專利名稱：腫瘤液化的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療疾病的免疫治療方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于導致腫瘤液態(tài)化的治療疾病的藥物和方法。
背景技術：
所知的最精確、最強大和最安全的疾病預防和治療機制，是在沒有醫(yī)療介入的情況下，結合先天免疫元素和適應性免疫元素的與生俱來的“滅菌式(sterilizing) ”免疫應答以清除身體內種類繁多的外源性病原體。免疫系統(tǒng)被設計為“記憶”清除過的外源性抗原以便對再次感染快速發(fā)動免疫應答。即使癌癥患者的免疫系統(tǒng)，也可以識別外源性抗原(例如在病毒和細菌中發(fā)現(xiàn)的外源性抗原)并對其發(fā)動應答，足以從身體中徹底破壞和消 除這些外源性抗原。這種滅菌式免疫應答的猛烈性和特異性可以被以下方式證明，未充分抑制的免疫系統(tǒng)可以在保留自身組織的同時完全破壞大的移植器官如腎、肝或心臟。這種針對外源性抗原的免疫力的破壞效果將有益于癌癥治療，如果這種效果可以被再定向到腫瘤。免疫療法致力于發(fā)展針對疾病特別是癌癥利用、引導和控制免疫應答的方法。治療癌癥的疫苗是一種旨在用現(xiàn)有癌癥訓練患者的免疫系統(tǒng)，將其腫瘤細胞識別為外源性抗原的免疫療法。如果腫瘤被免疫系統(tǒng)識別為外源性病原體，則理論上免疫應答可以被引發(fā)，該免疫應答可能導致免疫細胞破壞大的腫瘤、找出并破壞轉移性腫瘤細胞，無論它們位于體內何處。成功的免疫治療后，免疫系統(tǒng)的“記憶”清除過的外源性細胞的能力，使免疫系統(tǒng)在沒有任何額外治療下可以消除任何復發(fā)的癌細胞，很像免疫系統(tǒng)防止機會性感染。治療癌癥的免疫治療方法是目前癌癥治療策略的非常理想的替代療法。與免疫介導的抗腫瘤機制不同，目前手術、放療和化療的方式在單細胞水平上不具有抗腫瘤特異性。因此，對于這些現(xiàn)有方式，清除所有腫瘤細胞在技術上是不可行的。如果沒有清除所有腫瘤細胞，則治療后癌癥復發(fā)是一種普遍的結果。此外，目前的方式會導致對治療的腫瘤抗性而不是腫瘤消除的“記憶”。許多癌癥疫苗領域的研究按照傳統(tǒng)疫苗開發(fā)策略，重點研究尋找獨特的腫瘤抗原(正常細胞沒有)，稱為腫瘤特異性抗原(TSA)，或尋找癌細胞上過度表達的腫瘤相關抗原(TAA)。TAA是自身性抗原，因此不能將腫瘤識別為外源性的，而是實現(xiàn)了腫瘤細胞和正常細胞的免疫性區(qū)別。含有TAA的癌癥疫苗也會采用增強這些抗原的能力以刺激抗腫瘤免疫反應的方法。癌癥疫苗的發(fā)展已經(jīng)沿著一條途徑尋求方法以增強這些TAA的免疫原性，從而它們可以被用于刺激治療性免疫力。例如，與免疫性佐劑混合(如MF59，不完全Freund’s佐劑，QS-21皂甙，和芽孢桿菌卡介苗[卡介苗])、更具免疫原性衍生物的合成、與免疫源性蛋白綴合和對樹突細胞直接脈沖等方法均已被研究開發(fā)，但沒有顯著的成功。免疫療法的成功率在臨床仍然低得可憐。盡管目前的免疫治療方法幾乎完全沒有引起臨床上顯著的抗腫瘤應答，許多使用這些方法的臨床試驗目前仍然正在被工業(yè)界和學術界的贊助商進行。這些免疫療法在臨床上持續(xù)發(fā)展的原因之一，可能是因為對目前提供給晚期癌癥患者高發(fā)病率治療的替代療法的需求。盡管免疫療法尚未顯示具有令人印象深刻的臨床療效，但是它已經(jīng)被證實是一種低毒性的方法。另一方面，盡管在過去20年對高毒性化學療法的應答率一直在升高，但對總體5年存活率的影響幾乎沒有?；瘜W療法顯示出的對存活率的輕微增長在生活質量方面付出了嚴重代價。

發(fā)明內容
一種治療組合物包括至少一種外源性抗原，至少一種I型炎癥細胞因子和至少一種能夠引致樹突細胞成熟化的效應分子。還公開了一種將腫瘤轉化為液體狀態(tài)的方法。該方法包括利用包含外源性抗原的治療組合物進行預致敏(priming)，以便建立針對外源性抗原的Thl免疫力，消融選定的腫瘤或復數(shù)個腫瘤，其中所述消融導致所述腫瘤的至少一部分死亡。
還公開了一種方法，該方法包括在鄰近所述死亡腫瘤病變處建立炎癥微環(huán)境，并激活適應性和先天免疫細胞。公開了一種刺激和維持患者中Thl應答的方法，該方法包括，利用治療組合物對患者進行預致敏，以及對患者周期性給藥該治療組合物，其中，治療組合物包含至少一種外源性抗原，至少一種能夠引致樹突細胞成熟化的效應分子和至少一種Thl細胞因子。還描述了另外一種方法用于液化患者腫瘤，該方法包括，利用治療組合物對患者進行預致敏，使用導致腫瘤壞死的方法消融腫瘤，瘤內給藥所述治療組合物，以及輸注該治療組合物以激活適應性和先天免疫細胞，其中所述治療組合物包含至少一種外源性抗原、至少一種能夠引致樹突細胞成熟化的效應分子和至少一種Thl細胞因子。另一種液化患者腫瘤的方法包括，在患者中建立從頭Thl應答，同時抑制Th2應答；提供由癌細胞壞死性死亡所產(chǎn)生的腫瘤抗原的來源；提供與Thl應答相一致的炎癥環(huán)境，用于響應所述腫瘤抗原的樹突細胞的成熟化；以及通過維持Thl應答使腫瘤免疫逃逸機制無效。


圖I包含了幾個CT掃描的圖像；圖2是一個說明活檢結果的圖像。
具體實施例方式本發(fā)明描述了用于治療癌癥患者的治療組合物和方法。本發(fā)明描述了適當對癌癥患者給藥，其可以實現(xiàn)系統(tǒng)性液化腫瘤的治療藥劑。該組合物一般包括以下主要成分
