專利名稱：一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯(lián)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種聯(lián)合疫苗及其制備方法，特別是涉及腸道病毒71型與甲型肝炎聯(lián)合疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來手足口病發(fā)病日益頻繁，患病病例及病死人數(shù)逐年上升，嚴(yán)重威脅著我國兒童與嬰幼兒的健康，給社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2008年5月我國將手足口病納入丙類傳染病管理。腸道病毒71型作為手足口病最主要的病原體，常常與手足口病大規(guī)模爆發(fā)流行、重癥和死亡病例相關(guān)。甲型肝炎是一種主要的強傳染性的腸道傳染病，發(fā)病率高，流行面廣，是我國法定管理的乙類傳染病。為有效控制疾病的流行，研究開發(fā)用于預(yù)防上述兩種類腸道病毒引起的疾病的疫苗具有重大意義。腸道病毒71型(EV71)和甲型肝炎病毒(HAV)均是通過糞-口途徑傳播的小RNA 病毒科病毒，分別屬于腸道病毒屬和嗜肝病毒屬，人類是它們唯一的自然宿主。腸道病毒71型手足口病(HFMD)是由多種腸道病毒引起的全球性常見傳染病。 1958年首次報道了發(fā)生于新西蘭的病例，同年分離出主要病原CA16，1969年首次確認(rèn)另一個重要病原體EV71，之后EV71與CA16交替出現(xiàn)，成為HFMD的主要病原體。HFMD的病原還包括其他多種腸道病毒。近年來EV71感染在我國大陸呈現(xiàn)上升趨勢，分離的EV71毒株皆屬C4基因亞型。疾病感染手足口病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及皰疹性咽峽炎是EV71感染引起的常見臨床癥狀，但在EV71流行過程中的表現(xiàn)差異很大。20世紀(jì)70年代歐洲爆發(fā)的EV71中患者癥狀主要表現(xiàn)為腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，HFMD癥狀很少見；而同期日本流行的EV71主要表現(xiàn)為HFMD癥狀。在1998年臺灣地區(qū)EV71流行中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染者中有80%同時患HFMD，而同期澳大利亞的這個比例只有7%。急性咽峽炎在中國香港地區(qū)、日本和中國臺灣地區(qū)的EV71流行中都曾有報道。EV71引起的神經(jīng)源性肺水腫主要分布于亞太地區(qū)EV71 流行的大量病例中。發(fā)熱和急性呼吸道疾病是幼兒EV71感染的又一常見臨床癥狀，在澳大利亞、加拿大和1998年中國臺灣的EV71流行中都有報道。流行病學(xué)(1)全球概況1975年，保加利亞發(fā)生EV71大流行，共有705名患兒受到感染，死亡44例，93 %的重癥病例和83. 8 %的死亡病例發(fā)生在5歲以下人群。1978年匈牙利發(fā)生EV71疫情，出現(xiàn)擬6例無菌性腦膜炎和7M例腦炎病例，死亡45例。1972-1999 年日本、澳大利亞與馬來西亞均發(fā)生多次EV71大流行。2003-2007年越南爆發(fā)三次大規(guī)模 EV71疫情。近30多年間世界發(fā)生的HFMD大流行都是由EV71感染引起的，EV71已成為全球范圍內(nèi)最重要的中樞神經(jīng)毒性病毒病原。(2)中國大陸概況我國常見的HFMD發(fā)病形式有流行和散發(fā)兩種。1987年在湖北省HFMD流行期間首次發(fā)現(xiàn)EV71感染。1995年武漢病毒研究所從HFMD病人中分離出EV71。1998與2000年臺灣地區(qū)和山東省招遠(yuǎn)市先后暴發(fā) EV71感染引起的HFMD。2002年4_6月上海市發(fā)生HFMD。2004年3_7月深圳市發(fā)生HFMD 聚集性病例10起。2006年我國報告HFMD病例13，637例，死亡6例。2007年報告83，344
