專利名稱：包含具有非常規(guī)生物活性的天冬氨酰-tRNA合成酶的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)多肽的形式、包含該多肽的組合物和使用該多肽的方法。相關(guān)技術(shù)的描述在翻譯過程中，催化tRNA分子氨酰化的氨酰-tRNA合成酶對于遺傳信息的解碼是必不可少的。在高等真核生物中，氨酰-tRNA合成酶與其他多肽結(jié)合以形成超分子多酶復(fù)合物。每個真核生物的tRNA合成酶都由核心酶和附加于該核心酶氨基末端或羧基末端的另外的結(jié)構(gòu)域組成，所述核心酶與原核生物的tRNA合成酶的對應(yīng)部分密切相關(guān)。例如，人酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRQ具有的羧基末端結(jié)構(gòu)域不是原核生物和低等真核生物TyrRS 分子的一部分。已經(jīng)證實，數(shù)種氨酰-tRNA合成酶具有不同于其參與翻譯的非常規(guī)功能。例如，小酪氨酰-tRNA合成酶(mini-tyrosyl tRNA)(小TyrRQ，即對應(yīng)于氨基酸殘基1_364并且被多形核細胞彈性蛋白酶和纖維蛋白溶酶切割的TyrRS的N末端結(jié)構(gòu)域，是氨酰tRNA合成酶 “AARS”多功能細胞因子樣蛋白和肽的一員。在體外，小TyrRS表現(xiàn)出刺激嗜中性粒細胞激活和趨化作用、內(nèi)皮細胞增殖和遷移，并且在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)和小鼠基質(zhì)膠分析中促進血管生成。小TyrRS具有ELR基序，所述ELR基序與諸如IL-8的CXC趨化因子相似， 賦予其趨化因子或血管生成活性。與其它包含ELR的細胞因子相似，該基序的突變抑制小 TyrRS結(jié)合并刺激白細胞和血管生成。此外，已經(jīng)證實，TrpRS的截短形式具有血管生成的特性。在正常的人細胞中，可以檢測到兩種形式的TrpRS:由全長分子(氨基酸殘基1-471)構(gòu)成的主要形式和次要的截短形式。通過前mRNA的選擇性剪接使氨基末端結(jié)構(gòu)域缺失而產(chǎn)生所述次要形式。已經(jīng)確定， 小TrpRS的氨基末端是位于全長TrpRS分子的第48位的蛋氨酸殘基?？蛇x擇地，可以通過蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生截短的TrpRS。例如，牛TrpRS在胰腺中高表達并被分泌進胰液中，由此產(chǎn)生截短的TrpRS分子。其他研究表明，小TrpRS抑制VEGF誘導(dǎo)的細胞增殖和遷移(Wakasugi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 99 173-177 (2002)) 尤其是，雞 CAM 分析表明，小 TrpRS 阻斷VEGF的血管生成活性。相比之下，全長TrpRS不抑制血管生成。因此，移除前48個氨基酸殘基可以暴露TrpRS的抗血管生成的活性。因此，與TyrRS —樣，某些形式的TrpRS具有除tRNA的氨?；獾幕钚?。 鑒于對于其他形式的TyrRS和TrpRS相關(guān)的非常規(guī)活性和治療相關(guān)活性的這些發(fā)現(xiàn)，有必要鑒定其他氨酰-tRNA合成酶蛋白的生物學相關(guān)的形式和/或活性，從而開發(fā)出該蛋白家族的全部治療潛能。因此，本發(fā)明滿足這些需要并且提供其他相關(guān)的優(yōu)勢。發(fā)明概述本發(fā)明源于下述發(fā)現(xiàn)某些天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRQ多肽具有治療相關(guān)的非常規(guī)生物活性。因此，一方面，本發(fā)明提供具有至少一種非常規(guī)生物活性的分離的AspRS 多肽，以及基本上保留所述非常規(guī)活性的所述AspRS多肽的活性片段和變體。本文使用的 “非常規(guī)活性”通常是指本發(fā)明的AspRS多肽所具有的、除了氨?；腋唧w地，除了將天冬氨酸添加至tRNAAsp分子以外的活性。如本文詳述，在某些實施方案中，本發(fā)明的AspRS 多肽表現(xiàn)出的非常規(guī)生物活性可以包括但不限于細胞增殖的調(diào)節(jié)、凋亡的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)、細胞分化的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、細胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、Akt介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、 細胞代謝的調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生或活性的調(diào)節(jié)和toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)等。在某些實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽是全長哺乳動物AspRS蛋白的連續(xù)片段。 在更具體的實施方案中，所述AspRS多肽是SEQ ID NO :1所示的人AspRS蛋白序列的連續(xù)片段。作為說明，所述片段基本上可以為任何長度，只要它們不是全長，并且進一步地，只要其保留至少一種目的非常規(guī)生物活性。在某些示例性實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽的大小在長度上為約20-50、20-100、20-200、20-300、20-400或20-500個氨基酸。在其他實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽的大小在長度上為約50-100、50-200、50-300、50-400或 50-500個氨基酸。