凝集素的凝集功能的鑒定。本發(fā)明所得到的重組C-型凝集素蛋白對多種細(xì)菌及兔紅細(xì)胞均表現(xiàn)出凝集作用。本發(fā)明的再一個目的是在于所提供了一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因在制備治療或預(yù)防蝦類、魚類養(yǎng)殖病蟲害藥物中的應(yīng)用。C型凝集素作為無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅介導(dǎo)識別病原體，而且參與多種生物反應(yīng)，包括結(jié)節(jié)形成、膠囊化、黑化、促進(jìn)吞噬、激活酚氧化酶原系統(tǒng)、細(xì)胞粘附與聚集，還有利于各種免疫反應(yīng)，包括清除細(xì)菌、抗菌活性、抗病毒感染、與抗真菌。除了本發(fā)明中的原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)，該克氏原螯蝦 C-型凝集素基因還可用于其他原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)及基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治和進(jìn)一步開發(fā)可用于生產(chǎn)蝦類和魚類抗病毒、抗細(xì)菌藥物奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明從克氏原螯蝦中克隆到了一種C-型凝集素基因(Pc-Clec)，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列及SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明獲得的重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白對多種細(xì)菌及兔紅細(xì)胞具有凝集作用。C型凝集素為無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅介導(dǎo)識別病原體，而且參與多種生物反應(yīng)，包括結(jié)節(jié)形成、膠囊化、黑化、促進(jìn)吞噬、激活酚氧化酶原系統(tǒng)、細(xì)胞粘附與聚集，還有利于各種免疫反應(yīng)，包括清除細(xì)菌、抗菌活性、抗病毒感染、與抗真菌?？稍谠吮磉_(dá)載體如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)載體如酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)、動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等常規(guī)且無需創(chuàng)造性勞動的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)凝集素重組蛋白，生產(chǎn)蝦類和魚類抗病毒、抗細(xì)菌藥物。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因的制備方法，其步驟是總RNA的提取取克氏原螯蝦肝胰腺lOOug，加入Iml TRIzol Reagent RNA提取試劑(Invitrogen)，用研磨棒充分研磨，其余具體操作根據(jù)hvitrogen公司的TRIzol ReagentRNA提取試劑說明書進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成取上述步驟1中的總RNA 5ug，以Iul Oligo (dT) 20為引物， 2uldNTP (IOmM)，4ul 5 X RT buffer, Iul Rnase Inhibitor, Iul ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶，力口 ddH20至終體積為20ul (根據(jù)Τ0Υ0Β0公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReveriTra Ace- α -cDNA kit) 說明書要求)，反轉(zhuǎn)錄程序為(42°C 60min,99°C 5min，4°C 5min)，得到cDNA。C-型凝集素基因(Pc-Clec)部分核苷酸序列的獲得根據(jù)文獻(xiàn)(X_Z Shi,X-C Li， S Wang,X_F Zhao,J-X Wang. Transcriptome analysis of hemocytes and hepatopancreas in red swampcrayfish, Procambarus clarkii, challenged with white spot syndrome virus. J InvertebrateSurviv, 2010, 7 (1) :119-131)設(shè)計一對引物 ClecF 及 ClecR，取上述步驟 2 中的 cDNA 2ul，加入引物 ClecF(15pmol/ul)及 ClecR(15pmol/ul)各 lul，2ul dNTP(2mM) ,2ul MgS04，5ul 10XK0D buffer, Iul KOD-Plus，36ul ddH20(總體系 50ul，根據(jù)T0Y0B0公司的PCR試劑盒(KOD-Plus kit)說明書進(jìn)行)，PCR程序為(94°C 5min ；94°C 30s, 560C 30s,68°C 30s,30cycles ；68°C IOmin ；4°C 5min)。ClecF :5，-GTTATTGACGACTCCACCTT-3，(正向)ClecR :5，-GTCTTCCCATTGACCCACTT-3，(反向)；PCR產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物ClecF及ClecR進(jìn)行雙向測序(上海生工生物有限公司)，得到Pc-Clec基因部分核苷酸序列。3’ -RACE =C-型凝集素基因(Pc-Clec) 3’端核苷酸序列的獲得，根據(jù)步驟2中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息設(shè)計2條特異性正向引物Clec-3 :5，-TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3，(用于 3，-First round PCR)Clec-n3 :5，-TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3，(用于 3，-NET PCR)3，-RACE-Ready cDNA 的獲得取步驟 1 中的總 RNA 3ug,以 3，-RACE CDSPrimerA(3‘ -CDS 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3', SMARTTM RACEcDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄所需其他試劑及反轉(zhuǎn)錄程序按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)試劑盒說明書進(jìn)行，得到 3， -RACE-Ready cDNA。3，-First round PCR 取 Iul 3，-RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Clec-3 及 IOXUPM 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行 3，-Firstround PCR 擴(kuò)增，得到 3，-First round PCR 產(chǎn)物。3，-NET PCR:取 Iul 3’-First round PCR 產(chǎn)物為模板，用特異性引物 Clec_n3 與 NUP 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行5，-NET-PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為-MV 2 分鐘；94°C 30 秒，60°C 30 秒，68°C 30 秒， 30cycles ；68°C 5 分鐘；25°C 5 分鐘，得到 3，-NETPCR 產(chǎn)物。3，端核苷酸序列的獲得將3，-NET-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物CleC-n3及NUP進(jìn)行雙向測序(上海生工生物有限公司)，獲得克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Cec)的3’端序列。