3例，死亡17例；2008年HFMD居全國報告的丙類傳染病發(fā)病數(shù)第二位，死亡數(shù)的首位，報告病例489，073例，重癥1，165例，死亡1 例，重癥與死亡病例中EV71感染率分別為81. 59% 與96. 43%。截至2009年9月底，全國累計報告HFMD例970，477例，重癥12,861例，死亡 317 例。甲型肝炎甲型肝炎是由HAV引起的肝臟急性，發(fā)病率與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平密切相關(guān)，不同地區(qū)人群抗HAV抗體陽性率不同(15%-100%)。估計每年有150萬甲型肝炎臨床病例發(fā)生。HAV感染后可誘導(dǎo)產(chǎn)生終生免疫。在低度流行區(qū)甲型肝炎通常會在高危人群中以單個病例形式出現(xiàn)或呈小規(guī)模爆發(fā)，在高度流行區(qū)多數(shù)人在兒童期已獲得隱性感染而臨床病例較少見。在中、低度流行國家成人病例更為常見。疾病感染HAV本身不導(dǎo)致細(xì)胞病變，肝細(xì)胞損害是由白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所致。急性甲型肝炎與其他類型的急性病毒性肝炎難以區(qū)分，典型癥狀包括發(fā)熱、不適、厭食、嘔吐和腹部不適，隨后出現(xiàn)尿色加深和黃疸。約有0.01%的臨床病例會出現(xiàn)爆發(fā)性肝炎，病死率很高。HAV引起的急性肝炎并發(fā)癥較少，引起的肝外并發(fā)癥較多。HAV不會引起慢性感染，目前無特異性抗病毒治療方法。甲型肝炎的病死率為0. 015%，感染臨床表現(xiàn)與患病年齡有關(guān)，5歲以內(nèi)幼兒90%以上不出現(xiàn)明顯癥狀；15歲左右的青少年約有25%有癥狀；成年人則90%以上癥狀和體征明顯。大年齡組人群疾病嚴(yán)重程度增加、死亡率增高。流行病學(xué)(1)全球概況人體感染HAV后出現(xiàn)抗HAV抗體，血清抗體陽性率可作為人群的病毒傳播標(biāo)志。北歐血清抗體陽性率最低約15%，歐洲其他地區(qū)、澳大利亞、日本和美國，40%-70%的成人血清抗體陽性。發(fā)展中國家所有成人幾乎都有既往感染的血清學(xué)證據(jù)。( 中國大陸概況中國是甲型肝炎的高發(fā)區(qū)，城市人群感染率>80%，農(nóng)村人口感染率> 90%。1990 2009年全國甲型肝炎發(fā)病總體呈逐年下降趨勢，發(fā)病數(shù)由584,353 例下降至43，841例；發(fā)病率由52. 58/10萬下降至3. 28/10萬。我國全年均有甲型肝炎發(fā)病，呈現(xiàn)春季高發(fā)現(xiàn)象，但發(fā)病流行高峰不明顯。發(fā)病年齡主要集中在青壯年和兒童中，男性發(fā)病多于女性。2004年爆發(fā)沈起，2005年爆發(fā)33起，2006年爆發(fā)43起，發(fā)病數(shù)依次為 2，291 例、2，061 例和 1，808 例。甲型肝炎疫苗已經(jīng)上市多年，我公司生產(chǎn)的腸道病毒71型滅活疫苗業(yè)已獲準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種EV71與HAV聯(lián)合疫苗及其制備方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種EV71與HAV聯(lián)合疫苗，其包含滅活 EV71以及滅活HAV。在另一個實施方案中，還包括鋁佐劑。其中所述的滅活EV71抗原含量為25 1600U/ml(EV71抗原含量檢測用EV71抗原參比品可購自中國食品藥品檢定研究院)；滅活HAV抗原含量的半數(shù)有效量(指引起50% 實驗對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時的藥量，ED50)為不高于125u，優(yōu)選為25 2000u/ml。