在其他實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽的大小在長度上為約100-200、 100-300、100-400或100-500個氨基酸。在其他示例性實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽的大小在長度上為約200-300、200-400或200-500個氨基酸。在本發(fā)明的其他實施方案中，AspRS多肽包含AspRS蛋白序列的片段的活性變體 (即，保留至少一種目的非常規(guī)生物活性)，所述AspRS蛋白序列例如SEQ ID N0:1所示的人 AspRS蛋白序列。在更具體的實施方案中，所述活性變體是這樣的多肽，該多肽沿其長度與 SEQ ID NO :1所示的人天冬氨酰-tRNA合成酶序列具有至少70%、80%、90%、95%或99% 的同一性。本發(fā)明的其他實施方案提供了天然存在的或非天然存在的、具有一種或多種非常規(guī)活性的AspRS剪接變體和點突變體。在某些實施方案中，所述AspRS包含兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明更具體的實施方案中，AspRS多肽包含SEQ ID NO 1所示的人AspRS序列的片段，所述片段基本上由氨基酸殘基1-154、1-171、1-174、1-31、399-425、413-476或 397-425、或以上的活性片段或變體組成，所述活性片段或變體基本上保留至少一種目的非常規(guī)生物活性。在其他具體實施方案中，所述AspRS多肽不是NCBI登錄號NP001340所示的多肽。按照本發(fā)明的另一方面，提供了包含至少一種如本文所述的AspRS多肽和異源融合伴侶的融合蛋白。按照本發(fā)明的另一方面，提供了編碼本文所述的多肽和融合蛋白的分離的多核苷
5酸、以及包含這些多核苷酸的表達載體和包含這些表達載體的宿主細胞。還包括與AspRS 多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸。在某些實施方案中，所述寡核苷酸是引物、探針或反義寡核苷酸。其他實施方案涉及靶向AspRS多核苷酸的RNAi試劑。按照本發(fā)明的另一方面，提供了結(jié)合劑(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)，其對于本發(fā)明的AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶之一具有結(jié)合特異性。在某些實施方案中，所述結(jié)合劑是抗體、其抗原結(jié)合片段、肽、肽模擬物、小分子或適體。在某些實施方案中，所述結(jié)合劑拮抗所述AspRS多肽的非常規(guī)活性。在其他實施方案中，所述結(jié)合劑激動所述AspRS多肽的非常規(guī)活性。按照本發(fā)明的另一方面，提供了組合物，例如藥物組合物，其包含生理可接受的載體和至少一種本文所述的本發(fā)明的分離的多肽、融合蛋白、諸如抗體的結(jié)合劑、分離的多核苷酸、表達載體、宿主細胞等。某些實施方案涉及測定樣品中AspRS多肽的存在或水平的方法，包括使所述樣品與一種或多種結(jié)合劑接觸、檢測是否存在所述結(jié)合劑、從而測定所述AspRS多肽的存在或水平，所述結(jié)合劑與本文所述的AspRS多肽特異性結(jié)合。某些實施方案包括測定樣品中AspRS多肽的存在或水平的方法，包括將所述樣品導(dǎo)入到可以特異性地鑒定本文所述的 AspRS多肽的分子檢測器中，從而測定所述AspRS多肽的存在或水平。在具體實施方案中， 所述分子檢測器是質(zhì)譜儀(MQ。某些實施方案包括將AspRS蛋白片段的存在或水平與對照樣品或預(yù)定值比較。某些實施方案包括表征樣品的狀態(tài)以將其與對照區(qū)分。在具體實施方案中，所述樣品與對照包括細胞或組織，并且所述方法包括區(qū)分不同物種的細胞或組織、不同組織或器官的細胞、不同細胞發(fā)育狀態(tài)的細胞、不同細胞分化狀態(tài)的細胞或健康與患病的細胞。還包括鑒定與AspRS多肽或一種或多種其細胞結(jié)合伴侶特異性結(jié)合的化合物的方法，包括a)在合適的條件下使所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶或以上二者與至少一種受試化合物組合，和b)檢測所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶或以上二者與所述受試化合物的結(jié)合，從而鑒定與所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶或以上二者特異性結(jié)合的化合物。在某些實施方案中，所述受試化合物是多肽或肽、抗體或其抗原結(jié)合片段、肽模擬物或小分子。在某些實施方案中，所述受試化合物激動所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶的非常規(guī)生物活性。在其他實施方案中，所述受試化合物拮抗所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶的非常規(guī)生物活性。還包括通過本文提供的任何方法所鑒定的化合物。在其它方面，本發(fā)明還提供了通過將細胞或組織與本文所述的本發(fā)明的組合物接觸而調(diào)節(jié)細胞活性的方法，其中所述待調(diào)節(jié)的細胞活性選自細胞遷移、細胞增殖、凋亡、炎癥、細胞分化、血管生成、細胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、Akt介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞代謝、細胞因子產(chǎn)生和toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在某些實施方案中，所述細胞活性是細胞因子產(chǎn)生。