(I)外源性抗原，(2) I型細胞因子，和(3)能夠引致樹突細胞(DC)成熟化的效應分子，優(yōu)選CD40L。本發(fā)明還描述了液化腫瘤的方法，其通過刺激腫瘤患者有效Thl免疫應答，用原位疫苗的方法產(chǎn)生抗腫瘤免疫力,進而激活患者先天和適應性免疫力同時使腫瘤免疫逃逸機制無效。該方法還包括抑制Th2應答，通?？梢杂纱碳hl免疫應答來完成。該方法進一步包括通過Treg細胞實現(xiàn)免疫抑制機制的反向調節(jié)。腫瘤的“液化(liquidation) ”是指腫瘤減小或完全缺乏血液供給，同時CT掃描顯示病灶為密度低或黑暗，相比于治療前基線和活檢樣品顯示凝固性壞死的證據(jù)。此處描述涉及“治療組合物”、“藥劑”和“藥物”。這些術語可以互換使用，并且是指可以對患者給藥的組合物。該治療組合物一般包括外源性抗原。該外源性抗原可以是任何非自身性抗原，例如同種異體抗原。該外源性抗原必須以這樣的方式提供，通過該方式該抗原可被專職抗原提呈細胞吞噬并被提呈給免疫系統(tǒng)從而被處理和提呈給T細胞。該抗原可以是活細胞的天然部分，也可以是利用分子生物學技術改變的或生物工程改造的。該抗原可以是可溶性的或者被固定表面上，活的有機體或細胞的完整部分，或減毒(attenuated)生物體的一部分。 多種細胞因子也可以被包含在治療組合物中。術語細胞因子被用作不同群體可溶性蛋白和多肽的通用名稱，這些蛋白和多肽通常以納摩到皮摩濃度在正常或病理條件下作為調節(jié)因子調控單個細胞和組織的功能活動。這些蛋白也直接介導細胞間相互作用并調節(jié)發(fā)生在細胞外微環(huán)境中的進程。I型細胞因子參與炎癥應答，II型細胞因子參與體液免疫應答。I 型細胞因子包括，例如，11-2、11^-12、11^-15、正^￥、1,-0 ,TNF-β、GM_CSF 和 C-C趨化因子。細胞因子成分可以是天然的或重組的細胞因子，或者可以是設計為與細胞因子的受體相互作用的生物工程分子(bioengineered molecular)。該細胞因子可以直接包含在治療組合物中?？蛇x地，該治療組合物可以包含活細胞或其他可以產(chǎn)生和分泌細胞因子的成分。在一些示例性的實施例中，該治療組合物包括產(chǎn)生和分泌細胞因子、處于激活狀態(tài)的T細胞,從而作為該治療組合物中細胞因子的來源。該治療組合物還包括引起非成熟樹突細胞成熟化的因子。樹突細胞免疫調節(jié)能力依賴于樹突細胞的成熟化。抗原攝取和加工樹突細胞后多種因子可誘導成熟化，包括整個細菌或細菌產(chǎn)生的抗原(如脂多糖，LPS);炎癥細胞因子，如正^￥、1即-(!、1卜1、61 ^、選擇性細胞表面受體(如CD40)的配體(ligation)和病毒性產(chǎn)物(如雙鏈RNA)。在他們從非成熟細胞轉變?yōu)槌墒旒毎倪^程中，樹突細胞經(jīng)歷了一系列表型和功能的變化。樹突細胞的成熟化過程大體上涉及主要組織相容性復合體(MHC)分子從細胞胞內腔室到樹突細胞表面的重新分布，下調抗原的內在化，在表面共刺激分子表達的增加，形態(tài)變化(如樹突的形成)，細胞骨架的重構，趨化因子、細胞因子和蛋白酶的分泌，以及粘附分子和趨化因子受體的表面表達。在一些優(yōu)選的實施例中，CD40L是被包括在作為表示樹突細胞成熟的一個因子。在另一些實施例中，引致樹突細胞成熟化的物質通過Toll樣受體(TLRs)提供信號。Toll樣受體表達在主要參與先天免疫的巨噬細胞和樹突細胞上。目前，已經(jīng)鑒定了 Toll樣受體的多種配體，例如TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6和TLR9。這些配體大部分來源于病原體，而不是在宿主中被發(fā)現(xiàn)，這暗示Toll樣受體對檢測入侵的微生物至關重要。由Toll樣受體識別病原體，通過誘導促炎性因子產(chǎn)生和共刺激分子上調的方式，引發(fā)先天免疫力的快速激活。被激活的先天免疫力隨后導致有效的適應性免疫力。實例包括包含脂蛋白和肽聚糖的TLR2配體，和分別識別雙鏈RNA、脂多糖、細菌鞭毛蛋白、咪喹莫特(imiquimod)和細菌DNA的TLR-3、_4、-5、_7和-9配體。導致樹突細胞成熟化的這些以及其他因子都在本方法的范疇中。本發(fā)明所述的組合物一般包括以上描述的三類主要組分。這些組分，外源性抗原、Thl細胞因子和樹突細胞成熟化分子可以是組合在一起共同構成組合物?？蛇x地，部分或所有這些組分可以由活細胞產(chǎn)生，可以在配制之前，也可以在配制之后，因此可以作為細胞因子和/或效應分子的來源。在一個示例性的實施例中，該治療組合物包括表達于T細胞上的同種異體抗原。該T細胞優(yōu)選為CD4+T細胞，更優(yōu)選為Thl細胞。該Thl細胞可以是由來源于正常血液供體的初始CD4+前體細胞經(jīng)體外分化、擴增和激活而來。優(yōu)選地，在給藥綴合于微米珠或納米珠上的抗-⑶3和抗-⑶28單克隆抗體時，該細胞是處于激活狀態(tài)的。這些珠子可以是生物可降解的。這些細胞可以產(chǎn)生大量炎癥細胞因子，例如IFN-Y、TNF-α和GM-CSF，還可以在細胞表面表達效應分子，例如⑶40L，其用于促進產(chǎn)生Thl免疫力。該治療組合物包括被激活的同種異體Thl細胞。這些被激活的Thl細胞可以為強效炎性藥劑。這些被激活的同種異體Thl細胞和用于制備它們的方法被詳細描述于美國專利7，435，592,7, 678，572,7, 402，431和7，592，431中，通過參照將其并入本文。