5’ -RACE =C-型凝集素基因(Pc-Clec) 5’端核苷酸序列的獲得，根據(jù)步驟3中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息設(shè)計2條特異性反向引物，Clec-5 :5，-GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3，(用于 5，-First round PCR)Clec-n5 :5，-CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3，(用于 5，-NET PCR)5，-RACE-Readyc DNA的獲得取步驟1中的肝胰腺總RNA 5ug，以SMART II AOligonucIeotide 引物(SMART A 5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)試劑盒提供)及 5，-RACE CDS PrimerA 引物 (5，-CDS :5，-(T)25VN-3，，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄所需其他試劑及反轉(zhuǎn)錄程序按SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)試劑盒說明書進(jìn)行，得到 5，-RACE-Ready cDNA。5，-First round PCR 取 Iul 5，-RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Clec-5 及 IOXUPM 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行 5，-Firstround PCR 擴(kuò)增，得到 5，-First round PCR 產(chǎn)物。5，-NET PCR:取 Iul 5，-First round PCR 產(chǎn)物為模板，用特異性引物 Clec_n5 與 NUP 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行 5，-NET-PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為-MV 2 分鐘；94°C 30 秒，60°C 30 秒，68°C 30 秒， 30cycles ；68°C 5 分鐘；25°C 5 分鐘，得到 5，-NETPCR 產(chǎn)物。5’端核苷酸序列的獲得將5’-NET-PCR產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物CleC-n5及NUP進(jìn)行雙向測序(上海生工生物有限公司)，獲得克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Cec)的5’端序列。C-型凝集素基因(Pc-Clec)完整核苷酸序列的獲得將3’-RACE獲得的克氏原螯蝦C-型凝集素(Pc-Cec)的3’端序列及5’_RACE獲得的克氏原螯蝦C-型凝集素(Pc-Cec) 的5’端序列用DNAssist Version 2. O進(jìn)行拼接，得到完整的C-型凝集素基因(Pc-Clec) 核苷酸序列。C-型凝集素基因(Pc-Clec)所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用生物學(xué)軟件 DNAssistVersion 2. O對(5)中獲得的C-型凝集素基因(Pc-Clec)核苷酸序列進(jìn)行ORF Finding分析，發(fā)現(xiàn)其含有的完整ORF長為510bp，編碼169個氨基酸的多肽，該多肽理論蛋白質(zhì)分子量為19KD，該多肽蛋白等電點IP(Isoelectric Point)為4. 1。.一種分離的克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Clec)，其序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，是在步驟1-(5)中由軟件拼接獲得。一種分離的克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，是在步驟1-(6)中由軟件分析獲得。該克氏原螯蝦C-型凝集素Pc-Clec基因的蛋白質(zhì)活性功能鑒定數(shù)據(jù)在下述“克氏原螯蝦C-型凝集素”凝集功能的鑒定中實施例4 “細(xì)菌凝集功能鑒定”和實施例5 “兔紅細(xì)胞凝集功能鑒定”所示。一種能表達(dá)該克氏原螯蝦C-型凝集素的原核表達(dá)菌株(Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec)的獲得，其步驟是引物設(shè)計用生物學(xué)軟件SignalP(SignalP 3. 0)分析所獲得的C-型凝集素基因(Pc-Clec) 完整的開放閱讀框ORF所編碼的蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦C-型凝集素(Pc-Clec)所編碼的蛋白質(zhì)在其N端具有一個長17個氨基酸的信號肽，因此根據(jù)克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Clec)的序列，設(shè)計引物擴(kuò)增其成熟肽核苷酸編碼序列mClecF :5’ -ATAGCTAGCGATTCTCCAATAAACAAGGCCAGAT-3， (NheI)mClecR :5，-GCTGGATCCTAAAGTACTGTGTATTCACAAATGG-3， (BamHI)本發(fā)明選擇將凝集素基因插入到pET28a⑴載體的Nhe I和BamH I位點之間?；驍U(kuò)增、克隆與重組質(zhì)粒鑒定取5，RACE 中的 5，-RACE-Ready cDNA Iul 為模板，加入引物 mClecF (15pmol/ ul)及 mClecR(15pmol/ul)各 lul，2ul dNTP (2mM), 2ul MgS04，5ul 10XK0D buffer, Iul K0D-Plus，37ul ddH20(總體系 50ul，根據(jù) Τ0Υ0Β0 公司的 PCR 試劑盒(KOD-Plus kit)說明書進(jìn)行)，PCR 程序為(94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 68°C 30s,30cycles ；68°C IOmin ； 4°C 5min)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測后用TIANGEN Gel Extraction Kit進(jìn)行回收、純化， 再用Nhe I和BamH I對純化的PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET28a (+)進(jìn)行雙酶切，電泳回收目的條帶，用T4 Iigase連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Kan(30ug/ml)瓊脂平板。PCR 鑒定的陽性克隆提取質(zhì)粒用Nhe I和BamH I雙酶切及測序鑒定，正確者即為所需的重組表達(dá)載體pET28a-mClec，酶切鑒定如圖1 (Fig 1)。接著將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)， PCR鑒定正確者即為基因工程表達(dá)菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-mClec0通過上述方法獲得了一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因Pc-Clec和表達(dá)該凝集素蛋白的菌株 Escherichiacoli BL21 (DE3)pET-28a_mClec。所述的重組大腸桿菌菌株基因工程表達(dá)菌株 Escherichia coliBL21 (DE3)pET-28a_mClec 是具有質(zhì)粒 pET-28a_mClec 的大腸桿菌菌株，保藏編號CCTCC，NO :M2011205，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2011年6月22日，分類命名Escherichia coli BL21(DE3) pET-28a_mClec, F- ompT hsdSB (rB"mB_) gal dcm(DE3)。3、重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白mClec的表達(dá)及純化，其步驟是重組C-型凝集素蛋白(mClec)的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定接種鑒定正確的Escherichia coli BL21 (DE3) pET-28a_mClec 于含 15ug/ml 卡那霉素的20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。次日取Iml培養(yǎng)物接種于含相同抗性的20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 6，加入終濃度為1. Ommol/ L IPTG，37°C誘導(dǎo) 4h 后，離心 12000g，4°C，10min 收集菌體，用 10ml lysis Buffer (50mM Tris-HCl,5mM EDTA, 150mM NaCl，PH8. 0)重懸超聲波破碎，離心收集上清和沉淀并用 SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。重組C-型凝集素蛋白(mClec)的純化①樣品的制備