在具體實施方案中，所述細胞因子是 ILl-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL_12p40、MIPl-α、ΜΙΡ-1 β、 GRO-α、MCP-I或IL-Ira中的任意一種或多種。在某些實施方案中，所述細胞活性是toll 樣受體(TLR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在具體實施方案中，所述TLR是TLR2、TLR4或以上二者。某些實施方案包括激發(fā)天然免疫應(yīng)答的方法。在一些實施方案中，所述細胞在個體中。其他方面，本發(fā)明提供了通過給予本發(fā)明的組合物來治療需要治療的個體的疾病、病癥或其他疾病狀態(tài)的方法。舉例來說，這類疾病、病癥或疾病狀態(tài)可以包括但不限于，炎性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤疾病(例如，癌癥)、代謝疾病、神經(jīng)疾病、感染、心血管疾病和異常血管生成相關(guān)的疾病。
序列表簡要說明SEQIDNO:1是人天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)的全長氨基酸序列。
SEQIDNO2是編碼SEQ ID NO 1的AspRS多肽的核酸序列。
SEQIDNO3是人AspRS多肽的32個氨基酸的氨基酸序列。
SEQIDNO4是大鼠AspRS多肽的32個氨基酸的氨基酸序列。
SEQIDNO:5是AspRS兩親性螺旋的帶正電荷的殘基的一致序列。
SEQIDNO:6是瘧蚊(anopheles mosquito) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:7是鹿蜱(deer tick) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:8是霸王蓮花青螺(owl limpet) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO9是水蛭AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:10是爪蟾(Xenopus) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:11是日本河豚(Japanese puffer fish) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序歹LI。
SEQIDNO:12是綠河豚(green spotted puffer) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:13是棘魚(sticklekick) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:14是雞(chickerOAspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:15是牛(bovine) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO16是大鼠AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO17是小鼠AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:18是巖蹄兔(rock hyrax) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:19是負鼠(opossum)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO20是跗猴(tarsier) AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:21是猩猩(orangutarOAspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO:22是黑猩猩(Chimpanzee)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
SEQIDNO23是人AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。
附圖簡述

圖1A-1D顯示AspRS (SEQ ID NO 1)的(A)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和(B)氨基酸序列，并且(C 和D)展示了通過使用人嗜中性彈性蛋白酶進行全長AspRS蛋白的受控水解而產(chǎn)生的AspRS 片段的SDS-PAGE分離。圖IC是SDS-PAGE凝膠，4-12% MOPS,顯示全長AspRS和用PMN彈性蛋白酶的消化。圖ID是SDS-PAGE凝膠，12% MES,顯示全長AspRS和用PMN彈性蛋白酶的消化。圖2A-2B表明用本發(fā)明AspRS (也被稱為DRQ片段處理的內(nèi)皮細胞(bAEC)中Akt 的激活。圖2A顯示通過用彈性蛋白酶產(chǎn)生的AspRS片段庫處理所誘導(dǎo)的Akt的磷酸化，圖 2B顯示利用AspRS切割庫的Akt磷酸化的時間過程。