該被激活的同種異體Thl細胞是有意圖針對患者錯配的。腫瘤內給藥優(yōu)選的治療組合物可以為I型抗腫瘤免疫力的產(chǎn)生提供強效輔助作用，同時下調腫瘤免疫逃逸機制。該組合物的輔助作用是基于該細胞3個主要的特征(I)產(chǎn)生大量I型細胞因子的能力；(2)CD40L的表面表達；和(3)該細胞同種異體性質。外源性抗原，例如異種、同種異體或病毒抗原，也可以提供強效輔助作用。該組合物中的同種異體Thl細胞優(yōu)選地產(chǎn)生大量I型細胞因子IFN-Y、rNF-α和GM-CSF。Y干擾素為對促進I型抗腫瘤免疫力必不可少的一個關鍵I型細胞因子。Y干擾素可以通過直接抑制腫瘤細胞生長或誘導T細胞介導的抗腫瘤應答而介導抗腫瘤作用。Y干擾素的分泌可以獨立地促進NK細胞應答，還可以增強IL-12激活的NK細胞應答。腫瘤壞死因子-α的重要性可以通過單獨輸注這種細胞因子已足夠治愈某些已經(jīng)建立的動物腫瘤的證據(jù)而被證明。腫瘤壞死因子-α是I型細胞因子和配體家族中的一部分，可以通過誘導凋亡有效地破壞癌癥細胞。Y干擾素和腫瘤壞死因子-α不僅對抗腫瘤效應細胞具有輔助作用，也可以直接誘導腫瘤凋亡。GM-CSF的產(chǎn)生也可以提供強大的輔助作用。GM-CSF可以誘導人PBMC、T淋巴細胞和APC產(chǎn)生I型細胞因子。GM-CSF可以下調II型細胞因子的表達并可以促進單核細胞分化為樹突細胞，同時優(yōu)先擴增樹突細胞I (IL-12產(chǎn)生的樹突細胞)和激活NK活性。將藥劑與未成熟樹突細胞混合可以引起樹突細胞成熟，并產(chǎn)生IL-12。IL-12被稱為I型免疫應答的原發(fā)性啟動因子，并作為NK和Thl細胞產(chǎn)生IFN-Y的上游正調節(jié)因子。IL-12可以激活細胞毒性T細胞，引起⑶4+淋巴細胞分化成Thl表型，并在平衡I型和II型免疫應答中傾向于I型。IL-12在促進I型免疫活性方面具有強效輔助作用。一種包含被激活的同種異體的Thl細胞的藥劑可以來源于前體細胞，該前體細胞從正?；蚝Y選過的血液供體純化而來。細胞應以無菌、低內毒素的劑型提供，該劑型被制成適于皮下瘤內注射或者靜脈輸注。該細胞還可以制成適于腹腔、胸腔、結內、囊內或硬膜外的輸注。優(yōu)選地供體被測試為HIVl、HIV2、HTLVl、HTLV2、HBV、HCV和RPR(梅毒)為陰性，并且優(yōu)選地細胞被測試為支原體、EBV和CMV陰性。在優(yōu)選的實施例中，被激活的同種異體細胞為與患者HLA不匹配的。本發(fā)明的方法一般包括，以驅使患者的免疫系統(tǒng)做出應答并引起腫瘤液化的方式，給藥本發(fā)明的組合物。本文所述方法的第一步一般旨在增加癌癥患者中Thl免疫細胞的循環(huán)數(shù)量，將平衡從Th2環(huán)境轉移到Thl環(huán)境。第二步可以引起抗腫瘤特異性Thl免疫力，第三步可以激活先天和適應性免疫應答的組分并產(chǎn)生持續(xù)的Thl細胞因子環(huán)境從而下調腫瘤免疫逃逸。個體的免疫系統(tǒng)可以通過細胞因子的平衡而被評估，該細胞因子是應答疾病生物體而被產(chǎn)生的，可以是Thl應答或Th2應答。這種日益流行的分類方法被稱為Thl/Th2平衡。白介素和干擾素被稱為“細胞因子”，他們可以被分為由Thl型細胞分泌的細胞因子和由Th2型細胞分泌的細胞因子。Thl細胞促進細胞介導的免疫，而Th2細胞誘導體液免疫。細胞免疫(Thl)引導自然殺傷細胞(NK)、T-細胞和巨噬細胞在感染部位攻擊異常細胞和微生物。體液免疫(Th2)導致產(chǎn)生用于中和外源性入侵物的抗體。在一般情況下，CD4+T細胞的Th2極化已在大多數(shù)人類和動物癌癥研究中被證明是與癌癥進程相關的，而Thl極化與腫瘤消退和抗腫瘤免疫力相關。Thl細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-Y并介導I型免疫力，而Th2 細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10并介導II型免疫力。Thl和Th2免疫應答是反向調節(jié)的，因而增強I型應答會下調II型應答，增強II型應答會下調I型應答。這里所述的方法包括對患者進行預致敏，通過給藥包含外源性抗原的組合物以在患者中建立針對該外源性抗原的Thl免疫力。該方法進一步包括消融全部或者部分腫瘤，導致至少若干腫瘤壞死。多種方法可以用于在患者中產(chǎn)生腫瘤壞死，例如冷凍消融法、射頻消融法、化學療法、栓塞法和電穿孔法。該方法也涉及在鄰近腫瘤壞死的部位建立炎癥微環(huán)境，即腫瘤病變部位。此外，該方法包括激活患者的適應性和先天免疫細胞，從而維持長期Thl環(huán)境。在優(yōu)選實施例中，該方法的重要組成包括，使用含有以上所述的產(chǎn)生Thl細胞因子的被激活的同種異體免疫細胞的藥物或組合物。由于大多數(shù)人類癌癥患者可以呈現(xiàn)極化Th2免疫力，這種治療方法第一部分的目的是提高癌癥患者中循環(huán)Thl細胞的數(shù)量。癌癥患者中循環(huán)Thl細胞的數(shù)量可以通過利用包含外源性抗原的治療組合物給患者預致敏或接種疫苗而建立。該治療組合物還可以包括可以使患者在Thl環(huán)境中遇到外源性抗原的Thl細胞因子。在一個示例性的實施例中，利用皮下注射的被激活的同種異體Thl細胞，對患者進行預致敏。