優(yōu)選的滅活EV71抗原含量為50 800U/ml，滅活HAV抗原含量為100 1000u/ml。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的鋁佐劑優(yōu)選為氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。聯(lián)合疫苗中鋁含量終濃度為0. 125 2. Omg/ml，優(yōu)選的鋁含量終濃度為0. 25 1. Omg/ml。本發(fā)明所用的鋁佐劑，可以市售獲得也可以采用已知方法進(jìn)行制備，該佐劑為本領(lǐng)域技術(shù)人
4員所熟知，易于獲得和制備。本發(fā)明中，所述滅活EV71毒株可選用本領(lǐng)域公知的任何適用于本發(fā)明的EV71病毒的基因型，優(yōu)選為A、B、C基因型，病毒培養(yǎng)用細(xì)胞為Vero細(xì)胞或者2BS細(xì)胞；滅活HAV毒株可選用本領(lǐng)域公知的任何適用于本發(fā)明的HAV疫苗株，優(yōu)選為TZ84株、YN5株、HMl75株和呂8株，培養(yǎng)用細(xì)胞為Vero細(xì)胞或2BS細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目的在于提供所述聯(lián)合疫苗的制備方法，其包括將滅活EV71和滅活HAV分別吸附于鋁佐劑，將上述兩種滅活病毒的吸附產(chǎn)物混合制得EV71與HAV聯(lián)合疫苗；或者將滅活EV71與滅活HAV混合后再與鋁佐劑進(jìn)行吸附；或者先將滅活EV71與鋁佐劑進(jìn)行吸附以后再加入滅活HAV進(jìn)行吸附；或者先將滅活HAV與鋁佐劑進(jìn)行吸附以后再加入滅活EV71進(jìn)行吸附。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明的疫苗可以同時預(yù)防由EV71引起的手足口病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及皰疹性咽峽炎、神經(jīng)源性肺水腫和急性呼吸道疾病及HAV引起的甲型肝炎。動物實驗表明，聯(lián)合疫苗中EV71的免疫原性高于EV71滅活疫苗的免疫原性。EV71與HAV病毒均為單鏈小RNA 病毒，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定易發(fā)生變異，一般RNA病毒變異速度比DNA病毒快一到兩個數(shù)量級；由于滅活疫苗的安全性較高，因此采用EV71、HAV病毒分別培養(yǎng)、滅活后制備滅活疫苗優(yōu)于減毒疫苗。EV71與HAV滅活病毒的病毒外殼完整，構(gòu)象保持較好，可以使機體產(chǎn)生較高的免疫原性誘導(dǎo)出特異性中和抗體，EV71與HAV滅活病毒制備聯(lián)合疫苗優(yōu)于重組病毒。EV71病毒為腸道病毒71型，HAV為腸道病毒72型，由兩種腸道病毒制備的聯(lián)合疫苗具有腸道病毒類疾病更大的保護(hù)范圍；同時由于兩種病毒均采用接種細(xì)胞后培養(yǎng)純化的方式制備，具有相似的生產(chǎn)工藝便于工業(yè)生產(chǎn)，同時由于均是滅活病毒，聯(lián)合疫苗具有更高的安全性。含有兩種及以上的抗原，可以同時預(yù)防兩種及以上疾病的聯(lián)合疫苗以其方便多效、成本低成為新一代疫苗研制的熱點，與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，減少生產(chǎn)運輸儲存和銷售冷鏈運作的運輸與保存成本，具有顯著的優(yōu)越性。本發(fā)明的聯(lián)合疫苗使用了經(jīng)充分證明具有良好安全性及免疫原性的HAV滅活疫苗，可大大減低疫苗的生產(chǎn)成本和市場價格。同時該聯(lián)合疫苗吸附完全，理化性質(zhì)穩(wěn)定，相互干擾作用。