圖3顯示與由用全長AspRS(DRS)或陽性對照一內(nèi)皮單核細胞激活多肽II (EMAP) 處理的外周血單核細胞(PBMC)的TNF-α分泌相比，用本發(fā)明AspRS片段(Dl)處理的PBMC 的TNF-α分泌增加。用D1、DRS或EMAP II蛋白處理PBMC 24小時并測定TNF-α的分泌。圖4顯示用AspRS片段Dl處理PBMC后所分泌的示例性的細胞因子。處理PBMC 24小時，測定27種不同的細胞因子的分泌，并且發(fā)現(xiàn)ILl-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、 MIPl-α ,MIP-I β , GRO- α、MCP_1 禾口 IL_lra 的分泌增力口。圖5示出AspRS片段Dl以細胞類型特異的方式激活單核細胞。用作為陰性對照的PBS，作為陽性對照的PHA和AspRS片段Dl處理PBMCM小時，并進行測定以檢測單核細胞和淋巴細胞上激活的細胞表面標志物。圖6示出AspRS片段Dl誘導(dǎo)單核細胞(例如，THP-1)和巨噬細胞(例如，RAff 267. 7)細胞系分泌TNF-α。圖7示出AspRS片段Dl誘導(dǎo)巨噬細胞細胞系的趨化性。圖7Α示出使用布丹室 (boudin chamber)測定細胞遷移的實驗裝置，且圖IB示出RAW 264. 7巨噬細胞以劑量依賴的方式向Dl片段遷移。圖8示出THP-I單核細胞中由AspRS片段Dl所介導(dǎo)的TNF- α分泌被MEK抑制劑 (U0126)抑制，但不被ΡΙ3激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(LY^402》抑制，所述MEK抑制劑是MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵組分。LPS用作陽性對照，并且其活性被兩種抑制劑抑制。圖9示出AspRS片段Dl抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成。將包含PBS、舒尼替尼 (sutent)或Dl片段以及VEGF的基質(zhì)膠溶液注入小鼠并分析基質(zhì)膠栓中新的血管浸潤。圖10示出表明AspRS片段Dl的N末端區(qū)域負責其細胞因子活性的實驗結(jié)果。相對于存在6X組氨酸親和標簽的Dl的C末端，存在6X組氨酸親和標簽的Dl的N末端導(dǎo)致該片段的TNF-α分泌活性的降低。圖11示出AspRS片段Dl在其N末端包含哺乳動物特異的32個氨基酸序列。SEQ ID NO 3是人AspRS的32個氨基酸的肽，SEQ ID NO 4是大鼠AspRS的32個氨基酸的肽。 僅在哺乳動物AspRS的N末端發(fā)現(xiàn)而未在酵母AspRS中發(fā)現(xiàn)的32個氨基酸的肽，對于常規(guī)tRNA合成酶活性是不必要的，并且經(jīng)預(yù)測含有推定的螺旋(參見，Jacobo-Molina and Yang (1989)；以及 Escalante and Yang, JBC (1992))。圖12示出人AspRS片段Dl的鑒定、進化和結(jié)晶。圖12A示出用7小鼠巨噬細胞進行SDS-PAGE分析的步驟；切下蛋白條帶并用LC MS、MS進行分析，AspRS的N末端片段被鑒定為D1。圖12B示出AspRS的附加的N末端是進化出的結(jié)構(gòu)域。圖12C示出解決至IJl.9 A分辨率的全長二聚體人AspRS的晶體結(jié)構(gòu)；指出了 N末端tRNA反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，氨?；Y(jié)構(gòu)域和連接Dl片段與氨?；Y(jié)構(gòu)域的30個氨基酸的連接物。圖13示出Dl在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)促炎性和抗炎性細胞因子的分泌。圖13A示出來自靜脈注射10mg/kg Dl的小鼠的體內(nèi)TNF-α和IL-10血清水平。2小時后小鼠顯示出 TNF-α的增加，6小時后TNF-α被快速清除，而IL-10的水平持續(xù)增高。圖1 示出分別在4小時和24小時之后，從PBMC體外釋放的TNF- α和IL-IO0使用Dl (250ηΜ)處理的細胞表現(xiàn)出增加，而用全長AspRS (250ηΜ)處理的細胞沒有表現(xiàn)出增加；LPS (10EU)也表現(xiàn)出強烈的TNF-α應(yīng)答。圖13C中的流式細胞術(shù)分析揭示Dl與83%的原代單核細胞和14% 的總淋巴細胞群體結(jié)合。在原代淋巴細胞中，Dl與76%的⑶19+B細胞結(jié)合。
圖14示出Dl通過toll樣受體2和toll樣受體4(TLR2和TLR4)激活NF_kB。 圖14A示出Dl激活7小鼠巨噬細胞中的NF_kB ；編碼NF- κ B誘導(dǎo)的分泌型胚胎堿性磷酸酶報告基因的RAW-Blue細胞對于Dl表現(xiàn)出劑量依賴的NF- κ B激活，相比之下，缺乏通過AspRS的NF- κ B激活。如圖14Β所示，Dl (1 μ Μ)同時激活TLR2和TLR4超表達的 ΗΕΚ293細胞，而AspRS (1 μ Μ)沒有表現(xiàn)出活性；用NF- κ B誘導(dǎo)的報告分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達 TLR2或TLR4的ΗΕΚ293細胞證明，Dl可以誘導(dǎo)NF-κ B激活。在圖14C中，流式細胞術(shù)表明 Dl與超表達TLR2或TLR4的HEK細胞結(jié)合，而不與對照細胞結(jié)合。圖15示出Dl活性的表征，部分地與N末端兩親性螺旋有關(guān)。圖15Α中的螺旋輪描繪了人AspRS的N末端，并展現(xiàn)兩親性螺旋。圖15Β中的比對(從上至下，SEQ ID NO 6-23)說明針對N末端螺旋而設(shè)計的兩個Dl突變體；用于中和帶負電的殘基的三丙氨酸 (AAA)突變，和代表酵母序列的部分帶電的回復(fù)突變體(SKK)。圖15C示出用Dl(50nM)處理24以后從PBMC釋放的體外TNF- α和IL-10增加，而用全長AspRS (50ηΜ)或Δ 22突變體(50ηΜ)處理后不增加；帶電的突變體(AAA和SKK)還表現(xiàn)出降低的活性。圖15D說明Dl 如何從巨噬細胞中釋放并通過TLR2和TLR4受體與單核細胞、T細胞和B細胞結(jié)合，從而激發(fā)TNF- α釋放的早期促炎性應(yīng)答，隨后激發(fā)IL-10釋放的抗炎性應(yīng)答。圖16示出Dl活性不是因為內(nèi)毒素污染。在圖16Α中，哺乳動物表達的Dl誘導(dǎo)外周血單核細胞中細胞因子的分泌。