在優(yōu)選的實施例中，皮下注射為按周規(guī)劃每周I次，持續(xù)3周。然而，皮下注射也可以每隔兩天或數(shù)年給藥。該注射方案應該旨在增強循環(huán)中Thl記憶細胞的足跡。表達于外源性細胞上的同種異體抗原可以刺激強效免疫排斥應答。此外，組合物中存在Thl細胞因子或同種異體細胞表達的Thl細胞因子可以提供炎癥輔助環(huán)境，這種環(huán)境對于將針對同種異體抗原的免疫應答引導向Thl記憶免疫力是必要的。這可以建立循環(huán)中Thl記憶細胞的增強池(increased pool),所述Thl記憶細胞針對包含在同種異體Thl細胞中的同種異體抗原是特異性的。多次給藥可以作為加強注射，增加對于同種異體抗原特異性的循環(huán)記憶Thl細胞的數(shù)量。一般地，低劑量的I X IO6 2 X IO7個細胞為每次注射的優(yōu)選劑量，每次注射優(yōu)選間隔3 7天。為了進一步增加循環(huán)中Thl記憶細胞的效價，可以靜脈給藥一定劑量的被激活的同種異體細胞。在優(yōu)選實施例中，皮下給藥I 2 X IO7個細胞，一周I 3次，持續(xù)2 3周，然后靜脈輸注3 IOX IO7個細胞。本方法的下一步是訓練免疫系統(tǒng)識別腫瘤。
為了訓練由腫瘤構成的威脅的免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生可以引起腫瘤液化的抗腫瘤特異性免疫力，利用了原位疫苗的方法。這種策略可以通過給藥治療組合物和腫瘤消融方法的結合而施行，優(yōu)選地治療組合物包含同種異體細胞。本文所述方法中，腫瘤抗原的來源是通過消融選定腫瘤病變而原位產(chǎn)生的。任何至少部分通過壞死引起腫瘤死亡的消融方法都可以被應用。通過凋亡引起腫瘤死亡的方法也可以被應用，然而，這些方法不如壞死誘導的方法有效。腫瘤消融可以包括化學療法、射頻療法、冷凍消融法、射頻消融法、電穿孔法、酒精消融法、生物療法、抗血管生成療法、其他消融法或可以用于腫瘤消融的這些方法的組合。腫瘤細胞減少的化療方法也可以被應用。圖像引導下經(jīng)皮穿刺(透過皮膚)的冷凍消融或酒精消融(最好用于可觸及病變的消融)的微創(chuàng)技術可以被應用。適合消融的腫瘤病變可以位于，例如肝臟、皮膚、頭頸部、淋巴結、胰腺、骨、腎上腺、膀胱、胃腸道或腎臟，并將位于必要時使用CT或超聲波圖像的指導，可以安全經(jīng)皮進入的那些器官內的位置。
消融過程導致大量腫瘤碎片釋放進入腫瘤微環(huán)境，作為患者特異性腫瘤抗原的來源。正常地，機體內細胞通過自然過程死亡被稱為凋亡，作為細胞更替(turnover)的持續(xù)副產(chǎn)物。免疫系統(tǒng)被編程為對凋亡細胞沒有應答從而避免自身免疫。然而，作為消融結果的壞死性細胞死亡可以募集免疫細胞到腫瘤部位或細胞內部，從而對應答免疫細胞提供“吃我”的信號。但是，被激活的Thl細胞的強效輔助作用可以克服凋亡細胞死亡不刺激免疫應答的正常作用。出于這個原因，引起腫瘤細胞死亡的任何方法都可以被用于與優(yōu)選的被激活的同種異體Thl細胞組合物結合。通過被稱為專職抗原提呈細胞(APC)或樹突細胞(DC)的特化細胞網(wǎng)絡，抗原被提呈給免疫系統(tǒng)。DC負責通過提呈抗原給初始T細胞誘導真對病原體或腫瘤的免疫力，導致T細胞分化為針對該抗原特異性的效應T細胞和記憶性T細胞。效應T細胞，主要是CD8+細胞溶性T細胞(CTL)，能破壞表達抗原的細胞。記憶性T細胞提供免疫保護，防止復發(fā)或再感染。樹突細胞(DC)分化成強效專職抗原提呈細胞(APC)是由分子刺激觸發(fā)的，該刺激分子是作為組織干擾和局部炎癥應答的結果而釋放的。加工被包含在吞噬材料中的腫瘤抗原的樹突細胞(DC)，在炎癥危險信號的存在下(即在Thl條件下)可以被以這樣的方式程序性成熟，通過該方式可以促進Thl免疫力的產(chǎn)生，其中該Thl免疫力是針對所吞噬抗原特異性的。通過將由消融或化療方法引起的病理或天然腫瘤死亡與腫瘤內給藥治療組合物進行結合，可以建立用于Thl腫瘤特異性免疫力的條件，其中，優(yōu)選地治療組合物包含產(chǎn)生炎癥危險信號的被激活的同種異體Thl細胞。在體內炎癥危險信號存在下暴露腫瘤抗原的組合被稱為原位疫苗法。本發(fā)明還包括開發(fā)芯片或者晶片，其中，在這些芯片或者晶片上嵌入治療組合物的重要組分(a)外源性抗原；(b)能夠引致樹突細胞成熟化的分子；和(C)炎癥因子。例如，嵌入了同種異體抗原和CD40L的晶片，被植入了嵌入的或外源性細胞因子如GM-CSF和/或IFN- Y，也落入本發(fā)明的保護范圍內。吞噬腫瘤抗原的未成熟樹突細胞可以在炎癥信號的存在下加工腫瘤抗原，從而成熟、分化和遷移到引流區(qū)淋巴結，在那里樹突細胞將免疫T細胞引導為Thl免疫力，包括能夠特異性尋找出和破壞腫瘤的細胞溶性T細胞(CTL)，而無論腫瘤位于體內何處。為了使這個過程正確地發(fā)生，攝取腫瘤抗原的未成熟樹突細胞必須在高度炎癥環(huán)境中加工該抗原。對驅動樹突細胞成熟化從而引導Thl免疫力是必不可少的炎癥環(huán)境的類型不是自然發(fā)生，也不是作為僅消融過程的結果而發(fā)生，因此需要輔助。為了給驅動正確的樹突細胞成熟化提供輔助，治療組合物優(yōu)選地包括本文所述被激活的Thl細胞，其可以被給藥到所消融腫瘤病變的壞死中心，優(yōu)選地在消融過程后的I小時內。當注射附著CD3/CD28單克隆抗體包被的微珠時，同種異體免疫細胞可以被激活。