按照上述誘導(dǎo)的方法發(fā)酵IL工程菌hcherichia coli BL21(DE3) pET-28a-mClec,于室溫O0_25°C以下相同)4000rpm離心10分鐘，收集并稱量濕菌體。取 Ig濕菌體加入30ml IysisBuffer (50mM Tris-HCl,5mM EDTA, 150mM NaCl，PH8. 0)，_20°C反復(fù)凍融3次，再進(jìn)行超聲波破碎，工作3秒，間歇3秒)，待菌液破碎至清亮。將破碎后的菌液于4°C，IOOOOrpm離心20分鐘，收集上清及沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測。②包涵體稀釋復(fù)性SDS-PAGE電泳檢測證實，重組C-型凝集素蛋白(mClec)以包涵體形式表達(dá)。 包涵體經(jīng)2M尿素洗滌后，加入適量包涵體裂解液(50mM Tris-HCl,5mM EDTA，8M尿素， 0. 15MNaCl, pH8. 0)于冰上裂解過夜。裂解液經(jīng)12000rpm IOmin離心后棄沉淀，上清液適量稀釋于蛋白復(fù)性液中(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素，0. 15M NaCl，pH8. 0)，4度復(fù)性過夜。次日將復(fù)性液裝入透析袋于透析液(50mM Tris-HCl,0. 15M NaCl，pH8.0)透析Mh， 期間更換透析液2次。蛋白經(jīng)PEG20000濃縮后，12000rpm IOmin離心，上清即為復(fù)性好的重組C-型凝集素蛋白(mClec)。用SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果。③Bradford法測定純化的重組C-型凝集素蛋白(mClec)濃度，操作按照 Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)說明書進(jìn)行。4、重組C-型凝集素蛋白(mClec)細(xì)菌凝集活性測定，其步驟是①微生物的接種分別取保種的大腸桿菌E. coli JM109 (在INVITR0GEN公司購置)，嗜水氣單胞菌 A. hydrophila (本實驗室保藏)，金黃色葡萄球S. aureu (本實驗室保藏)甘油菌IOul，接種于含20ml LB的三角瓶中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。②微生物懸液的制備將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌E. coli JM109，嗜水氣單胞菌A. hydrophila，金黃色葡萄球S. aureu,分別吸取IOOul轉(zhuǎn)接入含20ml LB的三角瓶中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)2h， 得到對數(shù)生長期菌液。分別吸取對數(shù)生長期的大腸桿菌E. coli JM109，嗜水氣單胞菌 A. hydrophila，金黃色葡萄球 S. aureu 各 1ml，5000rpm 離心 lOmin，菌體用 TBS 溶液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH7. 5)重懸洗滌，5000rpm離心IOmin棄上清，連續(xù)洗滌3次，最后用 ImlTBS重懸菌體。各取IOul重懸的菌液用ddH20稀釋至IOOul后，取IOul稀釋液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，最后用TBS將TBS重懸的菌液稀釋至每毫升2X 108個菌。③重組mClec對細(xì)菌的凝集作用取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板一塊，用微量移液器向各孔加入菌液0\108個/!111)25111，再分別加入 25ul 的 BSA(50ug/ml，含 20mM Ca2+)，重組mClec (50ug/ml)，重組mClec (50ug/ml， 含20mM Ca2+)，在輕微振搖30s，室溫O0_25°C以下相同)下靜置lh，將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)菌凝集結(jié)果。5、重組C-型凝集素蛋白(mClec)兔紅細(xì)胞凝集活性測定，其步驟是①兔紅細(xì)胞懸液的制備用5ml —次性無菌注射器，吸取2ml滅菌阿氏液(Elsevier，s溶液100mM葡萄糖，20mMNaCI，30mM檸檬酸鈉，pH7. 2)，耳緣靜脈無菌采取兔子的靜脈血^iil，上下顛倒數(shù)次后隨即注入裝有鈿1阿氏液的IOml離心管中，800g離心5min棄上清，8ml 0.9%生理鹽水洗3次，每次800g離心5min，最后一次800g離心IOmin離心，棄上清液，沉淀即為可供配制
13紅細(xì)胞懸液的血球泥，取IOOul血球泥用900ul 0. 9%生理鹽水重懸配置成10% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液用于實驗。其余血球泥用阿氏液配制成10% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液，置于4°C保存。②重組mClec對兔紅細(xì)胞的凝集作用取30ul 10% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液，用970ul 0. 9%生理鹽水配制成0. 33% (ν/ν) 的紅細(xì)胞懸液。分別取25ul 0. 33% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液滴于無菌載玻片3處不同位置上， 再分別吸取 25ul 的 BSA (50ug/ml，含 20mM Ca2+)，重組 mClec (50ug/ml)，重組 mClec (50ug/ ml，含20mM Ca2+)分別滴入載玻片三個相應(yīng)的紅血球懸浮液滴中，輕微混勻，4°C保濕靜置 Ih后，將載玻片置于倒置顯微鏡下觀察凝集結(jié)果。通過以上技術(shù)措施獲得了克氏原螯蝦C-型凝集素基因Pc-Clec和表達(dá)該凝集素蛋白的菌株hcherichia coli BL21 (DE3)pET-28a_mClec，該凝集素基因及凝集素蛋白可在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于病害防治。應(yīng)用的基本過程為，表達(dá)的有活性的凝集素蛋白，與水產(chǎn)飼料如蝦飼料、魚飼料以粘合劑粘合后投喂蝦和魚，凝集素介導(dǎo)識別病原體，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，幫助清除細(xì)菌、真菌及病毒。C-型凝集素為無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅介導(dǎo)識別病原體，而且參與多種生物反應(yīng)，包括結(jié)節(jié)形成、膠囊化、黑化、促進(jìn)吞噬、激活酚氧化酶原系統(tǒng)、細(xì)胞粘附與聚集，還有利于各種免疫反應(yīng)，包括清除細(xì)菌、抗菌活性、抗病毒感染、與抗真菌。本發(fā)明的克氏原螯蝦C-型凝集素基因在制備具有凝集作用的重組蛋白中的應(yīng)用，所述應(yīng)用的方法是通過基因重組技術(shù)使所述克氏原螯蝦C-型凝集素基因Pc-Clec在原核表達(dá)載體如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)載體如酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)、動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等常規(guī)且無需創(chuàng)造性勞動的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，獲得具有凝集活性的重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白。