在ΗΕΚ293細胞中，Dl與常規(guī)分泌序列一起表達。收集含有分泌的Dl的條件培養(yǎng)基，濃縮并與PBMC —起孵育；含有Dl的培養(yǎng)基誘導(dǎo)TNF-α釋放，而這在模擬轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中未觀察到。如圖16Β所示，Dl活性不依賴內(nèi)毒素污染；在內(nèi)毒素滅活劑多粘菌素B的存在下，Dl細胞因子的釋放未改變，而脂多糖(LPQ被完全抑制。 圖16C示出用蛋白酶K消化Dl破壞了 PBMC的細胞因子刺激能力。通過用蛋白酶K過夜處理，Dl被完全消化，將消化的Dl加入PBMC中并用ELISA測定TNF- α分泌。發(fā)明詳述除非文中有明確相反指示，本發(fā)明的實施可利用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)分子生物學方法和重組DNA技術(shù)，為了說明的目的，其中很多方法和技術(shù)在下文進行了描述。這些技術(shù)在文獻中有充分的講解。參見，例如，Sambrook，et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)(第 2 版，1989) ；Maniatis et al.， Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)(1982) ；DNA Cloning :A Practical Approach (DNA 克隆操作方法)，vol. I&II (D. Glover，ed.) ；Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)(N. Gait，ed.，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)(B. Hames&S. Higgins，eds. , 1985) ；Transcription and Translation (轉(zhuǎn)錄禾口番羽譯) (B. Hames&S. Higgins, eds.，1984) ；Animal Cell Culture (動物細胞培養(yǎng))(R. Freshney, ed. , 1986) ；A Practical Guide to Molecular Cloning (分子克隆操作指南)(B. Perbal， ed.，1984)。本文引用的所有出版物、專利、專利申請通過引用的方式將其全部內(nèi)容并入本文。定義除非另外指明，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語都具有與本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。盡管在實施或檢驗本發(fā)明時可以使用與本文所述的相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了優(yōu)選的方法和材料。出于本發(fā)明的目的，如下定義以下術(shù)語。在本說明書和附加的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“a( —)”、“an(—個)”和 “the (該)”包括復(fù)數(shù)形式，除非文中明確指示不包括復(fù)數(shù)。例如，“an element (—個元件)” 表示一個元件或多個元件。所用“約”表示與參考的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度(dimension)、尺寸、 數(shù)額、重量或長度相比，改變多達30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或的量、水平、值、
數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長度?！凹觿笔侵冈鰪娀蚰MAspRS的非常規(guī)生物活性的分子。激動劑可以包括蛋白、 核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或組合物，這些激動劑通過與AspRS或其結(jié)合伴侶直接相互作用或通過對AspRS參與的生物途徑中的組分起作用來調(diào)節(jié)AspRS的活性。 包括部分和完全激動劑。術(shù)語“拮抗劑”是指抑制或減弱AspRS的非常規(guī)生物活性的分子。拮抗劑可以包括諸如抗體的蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或組合物，這些拮抗劑通過與AspRS或其結(jié)合伴侶直接相互作用或通過對AspRS參與的生物途徑中的組分起作用來調(diào)節(jié)AspRS或其結(jié)合伴侶的活性。包括部分和完全拮抗劑。利用“編碼序列”來表示負責編碼基因的多肽產(chǎn)物的任何核酸序列。與之相反，術(shù)語“非編碼序列”是指并非負責編碼基因的多肽產(chǎn)物的任何核酸序列。整個說明書中，除非上下文另外要求，詞語“包含(comprise) ”、“包含 (comprises) ”和“包含(comprising) ”應(yīng)理解為意指包括陳述的步驟或元素或者步驟或元素的組，但不排除任何其他的步驟或元素或者步驟或元素的組。利用“由...組成(consisting of) ”來表示包括且限于跟隨在詞組“由...組成” 后的任何內(nèi)容。因此，詞組“由...組成”表明所列出的元素是必需的或強制性的，并且可以不存在其他元素。利用“基本上由...組成(consisting essentially of) ”來表示包括列在該詞組后所列的任何元素，并限于不妨礙或不促進在所列元素的公開內(nèi)容中指明的活性或作用的其他元素。因此，詞組“基本上由...組成”表明所列元素是必需的或強制性的，但其他元素是任選的，可以存在或可以不存在，這取決于它們本質(zhì)上是否影響所列元素的活性或作用。如本文所使用的，“功能”和“功能的”等術(shù)語是指生物學功能、酶血功能或治療功能。利用“基因”來表示占據(jù)染色體上的特定基因座的遺傳單元，并且由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和/或翻譯調(diào)節(jié)序列、和/或編碼區(qū)、和/或非翻譯序列(即，內(nèi)含子、5'和3'非翻譯序列)組成?！巴葱浴笔侵敢恢碌幕蚪M成型保守取代的氨基酸的百分數(shù)。同源性可以利用諸如 GAP(Deveraux et al.，1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)的序列比對程序來確定，其通過引用的方式并入本文。通過這種方式，可以通過在比對中插入空位來比較與本文中所引用的序列相似或基本上有不同的長度的序列，這種空位可以通過例如利用GAP的比