這些免疫細胞產(chǎn)生大量炎癥因子，并且表達表面分子(例如⑶40L)，已知這些分子引起樹突細胞成熟化并促進產(chǎn)生Thl抗腫瘤免疫力。進一步，由于因先前皮下預致敏注射，患者將對同種異體抗原免疫，腫瘤內給藥可以引發(fā)強效Thl細胞記憶應答以排斥這些同種異體細胞。所有這些因素作為輔助，促進樹突細胞成熟化以引導得到抗腫瘤特異性的Thl免疫力。腫瘤內注射的時間可以為增強治療效果而被改變。如果在樹突細胞進入所消融的腫瘤病變的同時給藥細胞，則被激活的記憶同種異體Thl細胞的輔助作用是最佳的。由于已知樹突細胞進入損傷組織的波(wave)發(fā)生在消融事件后大約3天，因而優(yōu)選在消融過程后3天同種異體細胞被給藥?？梢栽谙跁r所進行的腫瘤內注射之外，進行該注射，也可以將該注射替代在消融時所進行的腫瘤內注射。 由于已知腫瘤能夠逃避Thl免疫應答，本方法一個附加的步驟旨在使這些腫瘤免疫逃逸機制失效。高度炎癥環(huán)境可以具有抑制腫瘤免疫逃逸和破壞對腫瘤抗原耐受性的作用，其與炎癥可以破壞對自身組織抗原耐受性并促進自身免疫的方式非常相似。為了建立和維持這個炎癥環(huán)境，可以給患者靜脈輸注包含本文所述被激活的同種異體Thl細胞的藥齊U。可選地，這種藥劑可以被動脈內給藥。優(yōu)選地，該被激活的同種異體Thi細胞可以與被用于初始預致敏患者的同種異體細胞來自于相同的供體。輸注該藥劑引起高度炎癥環(huán)境，因為患者的預致敏免疫系統(tǒng)被激活以排斥這些細胞。此外，排斥該同種異體細胞具有激活宿主先天免疫系統(tǒng)成分(例如NK細胞和巨噬細胞)的繼發(fā)性作用，從而啟動系統(tǒng)性腫瘤液化和消除以及抑制腫瘤逃避該免疫攻擊能力所必需的級聯(lián)免疫事件。這種排斥應答可以建立與在同種異體移植設置中所建立的GVHD環(huán)境相似的免疫環(huán)境。然而，根據(jù)本發(fā)明所述的方法該同種異體細胞的排斥是沒有毒性的。本文描述的方法包括給患者提供樹突細胞成熟化分子⑶40L(⑶154)。該⑶40L可以與組成型表達于宿主造血祖細胞、上皮和內皮細胞、所有專職抗原提呈細胞(APC)、樹突細胞(DC)、被激活的單核細胞、被激活的淋巴B細胞、卵泡樹突細胞和自然殺傷(NK)細胞上的⑶40相互反應。⑶40L是Thl應答的最強誘導劑之一，⑶40L的刺激終止Treg細胞的抑制作用。CD40L還激活先天NK細胞，并且是樹突細胞的最強效活化劑之一。樹突細胞CD40-CD40L的激活導致共刺激分子的成熟化和上調，并導致大量IL-12的產(chǎn)生，其具有強效的抗腫瘤和Thl轉向特性。CD40L也顯示通過抑制腫瘤生長和誘導廣泛的腫瘤死亡而具有直接抗腫瘤作用。⑶40L的激活還可以增強CTL介導的腫瘤裂解。該⑶40L可以獨立地對患者給藥或者作為治療組合物的一部分給藥。該CD40L可以由治療組合物被提供給患者，該治療組合物包括被激活的同種異體Thl細胞，因為⑶40L是通過被激活的同種異體Thl細胞而被上調的，其中Thl細胞是通過組合物中存在的抗-⑶3/抗-⑶28抗體交聯(lián)而被激活的。由組合物中同種異體Thl細胞產(chǎn)生的Thl細胞因子，與這些細胞上表達的⑶40L也可以激活循環(huán)的同種特異性Thl細胞，從而上調它們CD40L的表達，其中所述同種特異性Thl細胞產(chǎn)生于本發(fā)明所述方法中的預致敏步驟和其他宿主免疫細胞。通過維持宿主被激活的細胞⑶40L的表達，在組合物被排斥后提供持續(xù)的⑶40L信號。持續(xù)的宿主⑶40L表達提供了持續(xù)的炎癥環(huán)境并且實現(xiàn)了在介導抗腫瘤效果的方法的第二原位疫苗階段中形成腫瘤特異性CTL，其中，所述炎癥環(huán)境對于腫瘤免疫逃逸的下調是必要的。實施例患者至少一輪化療難以治愈的晚期轉移性癌癥患者(IV期)適合參加本研究。使用完整的病史，身體檢查，全血細胞計數(shù)，臨床化學和胸部、腹部、骨盆計算機斷層掃描(CT)評估每個病人的臨床階段。一些有骨轉移癌病史的患者還進行了 CT/PET掃描。所有患者的臨床分期是根據(jù)修訂后的美國聯(lián)合委員會(AJC)系統(tǒng)而確定的。進一步的資格要求如下書面的自愿知情同意書，年齡彡18歲，至少一處位于被評估認定為經(jīng)皮冷凍消融安全的轉移性病變的可測量疾病，東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)功能 狀態(tài)< 2 ;期望壽命> 2個月；和充足的血液、腎和肝功能總膽紅素< I. 5mg/dL，谷草轉氨酶/谷丙轉氨酶< 2. 5ULN，肌酸酐< I. 5mg/dL，堿性磷酸酶< 2. 5ULN(涉及肝臟時< 5倍正常值)，粒細胞絕對計數(shù)彡I, 200/mm3，血小板計數(shù)彡75，000/mm3, PT/INR ( I. 5，同時血紅蛋白彡9g/dL.患者累積(accrual) 3周沒有使用貝伐單抗(冷凍消融前6周)，并且累積(accrual) 2周沒有進行化療。排除標準為任何預先存在的醫(yī)療條件，該醫(yī)療條件將會損害接受計劃治療的能力；預先同種異體骨髓/干細胞或實體器官移；研究藥物治療的第一天計算，30天內長期使用(超過2周)大于生理劑量的皮質類固醇制劑(等效劑量大于5mg/天的強的松)；伴隨活躍的自身免疫性疾病(例如風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性甲狀腺疾病和葡萄膜炎)；預先實驗性癌癥疫苗治療(例如樹突細胞治療，熱休克疫苗)；免疫抑制治療，包括環(huán)孢素、抗胸腺細胞球蛋白或進入研究3個月內他克莫司；輸血反應病史；進行性細菌或病毒感染；心臟疾病癥狀性質或心臟射血分數(shù)小于45% ;癥狀性肺部疾病或FEV1、FVC和DLCO彡50%的預測；HIV陽性或AIDS (被認定為HBV和/或HCV陽性)病史。