在本發(fā)明中，將獲得的克氏原螯蝦C-型凝集素基因克隆到pET28a(+)原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化，獲得了具有凝集活性的重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白，并利用獲得的重組蛋白進(jìn)行了細(xì)菌凝集實驗及紅細(xì)胞凝集實驗。利用本發(fā)明獲得的重組的克氏原螯蝦C-型凝集素，對多種細(xì)菌及兔紅細(xì)胞具有凝集作用，重組的凝集素蛋白可用于飼料添加劑，用于生產(chǎn)蝦類和魚類抗病毒、抗細(xì)菌藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果C-型凝集素為無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅介導(dǎo)識別病原體，而且參與多種生物反應(yīng)，包括結(jié)節(jié)形成、膠囊化、黑化、促進(jìn)吞噬、激活酚氧化酶原系統(tǒng)、細(xì)胞粘附與聚集，還有利于各種免疫反應(yīng)，包括清除細(xì)菌、抗菌活性、抗病毒感染、與抗真菌。本發(fā)明獲得了克氏原螯蝦C-型凝集素基因Pc-Clec及表達(dá)該凝集素蛋白的大腸桿菌基因工程菌株hcherichia coli BL21 (DE3)pET-28a_mClec。本發(fā)明采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、3，-端cDNA快速擴(kuò)增(3，RACE)以及Smart cDNA的方法，從克氏原螯蝦中克隆到C-型凝集素基因，優(yōu)點是通過該方法可在知道基因部分核苷酸序列的情況下，快速而有效獲得該基因的完整核苷酸序列。本發(fā)明獲得了表達(dá)重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白mClec的大腸桿菌基因工程菌株hcherichia coli BL21 (DE3)pET-28a_mClec，該工程菌株通過簡單的發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體稀釋復(fù)性，即可得到大量的具有凝集活性的基因工程重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白mClec，該重組凝集素蛋白對多種細(xì)菌及兔紅細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凝集作用。本發(fā)明獲得的重組凝集素蛋白可作為飼料添加劑，用于生產(chǎn)蝦類和魚類抗病毒、 抗細(xì)菌藥物。


圖1為一種重組表達(dá)載體pET28a-mCleC的構(gòu)建流程。圖2為重組表達(dá)載體pET28a-mCleC的雙酶切鑒定圖。M =DNA Marker IV(7000，5500，2000，1000，500bp)。1 重組表達(dá)載體pET28a-mCleC Nhe I&BamH I雙酶切鑒定(箭頭所指為酶切目的片段)。圖 3 為工程菌 pET28a_mClec/BL21 (DE3)的 PCR 鑒定圖。+:陽性對照。陰性對照。1_3:PCR 陽性克隆。圖4為一重組凝集素蛋白mClec的表達(dá)及純化圖。M 蛋白 marker (91. 0,66. 2,43. 0,35. 0,23. 4，14. 4KD)。1 工程菌 pET28a_mClec/BL21(DE3)誘導(dǎo)前。2 工程菌 pET28a_mClec/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后。3 純化的重組凝集素蛋白mClec (箭頭所示，19KD)。圖5為重組凝集素蛋白mClec的凝集作用圖。A 重組凝集素蛋白mClec對細(xì)菌的凝集作用(大腸桿菌E. coli JM109，金黃色葡萄球菌S. aureus,嗜水汽單胞菌A. hydrophila)。B 重組凝集素蛋白mClec對兔紅細(xì)胞的凝集作用。圖6為蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為不同稀釋度的WSSV病毒液感染原克氏螯蝦累計死亡率曲線。圖8為mClec處理WSSV后感染的克氏螯蝦累計死亡率曲線。
具體實施例方式實施例1 一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因的制備方法，其步驟是總RNA的提取取克氏原螯蝦肝胰腺lOOug，加入Iml TRIzol Reagent RNA提取試劑(Invitrogen)，用研磨棒充分研磨，其余具體操作根據(jù)hvitrogen公司的TRIzol Reagent RNA提取試劑說明書進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成取上述(1)中的總RNA 5ug，以Iul Oligo (dT) 20為引物， 2uldNTP (IOmM)，4ul 5 X RT buffer, Iul Rnase Inhibitor, Iul ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶，加 ddH20至終體積為20ul (根據(jù)Τ0Υ0Β0公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace- α -cDNA kit) 說明書要求)，反轉(zhuǎn)錄程序為(42°C 60min,99°C 5min，4°C 5min)，得到cDNA。C-型凝集素基因(Pc-Clec)部分核苷酸序列的獲得根據(jù)文獻(xiàn)()設(shè)計一對引物ClecF 及 ClecR，取上述(2)中的 cDNA2ul，加入引物 ClecF (15pmol/ul)及 ClecR(15pmol/ ul)各 lul，2ul dNTP(2mM)，2ul MgS04，5ul 10XK0D buffer, Iul KOD-Plus, 36ul ddH20(總體系50ul，根據(jù)T0Y0B0公司的PCR試劑盒(KOD-Plus kit)說明書進(jìn)行)，PCR程序為(94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 68°C 30s,30cycles ；68°C IOmin ；4°C 5 min)。ClecF :5，-GTTATTGACGACTCCACCTT-3，(正向)ClecR :5，-GTCTTCCCATTGACCCACTT-3，(反向)；PCR產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物ClecF及ClecR進(jìn)行雙向測序(上海生工生物有限公司)，得到Pc-Clec基因部分核苷酸序列。3’ -RACE :c-型凝集素基因(Pc-Clec)3’端核苷酸序列的獲得，根據(jù)(3)中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息設(shè)計2條特異性正向引物Clec-3 :5，-TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3，(用于 3，-First round PCR)Clec-n3 :5，-TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3，(用于 3，-NET PCR)3' -RACE-Readyc DNA 的獲得取(1)中的總 RNA 3ug,以 3，-RACE CDSPrimerA(3‘ -CDS 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3', SMARTTM RACEcDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄所需其他試劑及反轉(zhuǎn)錄程序按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)試劑盒說明書進(jìn)行，得到 3， -RACE-Ready cDNA。3，-First round PCR 取 Iul 3，-RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Clec-3 及 10XUPM 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行 3，-Firstround PCR 擴(kuò)增，得到 3，-First round PCR 產(chǎn)物。