動物實驗表明，根據(jù)本發(fā)明EV71與HAV聯(lián)合疫苗的優(yōu)選實施方案制備的EV71與 HAV聯(lián)合疫苗可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對EV71和HAV的高滴度、特異性抗體，體外實驗證實該聯(lián)合疫苗所誘導(dǎo)的抗體具有明顯的反應(yīng)性與中和活性；特別的聯(lián)合疫苗中EV71的與免疫效果不受另一組分的影響與干擾，吸附率大于95%，免疫原性不劣效于EV71滅活疫苗和 HAV滅活疫苗的兩種單價疫苗。本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗具有與兩種單價疫苗相同的免疫原性。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1 滅活EV71原液的制備培養(yǎng)待接種Vero細(xì)胞至長成致密的單層后進(jìn)行細(xì)胞消化，1 8稀釋傳代培養(yǎng)至長成單層后接種病毒，EV71滅活疫苗病毒種子按照1 102CCID5(l/ml接種于長好的Vero細(xì)胞，于33士 1°C培養(yǎng)15天，根據(jù)細(xì)胞病變情況收獲培養(yǎng)后的細(xì)胞病毒上清得到EV71病毒收獲液。收獲液采用終濃度不超過250 μ g/ml的甲醛滅活不低于6天，然后通過超濾與柱層析等純化方式進(jìn)行純化，合并層析純化液超濾濃縮后除菌過濾，得到滅活EV71原液。實施例2 滅活HAV原液的制備采用含有新生牛血清的fegle’ s MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2BS細(xì)胞，細(xì)胞長好后經(jīng)過細(xì)胞消化與稀釋傳代培養(yǎng)后，接種0. 05 1. OMOI的TZ84株、YN5株、HM175株和呂8株的HAV 培養(yǎng)，培養(yǎng)期間根據(jù)細(xì)胞生長情況換維持液，維持液為含有新生牛血清的fegle’ s MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)至病毒增殖高峰期后，采用胰蛋白酶或其他適宜方法消化含有HAV的細(xì)胞，經(jīng)過離心或者過濾的方法收集病毒收獲液。采用超濾法濃縮病毒，再用色譜層析法純化病毒；除菌過濾后用終濃度不超過250 μ g/ml的甲醛于37士 1°C滅活12天，滅活后的病毒液為滅活 HAV原液。實施例3 :EV71與HAV聯(lián)合疫苗制備吸附方式1 將稀釋后的滅活HAV和稀釋后滅活EV71分別用鋁佐劑吸附后，混合兩種滅活病毒的吸附產(chǎn)物，制成EV71與HAV聯(lián)合疫苗。吸附方式2 將稀釋后的滅活HAV先用鋁佐劑吸附后，再加入稀釋后的滅活EV71 進(jìn)行吸附，制成EV71與HAV聯(lián)合疫苗。吸附方式3 將稀釋后滅活EV71先用鋁佐劑吸附，再加入稀釋后滅活HAV進(jìn)行吸附，制成EV71與HAV聯(lián)合疫苗。吸附方式4 將稀釋后的滅活HAV與稀釋后滅活EV71先混合，然后將混合液加入鋁佐劑進(jìn)行吸附，制成EV71與HAV聯(lián)合疫苗。其中EV71抗原含量為400U/ml、200U/ml、 100U/ml, HAV抗原含量為500u/ml ；鋁佐劑終濃度為0. 4mg/mL·檢測四種吸附方式制備的EV71與HAV聯(lián)合疫苗的吸附完全性、解離抗原以及體內(nèi)效力。EV71與HAV抗原吸附效果與解離抗原分別采用EV71與HAV抗原雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測，檢測靈敏度分別為5U/ml、15. 6u/ml ；EV71體內(nèi)效力試驗將聯(lián)合疫苗采用0、14天兩針腹腔免疫ICR小鼠，第觀天采血，以細(xì)胞病變法檢測血清中抗EV71中和抗體滴度。HAV 體內(nèi)效力試驗將聯(lián)合疫苗1 8、1 32、1 1 稀釋后Iml/只腹腔免疫ICR小鼠，第觀天采血，用甲肝抗體測定試劑盒檢測抗HAV抗體效價，根據(jù)抗體陽轉(zhuǎn)率計算ED5tlt5結(jié)果見下表?？乖酵耆耘cED5(1、EV71解離抗原回收率計算方法如下吸附完全性