較算法來確定。術(shù)語“宿主細胞”包括個體細胞或細胞培養(yǎng)物，其可以是或已經(jīng)是本發(fā)明的任何重組載體或分離的多核苷酸的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，且由于天然的、偶
10然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的親代細胞完全一致(在形態(tài)學上或在總DNA互補物中)。宿主細胞包括用本發(fā)明的重組載體或多核苷酸在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細胞。包含本發(fā)明的重組載體的宿主細胞是重組宿主細胞。利用“分離的，，來表示基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含在其天然狀態(tài)下通常伴隨它的組分的物質(zhì)。例如，本文使用的“分離的多核苷酸”包括已經(jīng)從天然存在狀態(tài)中位于其側(cè)翼的序列中純化的多核苷酸，例如，從通常鄰近DNA片段的序列中移出所述片段?？蛇x地，本文所用的“分離的肽”或“分離的多肽”等包括從其天然的細胞環(huán)境中以及從與細胞的其他組分的結(jié)合中體外分離和/或純化的肽或多肽分子，即，它明顯不與體內(nèi)物質(zhì)結(jié)合。如本文所使用的術(shù)語“mRNA”或有時稱為“mRNA轉(zhuǎn)錄本”，包括但不限于前mRNA 轉(zhuǎn)錄本、轉(zhuǎn)錄加工中間體、準備用于翻譯的成熟mRNA以及一個或多個基因的轉(zhuǎn)錄本，或來源于mRNA轉(zhuǎn)錄本的核酸。轉(zhuǎn)錄本加工可以包括剪接、編輯和降解。如本文所使用的，來源于mRNA轉(zhuǎn)錄本的核酸是指所述mRNA轉(zhuǎn)錄本或其子序列被最終用作模板所合成的核酸。從 mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，從該cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA，從該cDNA擴增的DNA，從擴增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA 等都是來源于該mRNA的轉(zhuǎn)錄本，并且多這種來源的產(chǎn)物的檢測能指示樣品中原始轉(zhuǎn)錄本的存在和/或豐度。因此，mRNA來源的樣品包括但不限于，一個或多個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本、 從該mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA、從該cDNA轉(zhuǎn)錄的cRNA、從基因擴增的DNA，從擴增的DNA轉(zhuǎn)錄的 RNA 等。本文使用的“非常規(guī)的”活性通常是指本發(fā)明的AspRS多肽所具有的，除了氨酰化，且更具體地，除了將其同源氨基酸添加至其同源tRNA分子以外的活性。非常規(guī)活性的非限制性實例包括RNA結(jié)合、氨基酸結(jié)合、細胞增殖的調(diào)節(jié)、細胞遷移的調(diào)節(jié)、細胞分化的調(diào)節(jié)(例如造血作用)、細胞凋亡或其它形式的細胞死亡的調(diào)節(jié)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、細胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、細胞代謝的調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生或活性的調(diào)節(jié)、細胞因子受體活性的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)等。術(shù)語“調(diào)節(jié)”包括與對照相比，通常以統(tǒng)計學上顯著或生理上顯著的量“增加”或 “刺激”，以及“減少”或“降低”?！霸黾拥摹被颉疤岣叩摹绷客ǔＪ恰敖y(tǒng)計學上顯著的”量，并且可以包括沒有組合物(缺乏試劑或化合物)或有對照組合物時所產(chǎn)生的量的1. 1、1.2、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更大倍數(shù)(例如，500、1000倍)(包括兩者之間大于1的所有整數(shù)和小數(shù)，例如1. 5,1. 6,1. 7、1. 8等)的增加?！皽p少的”或降低的量通常是“統(tǒng)計學上顯著的”量，并且可以包括沒有組合物(缺乏試劑或化合物)或有對照組合物時所產(chǎn)生的量的 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16%, 17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%, 80^^85^^90%,95%或100%的降低，包括兩者之間的所有整數(shù)。“統(tǒng)計學上顯著的”量的其他實例在下文描述。術(shù)語“從...獲得”是指諸如例如，多核苷酸提取物或多肽提取物的樣品從個體的特定來源分離，或來自個體的特定來源。例如，提取物可以從直接分離自個體的組織或生物流體獲得?！皝碓从凇被颉皬?..獲得”還可以指多肽或多核苷酸序列的來源。例如，本發(fā)明的AspRS序列可以“來源于IspRS蛋白水解片段或AspRS剪接變體或以上的一部分的序列信息，不管它們是天然存在的或人工產(chǎn)生的，并因此可以包括該序列，基本上由該序列組成或由該序列組成。