3，-NET PCR:取 Iul 3，-First round PCR 產(chǎn)物為模板，用特異性引物 Clec_n3 與 NUP 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行 5，-NET-PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為94°C 2 分鐘；94°C 30 秒，60°C 30 秒，68°C 30 秒， 30cycles ；68°C 5 分鐘；25°C 5 分鐘，得到 3，-NET PCR 產(chǎn)物。3，端核苷酸序列的獲得將3，-NET-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物CleC-n3及NUP進(jìn)行雙向測序(上海生工生物有限公司)，獲得克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Cec)的3’端序列。5’ -RACE :C_型凝集素基因(Pc-Clec)5’端核苷酸序列的獲得，根據(jù)(3)中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息設(shè)計2條特異性反向引物，Clec-5 :5，-GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3，(用于 5，-First round PCR)Clec-n5 :5，-CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3，(用于 5，-NET PCR)5，-RACE-Ready cDNA 的獲得取(1)中的肝胰腺總 RNA 5ug，以 SMART II AOligonucIeotide 引物(SMART A 5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)試劑盒提供)及 5，-RACE CDS PrimerA 引物 (5，-CDS :5，-(T)25VN-3，，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄所需其他試劑及反轉(zhuǎn)錄程序按SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)試劑盒說明書進(jìn)行，得到 5，-RACE-Ready cDNA。5，-First round PCR 取 Iul 5，-RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Clec-5 及 IOXUPM 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行5，-Firstround PCR 擴(kuò)增，得到 5，-First round PCR 產(chǎn)物。5，-NET PCR 取 Iul 5，-First round PCR 產(chǎn)物為模板，用特異性引物 Clec_n5 與 NUP 引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒提供)進(jìn)行 5，-NET-PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為-MV 2 分鐘；94°C 30 秒，60°C 30 秒，68°C 30 秒， 30cycles ；68°C 5 分鐘；25°C 5 分鐘，得到 5，-NETPCR 產(chǎn)物。5’端核苷酸序列的獲得將5’-NET-PCR產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物CleC-n5及NUP進(jìn)行雙向測序(上海生工生物有限公司)，獲得克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Cec)的5’端序列。C-型凝集素基因(Pc-Clec)完整核苷酸序列的獲得將3’-RACE獲得的克氏原螯蝦C-型凝集素(Pc-Cec)的3’端序列及5’_RACE獲得的克氏原螯蝦C-型凝集素(Pc-Cec) 的5’端序列用DNAssist Version 2. O進(jìn)行拼接，得到完整的C-型凝集素基因(Pc-Clec) 核苷酸序列。C-型凝集素基因(Pc-Clec)所編碼的蛋白質(zhì)分析通過NCBI BLAST同源性檢索分析，提示所克隆的克氏原螯蝦凝集素(Pc-Clec)為C型凝集素。實施例2:一種能表達(dá)該克氏原螯蝦C-型凝集素的原核表達(dá)菌株hcherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-mClec的獲得，整個構(gòu)建流程如圖Fig 1所示，其步驟是引物設(shè)計用生物學(xué)軟件SignalP(SignalP 3. 0)分析所獲得的C-型凝集素基因(Pc-Clec) 完整的開放閱讀框ORF所編碼的蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦C-型凝集素(Pc-Clec)所編碼的蛋白質(zhì)在其N端具有一個長17個氨基酸的信號肽，因此根據(jù)克氏原螯蝦C-型凝集素基因(Pc-Clec)的序列，設(shè)計引物擴(kuò)增其成熟肽核苷酸編碼序列mClecF :5，-ATAGCTAGCGATTCTCCAATAAACAAGGCCAGAT-3，(Nhe I)mClecR :5，-GCTGGATCCTAAAGTACTGTGTATTCACAAATGG-3，(BamH I)本發(fā)明選擇將凝集素基因插入到pET28a(+)載體的Nhe I和BamH I位點之間。基因擴(kuò)增、克隆與重組質(zhì)粒鑒定取5，RACE 中的 5，-RACE-Ready cDNA Iul 為模板，加入引物 mClecF (15pmol/ ul)及 mClecR(15pmol/ul)各 lul，2ul dNTP (2mM), 2ul MgS04，5ul 10XK0D buffer, Iul K0D-Plus，37ul ddH20(總體系 50ul，根據(jù) Τ0Υ0Β0 公司的 PCR試劑盒(KOD-Plus kit)說明書進(jìn)行)，PCR 程序為(94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 68°C 30s,30cycles ；68°C IOmin ； 4°C 5min)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測后用TIANGEN Gel Extraction Kit進(jìn)行回收、純化，再用Nhe I和BamH I對純化的PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET28a (+)進(jìn)行雙酶切，電泳回收目的條帶，用"Γ4 Iigase連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Kan(30ug/ml)瓊脂平板。PCR鑒定的陽性克隆提取質(zhì)粒用Nhe I和BamH I雙酶切及測序鑒定，正確者即為所需的重組表達(dá)載體pET28a-mClec，酶切鑒定如圖2(Fig 2)。接著將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，PCR 鑒定正確者即為基因工程表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)pET-28a-mClec, PCR鑒定結(jié)果如圖 3 (Fig 3)所示。實施例3:
重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白mClec的表達(dá)及純化，其步驟是重組C-型凝集素蛋白(mClec)的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定接種鑒定正確的pET28a-mClec/BL21(DE;3)于含15ug/ml卡那霉素的20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。次日取Iml培養(yǎng)物接種于含相同抗性的20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600 = 0.6，加入終濃度為1. Ommol/L IPTG，37°C誘導(dǎo)4h 后，離心 12 000g，4°C，IOmin 收集菌體，用 IOml lysis Buffer(50mM Tris-HCl,5mM EDTA, 150mM NaCl,PH8. 0)重懸超聲波破碎，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。SDA-PAGE結(jié)果如圖4(Fig 4)所示。重組克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白(mClec)的純化①樣品的制備按照上述誘導(dǎo)的方法發(fā)酵IL工程菌pET28a-mClec/BL21 (DE3)，于室溫4000rpm 離心10分鐘，收集并稱量濕菌體。取Ig濕菌體加入30ml lysis Buffer (50mM Tris-HCl, 5mMEDTA, 150mM NaCl，PH8. 0)，_20°C反復(fù)凍融3次，再進(jìn)行超聲波破碎，工作3秒，間歇3秒)，待菌液破碎至清亮。將破碎后的菌液于4°C，IOOOOrpm離心20分鐘，收集上清及沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測。②包涵體稀釋復(fù)性SDS-PAGE電泳檢測證實，重組C-型凝集素蛋白(mClec)以包涵體形式表達(dá)。 包涵體經(jīng)2M尿素洗滌后，加入適量包涵體裂解液(50mM Tris-HCl,5mM EDTA，8M尿素， 0. 15MNaCl, pH8. 0)于冰上裂解過夜。裂解液經(jīng)12000rpm IOmin離心后棄沉淀，上清液適量稀釋于蛋白復(fù)性液中(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素，0. 15M NaCl，pH8. 0)，4度復(fù)性過夜。次日將復(fù)性液裝入透析袋于透析液(50mM Tris-HCl,0. 15M NaCl，pH8.0)透析Mh， 期間更換透析液2次。蛋白經(jīng)PEG20000濃縮后，12000rpm IOmin離心，上清即為復(fù)性好的重組C-型凝集素蛋白(mClec)。用SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果。純化結(jié)果如圖4(Fig 4) 所示。③Bradford法測定純化的重組C-型凝集素蛋白(mClec)濃度，操作按照 Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)說明書進(jìn)行。實施例4:重組C-型凝集素蛋白(mClec)細(xì)菌凝集活性測定，其步驟是①微生物的接種分別取保種的大腸桿菌E. coli JM109，嗜水氣單胞菌A.hydrophila，金黃色葡萄球S. aureu甘油菌IOul，接種于含20ml LB的三角瓶中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。②微生物懸液的制備將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌E. coli JM109，嗜水氣單胞菌A.hydrophila，金黃色葡萄球S. aureu,分別吸取IOOul轉(zhuǎn)接入含20ml LB的三角瓶中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)2h， 得到對數(shù)生長期菌液。分別吸取對數(shù)生長期的大腸桿菌E. coli JM109，嗜水氣單胞菌 A. hydrophila，金黃色葡萄球 S. aureu 各 1ml，5000rpm 離心 lOmin，菌體用 TBS 溶液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH7. 5)重懸洗滌，5000rpm離心IOmin棄上清，連續(xù)洗滌3次，最后用 ImlTBS重懸菌體。各取IOul重懸的菌液用ddH20稀釋至IOOul后，取IOul稀釋液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，最后用TBS將TBS重懸的菌液稀釋至每毫升2X 108個菌。
③重組mClec對細(xì)菌的凝集作用取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板一塊，用微量移液器向各孔加入菌液0\108個/!111)25111，再分別加入 25ul 的 BSA(50ug/ml，含 20mM Ca2+)，重組 mClec (50ug/ml)，重組 mClec (50ug/ ml，含20mM Ca2+)，在輕微振搖30s，室溫下靜置lh，將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)菌凝集結(jié)果。凝集結(jié)果如圖5 (Fig 5A)所示。實施例5:重組C-型凝集素蛋白(mClec)對兔紅細(xì)胞凝集活性測定，其步驟是①兔紅細(xì)胞懸液的制備用5ml —次性無菌注射器，吸取2ml滅菌阿氏液(Elsevier’ s溶液100mM葡萄糖，20mMNaCI，30mM檸檬酸鈉，pH7. 2)，耳緣靜脈無菌采取兔子的靜脈血^iil，上下顛倒數(shù)次后隨即注入裝有鈿1阿氏液的IOml離心管中，800g離心5min棄上清，8ml 0.9%生理鹽水洗3次，每次800g離心5min，最后一次800g離心IOmin離心，棄上清液，沉淀即為可供配制紅細(xì)胞懸液的血球泥，取IOOul血球泥用900ul 0. 9%生理鹽水重懸配置成10% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液用于實驗。其余血球泥用阿氏液配制成10% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液，置于4°C保存。②重組mClec對兔紅細(xì)胞的凝集作用取30ul 10% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液，用970ul 0. 9%生理鹽水配制成0. 33% (ν/ν) 的紅細(xì)胞懸液。分別取25ul 0. 33% (ν/ν)的紅細(xì)胞懸液滴于無菌載玻片3處不同位置上， 再分別吸取 25ul 的 BSA (50ug/ml，含 20mM Ca2+)，重組 mClec (50ug/ml)，重組 mClec (50ug/ ml，含20mM Ca2+)分別滴入載玻片三個相應(yīng)的紅血球懸浮液滴中，輕微混勻，4°C保濕靜置 Ih后，將載玻片置于倒置顯微鏡下觀察凝集結(jié)果。凝集結(jié)果如圖5(Fig 5B)所示。實施例6:重組C-型凝集素蛋白(mClec)抗WSSV活性測定，其步驟是1.重組蛋白MClec在大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)中的表達(dá)(1)從過夜培養(yǎng)的固體LB平板(Kan+，終濃度30yg/ml)上挑取攜帶有質(zhì)粒 pET-28a-Lec的E. coli BL21 (DE3)單菌落，接種于含卡那霉素(終濃度30 μ g/ml)的20ml LB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床中300rpm過夜培養(yǎng)。(2)次日以1 %的比例接種到含卡那霉素(終濃度30 μ g/ml)的20ml新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中，于37 °C恒溫?fù)u床中300rpm培養(yǎng)2. 5 3h左右。(3)加入IPTG至終濃度為0. 6mmol/L,于37°C恒溫?fù)u床中誘導(dǎo)表達(dá)釙。(4)常溫下4000rpm離心30min，棄上清，保留菌體沉淀。取部分菌體沉淀用適量細(xì)胞裂解液重懸，并400W超聲破碎，4°C，工作3秒，間歇3秒，破碎至菌液清亮即可。(5)取11111細(xì)菌破碎液，12000印111離心11^11，取5(^1上清并于其中加入5(^1^等體積的2 X SDS-PAGE樣品緩沖液，充分混勻。將其余上清棄掉，用Iml無菌水重懸破碎液沉淀，并取50 μ 1重懸液加入到50 μ 1 2 X SDS-PAGE樣品緩沖液，充分混勻。(6)將上述兩個樣品做好標(biāo)記并于沸水中煮IOmin后，用于SDS-PAGE檢測。以檢測目的蛋白是否表達(dá)并檢測其表達(dá)形式是包涵體還是可溶的。同時以未加入IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對照組樣品。2.包涵體的純化