(HAV I EV-1 匕:+f ？.兮 *
(HAV iz EVl)土- ^ ii理」 歹I.疫苗的吸附完全性反應(yīng)疫苗中沒有被鋁佐劑捕獲的游離的抗原含量占疫苗中總的理論抗原含量的比值，結(jié)果越高顯示疫苗的吸附效果越好。ED50 :50%陽轉(zhuǎn)終點對數(shù)=高于50%陽轉(zhuǎn)率稀釋對數(shù)+距離比例X稀釋對數(shù)的因數(shù)ED50 =疫苗單位劑量/50%陽轉(zhuǎn)終點疫苗稀釋度(陽轉(zhuǎn)終點反對數(shù))
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于，包括滅活腸道病毒71型病毒和滅活甲型肝炎病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，還包括鋁佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述的鋁佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述的腸道病毒71型滅活病毒的抗原含量為25 1600U/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述的滅活腸道病毒71型病毒為腸道病毒71型病毒A、B或C基因型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述的滅活甲型肝炎病毒的抗原含量為25 2000u/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述的滅活甲型肝炎病毒選自甲型肝炎病毒TZ84株、YN5株、HM175株和呂8株。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述的鋁佐劑的鋁含量為終濃度 0. 125 2. Omg/ml ；優(yōu)選的鋁含量終濃度為0. 25 1. Omg/ml。
9.權(quán)利要求1 8任一項所述的聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于將腸道病毒71 型滅活病毒與甲型肝炎滅活病毒分別吸附于鋁佐劑，制備病毒鋁吸附產(chǎn)物，然后將鋁吸附產(chǎn)物混合制備聯(lián)合疫苗；或者將腸道病毒71型滅活病毒與甲型肝炎滅活病毒混合后再與鋁佐劑進(jìn)行吸附；或者先將腸道病毒71型滅活病毒與鋁佐劑進(jìn)行吸附以后再加入甲型肝炎滅活病毒進(jìn)行吸附；或者先將甲型肝炎滅活病毒與鋁佐劑進(jìn)行吸附以后再加入腸道病毒 71型滅活病毒進(jìn)行吸附。
10.權(quán)利要求1 8任一項所述的聯(lián)合疫苗在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型病毒和甲型肝炎病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型與甲型肝炎聯(lián)合疫苗，包括腸道病毒71型滅活病毒以及甲型肝炎滅活病毒，還包括鋁佐劑。本發(fā)明還提供制備所述腸道病毒71型與甲型肝炎聯(lián)合疫苗的方法，該方法無需添加明膠等保護(hù)劑，無需進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，所制得的疫苗吸附效果與穩(wěn)定性均較好。接種本疫苗后，甲肝病毒對腸道病毒71型有佐劑效果，腸道病毒71型的免疫原性得到增強，免疫效果達(dá)到或超過單價疫苗的免疫效果。本疫苗具有腸道病毒71型與甲型肝炎的雙重免疫性與保護(hù)性能，接種本疫苗可以減少接種針次，簡化免疫程序，同時有效預(yù)防人及動物由腸道病毒71型和甲型肝炎病毒引起的疾病。
文檔編號A61K39/295GK102210858SQ20111012907
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者尹衛(wèi)東, 蔡芳, 薛晨寶, 高強 申請人:北京科興生物制品有限公司