大多數(shù)病人在累積時間內沒有足夠的熱量和體液攝入，并沒有因為這個原因被排除。對42例患者進行了評價。平均年齡為60. 2歲(范圍50 89歲)，40%的男性和60%為女性。對患者進行平均2. 7批(line)預先化療的深入預治療，其中每批平均進行7次(course)化療。45%患者接受預先放療,90%患者接受預先手術切除腫瘤病變?；颊哂谐林啬[瘤負擔，平均每個患者有22處轉移性病變。最常見的指征是乳腺癌(42%)，其次是大腸癌(19 % )，還包括卵巢癌，肉瘤，鱗狀細胞癌，肺癌，膀胱/輸尿管癌，胰臟癌，黑色素瘤和食道癌轉移癌。皮下注射皮下注射藥物被給藥的劑量為I X IO7 4X IO7個細胞，該藥物包含同種異體Thl細胞，該細胞綴合⑶3/⑶28包被的微珠。該細胞懸浮于包含PlasmaLyteA，密度為每毫升IXlO7個細胞、1%人源血清白蛋白的配方緩沖液中。I 4個ImL注射劑在同一時間被給藥于不同的位置(上臂、大腿和腹部)。皮下注射給藥的頻率高達每2天或低至每9天，但優(yōu)選地每周一次注射、最少注射3周。腫瘤內注射
腫瘤內注射藥物發(fā)生在消融后腫瘤的壞死中心，注射應在消融的一小時內但可以在消融的一周內。優(yōu)選的藥物中IXlO7 6X IO7個細胞被腫瘤內注射而給藥。如果存在多個腫瘤，則只有一個腫瘤被消融。在某些情況下重復該消融過程。靜脈內、腔內、胸膜內、靜脈內(Intravenou)、硬膜外輸注藥物經(jīng)靜脈內、腹腔內、胸膜內、靜脈內(Intravenou)輸注給藥，劑量范圍為IX IO7 IX IO9個細胞，其中I X IO8個細胞為常用劑量。腹膜腔中輸注藥物可以用于治療轉移癌和惡性腹水。類似地，腔內輸注可以治療惡性胸腔積液，硬膜外輸注可以治療惡性腦脊髓空間。根據(jù)需要這些輸注可以反復進行直到腫瘤被徹底根除。該規(guī)程的第一步驟被稱為“預致敏”步驟。該預致敏步驟由3次或更多次將劑量為I X IO7 4X IO7個細胞的所述藥物經(jīng)皮下注射給藥組成，不少于2天間隔，并優(yōu)選地不多于8天間隔。觀察患者至少30分鐘注射后的任何不良反應。本方法的第二步被稱為“原位接種疫苗”步驟。該步驟在致敏步驟完成后的2-8天 內進行。該過程涉及消融選定腫瘤病變，隨后在I小時內腫瘤內注射IX IO7 6X IO7個細胞劑量的藥物?？蛇x地，惡性腹水癌患者適合腹腔輸注，結合不結合冷凍消融均可；可觸及病變的患者適合酒精消融，結合不結合冷凍消融均可。腹膜轉移癌患者優(yōu)選地腹腔內注射I X IO8 I X IO9個細胞劑量的藥物。用于冷凍消融的方法是使用CryoCare-28經(jīng)皮探針系統(tǒng)(Endocare, CA,USA)。這個系統(tǒng)采用Joule-Thomson效應，從而在一個密閉系統(tǒng)中冷卻超低溫探頭。依照氣體系數(shù)和噴嘴的尺寸，不同的氣體分子在接近噴嘴的區(qū)域產(chǎn)生不同的熱交換事件。氬氣用于冷卻(-187 °C )，氦被用于加熱(67 V )。必要時，預計的目標腫瘤病變在CT圖像引導下被確定和定位。建立無菌區(qū)域并且對預計探針插入部位局部麻醉給藥。指導探針被經(jīng)皮下插入，并經(jīng)CT驗證位于目標腫瘤病變范圍內。進行一個或兩個凍融循環(huán)。根據(jù)目標腫瘤的大小，使用2 5毫米單探頭。冷凍時間約為15 20分鐘，這取決于“冰球”的形成，CT上可見。在第二次冷凍步驟(使用時)開始前，融化通過在等同于冷凍的時間內輸入氦氣而實現(xiàn)。該過程只需要腫瘤病變樣本的消融，并且不需要在無腫瘤邊緣內完全的腫瘤消融。消融的病變可以在冷卻循環(huán)后，注射優(yōu)選的藥物前，冷卻大約10分鐘到I個小時。本方法最后一步驟的免疫刺激步驟在冷凍消融的當天到冷凍消融過程8天內進行。該步驟由一次或多次將劑量為IXIO7 IXIO8個細胞的藥物經(jīng)靜脈內輸注組成，不少于2天間隔給藥。大多數(shù)患者每月接受靜脈輸注作為加強注射。應答經(jīng)本發(fā)明所述方法治療的患者在從最后一次治療約30天后通過CT進行評估。無靜脈造影CT中，腫瘤通常為中間密度。腫瘤、血管、肌肉和淋巴結可能都具有相同的密度。碘造影劑經(jīng)靜脈注射(IV)給藥后，腫瘤得到不同程度提高富含血管的副神經(jīng)節(jié)瘤得到強烈加強(enhanced intensely);然而富含更多細胞的鱗狀細胞癌可能沒有得到強烈加強，或很少加強，或根本沒有加強。癌源或預先內出血在CT上為黑暗(低密度)。由于缺乏血液供應，造影給藥后壞死性癌源不加強。成功的治療中，30天后CT掃描結果顯示所有腫瘤病變的腫脹(規(guī)模增大)與基線相比變成低密度(黑暗)。CT中較大腫瘤的外觀呈現(xiàn)異質性的點綴的低密度斑點，而不是均勻的低密度囊腫或進展性、具有中央壞死區(qū)域和能生存的晚期邊緣(advancing rims)的腫瘤。低密度異質性外觀表明腫瘤已經(jīng)被液態(tài)化。結果圖I顯示了 89歲(yo)轉移性大腸癌患者的冠狀視圖(coronal view),該患者在2009年6月被提出在肝臟有轉移性疾病，并且用數(shù)批FOLFOX和F0LFIRI化療方案以及F0LFIRI與貝伐珠單抗(avastin)的方案進行治療。