(1)從固體LB(Kan+，終濃度30 μ g/ml)平板上挑取攜帶有質(zhì)粒pETj8a-LeC的 E. coliBL21 (DE3)單菌落，接種于含卡那霉素(終濃度30 μ g/ml)的20ml LB液體培養(yǎng)基中，于37 °C搖床中，200rpm振搖活化培養(yǎng)過夜。(2)第二日，按的比例接種到200ml新鮮的2_YT(16g胰蛋白胨，IOg酵母提取物，5g氯化鈉)液體培養(yǎng)基中，于37 °C恒溫?fù)u床中200rpm培養(yǎng)大概池左右，至0D600達(dá)到約 0. 6-0. 8。(3)加入誘導(dǎo)物IPTG(IM)至終濃度為0. 6mM,于37°C搖床中誘導(dǎo)表達(dá)證。(4)經(jīng)過SDS-PAGE電泳檢測證實，重組蛋白MClec以包涵體形式表達(dá)。4000rpm 離心 30min，收集菌體，用 30ml 細(xì)胞裂解液(50mM Tris_HCl，5mM EDTA, 50mM NaCl, PH8. 0) 重懸，400W超聲破碎，4°C，工作3秒，間歇3秒，破碎至菌液清亮即可，然后將破碎液4°C 12000rpm離心15min，棄上清。(5)沉淀經(jīng)包涵體洗滌液 QM urea, 50mM Tris_Hcl，5mM EDTA，0.15M Nac 1, PH 8. 0)重懸并洗滌2次后，加入IOml包涵體裂解液溶液重懸并變澄清，4°C裂解過夜。(6)將包涵體裂解液4°C 8000rpm離心IOmin后棄去沉淀，將上清液稀釋于40ml 蛋白復(fù)性液中，4°C復(fù)性過夜。(7)用透析袋處理液 O%mNaHC03，ImMWEDTA)將透析袋(3. 5kDa)煮沸 lOmin， 用無菌水洗凈，備用。(7)將復(fù)性液用0.45 μ m濾膜過濾后裝入透析袋，于透析液(50mM Tris-HCl, 0. 15MNaCl，pH8. 0)中透析Mh，期間更換透析液1次。用PEG20000將透析袋中的蛋白濃縮 3倍后，4°C SOOOrpm離心5min，上清即為復(fù)性好的重組蛋白。用SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)^ ο3 Bradford法測定純化的mClec的蛋白濃度(1)將Bradford試劑工作液平衡至室溫并顛倒混勻，將酶標(biāo)儀預(yù)熱。(2)取50 μ 1牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)液(lmg/ml)加入到50 μ IlOmM PBS中充分混勻,此時BSA濃度為500 μ g/ml。(3)將0、2、4、6、8、12μ1上述稀釋好的BSA溶液依次加入酶標(biāo)微孔板中，用 IOmMPBS 補(bǔ)足至 20 μ 1，對應(yīng) BSA 的終濃度分別為 0、50、100、150、200、250、300 μ g/ml。(3)向每孔中加入200 μ 1 Bradford試劑工作液(0. 考馬斯亮藍(lán)G250，5%乙
醇，8. 5%磷酸)振蕩混勻后室溫放置2分鐘。(4)用酶標(biāo)儀測BSA蛋白各濃度的0D570值。以BSA蛋白濃度為橫坐標(biāo)，BSA蛋白各濃度的0D570值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6(5)用同樣的方法測定樣品的0D570值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定樣品的濃度。在excel中得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為y = 0. OOMx，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 9925。將測定的純化的重組mClec蛋白溶液的吸光度值代入此公式中即可計算出這種蛋白的蛋白濃度。最后得到mClec蛋白的濃度為220 μ g/ml。4.病毒活化與提取將螯蝦分裝，10尾每盒，總共兩盒。取出-20°C冰箱中儲存的WSSV解凍，第一盒每只蝦注射 100 μ 1 解凍的 WSSV 病毒，另一盒注射 100 μ 1 TN buffer (0. 02M Tris_HCl，0. 4M NaCl,PH7. 4)作為對照。室溫培養(yǎng)，3天后取感染病毒的瀕死的螯蝦取腮絲和肝胰腺，稱重，加入10倍體積TN buffer,冰上充分研磨，4000rpm離心10分鐘，取上清再8000rpm離心 20min,最后將所得上清液過0. 45 μ m濾膜，每管200 μ 1分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?.病毒滴度測定將螯蝦分為9個組，每組15尾。將提取的病毒用TN buffer稀釋成10_1，10-2, 10-3，10-4，10-5，10-6，10-7,10-8的稀釋度。按稀釋度從低到高的順序依次腹節(jié)肌肉注射各組螯蝦，每尾100 μ 1，同時設(shè)置注射TN buffer的為對照組，方法和劑量都和病毒注射組相同。每組螯蝦在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)，并每天記錄死亡情況。最后選用能使螯蝦的累計死亡率能達(dá)到99%的最低稀釋度的病毒液作為實驗用病毒液，結(jié)果表明，應(yīng)該選用10-6的稀釋度的病毒液來進(jìn)行實驗。螯蝦累計死亡率統(tǒng)計如圖7。6. WSSV病毒攻擊選取能使螯蝦死亡率達(dá)到99. 9%的最低稀釋度的WSSV病毒來進(jìn)行病毒攻擊。將螯蝦總共分為6個組，每組30尾，每組分裝為兩盒來飼養(yǎng)。準(zhǔn)備六組要注射的樣品，分別是 TNbuffer,等體積混合的WSSV和TN buffer,等體積混合的BSA和WSSV (含終濃度IOmM的 Ca2+)，等體積混合BSA和WSSV (不含Ca2+)，等體積混合的MClec和WSSV (含終濃度IOmM的 Ca2+)，等體積混合的MClec和WSSV (不含Ca2+)，其中BSA和mClec的終濃度均為100 μ g/ ml。將充分混勻的樣品放到4°C溫育20min，然后分別注射各組螯蝦，每只ΙΟΟμΙ。螯蝦放到25°C環(huán)境下培養(yǎng)，每天早晚換水并投喂飼料一次并記錄螯蝦死亡情況。螯蝦累計死亡率統(tǒng)計數(shù)據(jù)如圖8。圖8顯示的是病毒攻擊螯蝦后，各組實驗螯蝦的死亡情況。由此圖可知，加 BSA與WSSV孵育時，不管有沒有鈣離子的存在，BSA對WSSV的相對保護(hù)性都為0。而mClec 與WSSV孵育時，鈣離子的存在對其影響比較重要。其中有鈣離子存在時mCmClec對WSSV 的保護(hù)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沒有鈣離子存在時mClec對WSSV的保護(hù)率。當(dāng)有鈣離子存在時，MClec 對WSSV的相對保護(hù)率達(dá)到了 60%。
權(quán)利要求
1.一種分離的克氏原螯蝦C-型凝集素基因，其序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白，其序列為SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因的制備方法，其步驟是A、總RNA的提取取克氏原螯蝦肝胰腺lOOug，加入ImlTRIzol Reagent RNA提取試劑，用研磨棒研磨；B、cDNA第一鏈的合成取步驟(A)中的總RNA5ug，以Iul Oligo (dT)2(1為引物，2ul dNTP，4ul 5 X RT buffer, Iul Rnase Inhibitor, Iul ReverTraAce 反轉(zhuǎn)錄酶，加 ddH20至終體積為 20ul，反轉(zhuǎn)錄程序為 42°C 60min,99°C 5min,4°C 5min，得到 cDNA;C-型凝集素基因部分核苷酸序列的獲得設(shè)計一對引物ClecF及ClecR，取步驟 (B)中的 cDNA 2ul，加入引物 ClecF 及 ClecR 各 lul，2ul dNTP，2ul MgS04，5ul 10XK0D buffer, Iul KOD-Plus，36ul ddH20，PCR程序為 94°C 5min ；94°C 30s，56°C 30s，68°C 30s, 30cycles ；68°C IOmin ；4°C 5min ；ClecF :5’ -GTTATTGACGACTCCACCTT-3’ 正向 ClecR :5’ -GTCTTCCCATTGACCCACTT-3，反向；PCR產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物ClecF及ClecR進(jìn)行雙向測序，得到Pc-Clec基因部分核苷酸序列；C、3’-RACE :C-犁凝集素基因3’端核苷酸序列的獲得根據(jù)步驟(B)中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息設(shè)計二條特異性正向引物 Clec-3 :5’ -TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3’ Clec-n3 :5， -TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3，；3，-RACE-Ready cDNA 的獲得取步驟(A)中的總 RNA 3ug，以 3，-RACE CDS PrimerA3' 為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄所需其他試劑及反轉(zhuǎn)錄程序按SMART RACE cDNA Amplification Kit，得至Ij 