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本文所用的表述“序列同一性”或者例如包含“與...50% —致的序列”指序列在比較窗中基于一個一個核苷酸或基于一個一個氨基酸一致的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通過以下來計算在比較窗中比較兩個最優(yōu)比對的序列，確定兩條序列中出現(xiàn)的相同的核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser, Thr、Gly、 Val、Leu、He、Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg、His、Asp、GIu、Asn、Gin、Cys 和 Met)的位置數(shù)量以得到配對位置數(shù)，將該配對位置數(shù)除以比較窗(即，窗大小)中的位置總數(shù)，并將得到的結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。本文所使用的“剪接點”包括成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本或所編碼的多肽中第一個外顯子的 3’端與第二個外顯子的5’端連接的區(qū)域。該區(qū)域的大小可以變化，并在一個外顯子的3’ 端與另一個外顯子的5’端連接處的確定殘基的任一端可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或
更多個(包括兩者之間的所有整數(shù))核苷酸或氨基酸殘基?！巴怙@子”是指已經(jīng)通過順式剪接移除前體RNA的一部分(內(nèi)含子)或已經(jīng)通過反式剪接將兩個或更多個前體RNA分子連接在一起后，在成熟形式的RNA分子中呈現(xiàn)的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA或諸如rRNA或tRNA的非編碼RNA的功能形式。取決于上下文，外顯子可以指DNA或其RNA 轉(zhuǎn)錄本中的序列?！皟?nèi)含子”是指基因中不翻譯成蛋白的非編碼核酸區(qū)域。非編碼的內(nèi)含子節(jié)段被轉(zhuǎn)錄到前體mRNA (前mRNA)和某些其他RNA (例如長非編碼RNA)中，并隨后在加工成成熟RNA時通過剪接去除。 “剪接變體”是指通過選擇性剪接產(chǎn)生的成熟mRNA或其編碼的蛋白，所述選擇性剪接是指在RNA剪接期間，RNA(初級基因轉(zhuǎn)錄本或前mRNA)的外顯子以多種途徑重新連接的過程。所得的不同mRNA可以翻譯成不同的蛋白異構(gòu)體，從而允許單一基因編碼多種蛋白。本文所用的“個體”包括呈現(xiàn)能夠用本發(fā)明的AspRS多核苷酸或多肽治療或診斷的癥狀或處于呈現(xiàn)該癥狀風險中的任何動物。合適的個體(患者)包括實驗室動物(諸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場動物、和家養(yǎng)動物或?qū)櫸?諸如貓或狗)。非人靈長類，以及優(yōu)選的人類患者包括在內(nèi)。如本文所用的，“治療(Treatment) ”或“治療(treating) ”包括對能夠被本文所述的AspRS多核苷酸或多肽的非常規(guī)活性影響的疾病或疾病狀態(tài)的癥狀或病理產(chǎn)生的任何期望的效應(yīng)，并且可以包括被治療的疾病或疾病狀態(tài)的一個或多個可測量的標志物的即便極小的變化或改善。還包括與非Asp療法相關(guān)的治療，其中本文所述的AspRS序列提供治療的臨床標志物。“治療(Treatment)”或“治療(treating) ”并不必然表示疾病或疾病狀態(tài)或其相關(guān)癥狀的徹底根除或治愈。接受該治療的個體是有需要的任何個體。臨床改善的示例性標志物對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。利用“載體”或“核酸構(gòu)建體”來表示在其中可以插入或克隆多核苷酸的多核苷酸分子，優(yōu)選DNA分子，例如來自質(zhì)粒、噬菌體、酵母或病毒的DNA分子。載體優(yōu)選包含一個或多個獨特的限制性位點，并能夠在包括靶細胞或組織或者祖細胞或其組織在內(nèi)的限定的宿主細胞中自主復(fù)制，或者能與限定的宿主的基因組整合使得克隆的序列可復(fù)制。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，例如，載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒、染色體外元件、小型染色體或人工染色體。載體可以包含用于確保自我復(fù)制的任何元件。可選擇地，載體可以是當導(dǎo)入宿主細胞時，能被整合進基因組并與它被整合進的染色體一起復(fù)制的載體。術(shù)語“野生型”和“天然存在的”可交替使用，指具有從天然存在的來源分離的基因或基因產(chǎn)物的特征的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因或基因產(chǎn)物(例如，多肽)是在群體中最常見的，并因此可被任意地指定為基因的“正?！被颉耙吧汀毙问健Ｌ於滨?tRNA合成酶多肽本發(fā)明通常涉及分離的AspRS多肽、編碼該多肽的多核苷酸、與該多肽結(jié)合的結(jié)合劑、該多肽的類似物、變體和片段等，以及使用上述任何物質(zhì)的組合物和方法。