該患者在2010年6月成為晚期患者，成為化療方法難以治愈，并且2010年9月在肝臟中呈現(xiàn)11處轉移性病變。該患者接受了本文所述3周每周一次劑量為I X IO7皮下藥物注射，一周后接受了其中一處肝臟轉移腫瘤冷凍消融過程和第21天腫瘤內輸注優(yōu)選藥物，并且在第28天靜脈輸注I X IO9個細胞，圖I顯示了在肝臟轉移性病變的一個選取切片的基線外觀。60天后腫瘤變大，并且密度變低，與液態(tài)化反應相一致。90天后腫瘤保持較大的規(guī)模，但可能由于水分重吸收失去了低密度特征。在第95天患者被給藥加強靜脈輸注，在第120天拍攝另一個CT圖像。圖像顯示再次高密度并且規(guī)模變大。為了表明這是事實上的液態(tài)化而不是進展性腫瘤，進 行腫瘤組織切片檢查并由病理專家評估。如圖2所示，組織切片顯示大面積凝固性壞死和與免疫介導的腫瘤液態(tài)化相一致的纖維化。盡管已經(jīng)參考優(yōu)選實施例，對本發(fā)明進行了描述，但本領域技術人員應該認可可以根據(jù)本發(fā)明的描述進行改變和豐富，而不會離開本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種治療組合物，其包含 至少一種外源性抗原； 至少一種I型炎癥細胞因子；以及 至少一種能夠引致樹突細胞成熟化的效應分子。
2.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述外源性抗原為同種異體抗 原。
3.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其中，所述外源性抗原表達于T細胞上。
4.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述炎癥細胞因子產(chǎn)生于肝臟免疫細胞。
5.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述效應分子為CD40L。
6.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述炎癥細胞因子為選自下列的一種或者更多種IFN- y、IL-2、TNF- a、TNF- 3、GM-CSF 和 IL-12。
7.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述效應分子表達于免疫細胞表面。
8.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述效應分子為Toll樣受體的配體。
9.根據(jù)權利要求3所述的組合物，其中，所述T細胞為CD4+T細胞。
10.根據(jù)權利要求9所述的組合物，其中，所述CD4+T細胞為Thl細胞。
11.根據(jù)權利要求10所述的組合物，其中，所述Thl細胞是被激活的。
12.根據(jù)權利要求11所述的組合物，其中，所述Thl細胞是通過⑶3和⑶28表面分子的交聯(lián)而被激活的。
13.根據(jù)權利要求12所述的組合物，其中，所述CD3和CD28表面分子的交聯(lián)是由固定化抗-⑶3和抗-⑶28單克隆抗體實現(xiàn)的。
14.根據(jù)權利要求13所述的組合物，其中，所述抗-CD3和抗-CD28單克隆抗體固定化在納米或微米微粒上。
15.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中，所述微粒是生物可降解的。
16.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述組合物分散于適合輸注的介質中。
17.根據(jù)權利要求16所述的組合物，其中，所述組合物被包裝于注射器中。
18.根據(jù)權利要求I所述的組合物，其中，所述組合物嵌入晶片或芯片中。
19.一種將腫瘤轉化為液化狀態(tài)的方法，其中，包括 利用包含外源性抗原的治療組合物進行預致敏，以便建立針對所述外源性抗原的Thl免疫力； 消融選定的腫瘤或復數(shù)個腫瘤，其中所述消融導致所述腫瘤的至少一部分死亡； 在鄰近所述死亡腫瘤病變處，建立炎癥微環(huán)境；以及 激活適應性和先天免疫細胞。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述預致敏包括給藥多劑量的所述外源性抗原，以激活Thl免疫力。
21.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述治療組合物包括同種異體抗原。
22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中，所述同種異體抗原表達于CD4+T細胞上。
23.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中，所述CD4+T細胞為Thl細胞。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述Thl細胞是通過抗-⑶3和抗-⑶28單克隆抗體交聯(lián)以傳遞T細胞激活信號而被激活的。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中，所述抗-CD3和抗-CD28單克隆抗體是通過將所述抗體固定化在微珠或納米珠上而被交聯(lián)以傳遞T細胞激活信號的。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中，所述珠子是生物可降解的。