3，-RACE-Ready cDNA ；3，-First round PCR :取 Iul 3，-RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Clec-3 及 IOXUPM 引物進(jìn)行 3，-First round PCR 擴(kuò)增，得到 3，-First round PCR 產(chǎn)物；3’ -NET PCR 取 Iul 3’ -First round PCR 產(chǎn)物為模板，用特異性引物 Clec_n3 與 NUP 弓I物進(jìn)行5，-NET-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C 2分鐘；94 V 30秒，60 V 30秒，68 V 30 秒，30cycles ；68°C 5 分鐘；25°C 5 分鐘，得到 3，-NETPCR 產(chǎn)物；3’端核苷酸序列的獲得將3’-NET-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物CleC-n3及NUP進(jìn)行雙向測序，獲得克氏原螯蝦C-犁凝集素基因的3’端序列；D、5’-RACE :C-犁凝集素基因5’端核苷酸序列的獲得根據(jù)步驟(C)中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息設(shè)計二條特異性反向引物 Clec-5 5' -GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3‘； Clec-n5 :5， -CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3，；`5，-RACE-Ready cDNA的獲得取步驟(A)中的肝胰腺總RNA 5ug，以 SMARTIIAOligonucleotide引物及5，-RACE CDS PrimerA引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄程序按 SMART RACEcDNA Amplification Kit 試劑盒進(jìn)行，得到 5，-RACE-Ready cDNA ；·5，-First round PCR 取 Iul 5，-RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Clec-5 及 10XUPM 引物進(jìn)行 5，-First round PCR 擴(kuò)增，得到 ·5，-First round PCR 產(chǎn)物；·5’ -NET PCR 取 Iul 5’ -First round PCR 產(chǎn)物為模板，用特異性引物 Clec_n5 與 NUP 弓I物進(jìn)行5，-NET-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C 2分鐘；94 V 30秒，60 V 30秒，68 V 30 秒，30cycles ；68°C 5 分鐘；25°C 5 分鐘，得到 5，-NET PCR 產(chǎn)物；·5’端核苷酸序列的獲得將5’-NET-PCR產(chǎn)物用TIANGEN Gel Extraction Kit純化后用引物CleC-n5及NUP進(jìn)行雙向測序，獲得克氏原螯蝦C-犁凝集素基因的5’端序列；E、C-型凝集素基因完整核苷酸序列的獲得將3’-RACE獲得的克氏原螯蝦C-犁凝集素的3’端序列及5’-RACE獲得的克氏原螯蝦C-犁凝集素的5’端序列用DNAssist Version 2. 0進(jìn)行拼接，得到完整的C-犁凝集素基因核苷酸序列；F、C-犁凝集素基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用生物學(xué)軟件對(E)中獲得的 C-犁凝集素基因核苷酸序列進(jìn)行ORF Finding分析，含有的完整ORF長為510bp，編碼169 個氨基酸的多肽，該多肽理論蛋白質(zhì)分子量為19KD。
4.一種能表達(dá)該克氏原螯蝦C-型凝集素的原核表達(dá)菌株，其特征在于，該菌株為重組菌株 Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a_mClec，CCTCC, NO :M2011205。
5.權(quán)利要求4所述的一種克氏原螯蝦C-型凝集素的原核表達(dá)菌株的制備方法，其步驟是(1)引物設(shè)計用生物學(xué)軟件SignalP獲得的C-型凝集素基因完整的開放閱讀框ORF所編碼的蛋白質(zhì)，克氏原螯蝦C-型凝集素所編碼的蛋白質(zhì)在其N端有一個長17個氨基酸的信號肽，根據(jù)克氏原螯蝦C-型凝集素基因的序列，設(shè)計引物擴(kuò)增其成熟肽核苷酸編碼序列 mClecF :5’ -ATAGCTAGCGATTCTCCAATAAACAAGGCCAGAT-3' mClecR :5’ -GCTGGATCCTAAAGTACTGTGTATTCACAAATGG-3> 將凝集素基因插入到pET28a(+)載體的Nhe I和BamH I位點之間；(2)基因擴(kuò)增、克隆與重組質(zhì)粒鑒定取 5，RACE 中的 5，-RACE-Ready cDNA Iul 為模板，加入引物 mClecF 及 mClecR 各 lul， 2ul dNTP，2ul MgS04，5ul 10XK0D buffer, lul KOD-Plus，37ul ddH20，PCR 程序為 94°C 5min ；94°C 30s,56°C 30s,68°C 30s,30cycles ；68°C IOmin ；4°C 5min ；PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測后用TIANGEN Gel Extraction Kit進(jìn)行回收、純化，再用 NheI和BamH I對純化的PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET28a(+)進(jìn)行雙酶切，電泳回收目的條帶， 用T4 1 i gase連接，轉(zhuǎn)化JMl09感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Kan瓊脂平板，PCR鑒定的陽性克隆提取質(zhì)粒用Nhe I和BamH I雙酶切及測序鑒定，為重組表達(dá)載體pET28a-mClec，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，PCR鑒定正確者即為基因工程表達(dá)菌株。
6.權(quán)利要求1或2所述的一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因在制備治療或預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖病害藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2所述的一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因在無動物飼料添加劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述的一種能表達(dá)該克氏原螯蝦C-型凝集素的原核表達(dá)菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4所述的一種能表達(dá)該克氏原螯蝦C-型凝集素的原核表達(dá)菌株在無動物飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因及制備方法和應(yīng)用，步驟是A、總RNA的提??；B、cDNA第一鏈的合成；C、部分核苷酸序列的獲得；D、3’-RACE3’端核苷酸序列的獲得；E、5’-RACE5’端核苷酸序列的獲得；F、基因完整核苷酸序列的獲得；G、C-型凝集素基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。從克氏原螯蝦中克隆到C-型凝集素基因。將該基因克隆入pET-28a載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出重組蛋白mClec，純化的mClec對多種細(xì)菌及兔紅細(xì)胞表現(xiàn)凝集作用。該蛋白mClec，或?qū)⒛鼗蚩寺≡吮磉_(dá)載體獲得的重組凝集素，可用于生產(chǎn)蝦類和魚類抗病毒、抗細(xì)菌藥物。
文檔編號A61K48/00GK102321628SQ20111021793
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者孟小林, 張清濤, 徐進(jìn)平, 王健 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司