27.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中，所述腫瘤消融是通過化學療法、放射療法、冷凍消融法、射頻消融法、電穿孔法、生物療法、抗血管生成療法或其組合。
28.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述炎癥微環(huán)境是通過瘤內給藥所述治療組合物導致Thl細胞因子釋放而建立的。
29.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述激活是通過給藥所述治療組合物引起的。
30.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中，所述激活是通過靜脈輸注所述治療組合物引起的。
31.一種刺激和維持患者Thl應答的方法，其中，包括 利用治療組合物對患者進行預致敏，所述治療組合物包含至少一種外源性抗原、至少一種能夠引致樹突細胞成熟化的效應分子和至少一種Thl細胞因子；以及對患者周期性給藥所述治療組合物。
32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中，所述預致敏是通過皮內給藥所述治療組合物而實施的。
33.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中，所述治療組合物是通過靜脈注射周期性給藥的。
34.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中，所述治療組合物至少每兩天給藥一次。
35.一種用于液化患者中腫瘤的方法，其中，包括， 利用治療組合物對患者進行預致敏，所述治療組合物包含至少一種外源性抗原、至少一種能夠引致樹突細胞成熟化的效應分子和至少一種Thl細胞因子； 使用導致所述腫瘤壞死的方法消融所述腫瘤； 瘤內給藥所述治療組合物；以及 輸注所述治療組合物，以激活適應性和先天免疫細胞。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中，所述效應分子為CD40L。
37.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中，所述Thl細胞因子為選自下列的一種或者更多種IFN- Y、IL-2、TNF- a、TNF- β、GM-CSF 和 IL-12。
38.一種對患者中腫瘤進行液化的方法，其特征在于，包括在患者中建立從頭Thl應答，同時抑制Th2應答； 提供由所述癌細胞壞死性死亡所產(chǎn)生的腫瘤抗原的來源； 提供與Thl應答相一致的炎癥環(huán)境，用于響應所述腫瘤抗原的樹突細胞的成熟化；以及 通過維持所述Thl應答使腫瘤免疫逃逸機制無效。
39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，所述從頭Thl應答是通過利用治療組合物對所述患者進行預致敏而建立的。
40.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，所述腫瘤抗原是原位生成的。
41.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，所述腫瘤抗原是通過消融所述腫瘤生成的。
42.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，所述腫瘤抗原是通過冷凍消融法生成的。
43.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，炎癥環(huán)境中所述樹突細胞的成熟化是通過瘤內給藥所述治療組合物提供的。
44.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，所述腫瘤逃逸機制是通過輸注所述治療組合物而失效的。
45.根據(jù)權利要求44所述的方法，其中，所述輸注為靜脈注射。
46.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中，所述治療組合物包括激活的同種異體的Thl細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于免疫治療癌癥的組合物和方法。具體地，描述了一種癌癥免疫療法，其可以實現(xiàn)系統(tǒng)性液化實體瘤和轉移瘤，而無論它們位于身體何處。該組合物包含被激活的同種異體Th1細胞，在其被適當給藥時，導致腫瘤的液化。該方法包括給藥預致敏劑量的治療組合物，消融選定的腫瘤病變同時瘤內注射該組合物，然后輸注治療組合物。這些步驟能夠實現(xiàn)繼發(fā)于免疫細胞浸潤的系統(tǒng)性腫瘤液化，并導致免疫介導的腫瘤根除。
文檔編號A61K9/08GK102740874SQ201080057506
公開日2012年10月17日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權日2009年12月15日
發(fā)明者邁克爾·哈-諾伊 申請人:免疫創(chuàng)新治療有限公司