因此，按照本發(fā)明的一方面，提供了具有治療相關(guān)的非常規(guī)活性的AspRS多肽，以及包含所述AspRS多肽的組合物。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白，，在本文可交替使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成的類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸(諸如相應(yīng)天然存在氨基酸的化學類似物)的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽不被限制為特定的長度，但是，在本發(fā)明的背景下，其通常代表全長蛋白的片段，并且可以包括諸如糖基化、乙?；?、磷酸化等的翻譯后修飾以及本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他修飾，并且包括天然存在的或非天然存在的修飾?？梢允褂枚喾N公知的重組技術(shù)和/或合成技術(shù)來制備本發(fā)明的多肽和蛋白，這些技術(shù)的示例性實例將在下文進一步討論。表述“多肽變體”指通過至少一個氨基酸殘基的添加、刪除或取代而區(qū)別于參照 AspRS多肽(例如，SEQ ID NO 1或其任意片段，例如Dl，包括由SEQ ID NO 1的1-154、 1-171、1-174、1-177、1-31、399-425、413-476 或 397-425 位氨基酸殘基組成的片段)，并通常保留至少一種本文所述的非常規(guī)活性的多肽。在某些實施方案中，多肽變體通過一個或多個取代而區(qū)別于參照多肽，所述取代可以是本文所述的并且是本領(lǐng)域內(nèi)已知的保守型或非保守型取代。在某些實施方案中，多肽變體包含保守型取代，在這方面，本領(lǐng)域熟知一些氨基酸可以改變?yōu)榫哂袕V泛相似特性的其他氨基酸，而不會改變多肽活性的性質(zhì)。本發(fā)明包括的多肽變體沿其長度通常表現(xiàn)出與野生型哺乳動物AspRS蛋白的相應(yīng)區(qū)域至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的同一性(通過下文所述來確定)，所述野生型哺乳動物AspRS蛋白例如SEQ ID NO 1 或其任意片段，例如 D1，包括由 SEQ ID NO 1 的 1-154、1-171、1-174、1-177、1-31、 399-425,413-476或397-425位氨基酸殘基組成的片段。還包括通過1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 或更多個氨基酸的添加、刪除或取代而區(qū)別于參照AspRS序列，但保留參照AspRS多肽性質(zhì) (例如非常規(guī)活性)的序列。在某些實施方案中，氨基酸添加或刪除發(fā)生在SEQ ID NO 1 或其片段的C末端和/或N末端，所述片段由SEQ ID N0:1的1-154、1-171、1-174、1-177、 1-31、399-425、413-476或397-425位氨基酸殘基組成。在某些實施方案中，氨基酸添加包括鄰近這些AspRS片段的C末端和/或N末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、30、40、50或更多個野生型殘基(即，來自相應(yīng)的全長AARS多肽)。在其他實施方案中，變體多肽與相應(yīng)的AspRS參照序列在至少但少于20%、 15%、10%或5%的殘基上不同。(如果這種比較需要比對，則序列應(yīng)該進行最大相似性的比對。從刪除或插入或錯配“環(huán)”出的序列被認為是不同的)。適宜地，不同是在非必需殘基或保守型取代處的不同或變化。還包括AspRS參照多肽的生物活性“片段”。代表性的生物活性片段通常參與相互作用，例如分子內(nèi)的或分子間的相互作用。分子間的相互作用可以是特異性結(jié)合相互作用或酶促相互作用。分子間相互作用可以在AspRS多肽與細胞結(jié)合伴侶之間發(fā)生，所述細胞結(jié)合伴侶例如參與AspRS多肽的非常規(guī)活性的細胞受體或其他宿主分子。通常，生物活性片段包含具有AspRS參照多肽的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序， 并且可以包括不同活性結(jié)構(gòu)域中的一個或多個(在一些情況下，是全部)，以及包括具有非常規(guī)活性的片段。在一些情況下，AspRS多肽的生物活性片段具有對于特定的截短的片段獨特的生物活性，這樣使得全長AspRS多肽可能沒有該活性。在一些情況下，生物活性可以通過將生物活性AspRS多肽片段與其他的全長AspRS多肽序列分離，或者通過改變?nèi)L AspRS野生型多肽序列的某些殘基以暴露生物活性結(jié)構(gòu)域而被揭示。例如，在某些示例性的實施方案中，AspRS多肽可以包含本文所示的兩親性螺旋的全部或一部分(參見，例如SEQ ID NO 3)和/或帶正電殘基區(qū)域(參見，例如SEQ ID NO :5)。在某些實施方案中，兩親性螺旋是本文所述的22個氨基酸的區(qū)域。AspRS參照多肽的生物活性片段可以是這樣的多肽片段，該多肽片段例如是SEQ ID NO 1 所示的氨基酸序列的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、 160、170、180、190、200、220、240、250、260、280、300個或更多個連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸，包括兩者之間的所有整數(shù)。在其他示例性實施方案中，SEQ ID NO :1的AspRS片段大小的長度范圍為約 20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-125、20-150 或 20-175個氨基酸。在其他實施方案中，該片段大小的長度范圍為約30-40、30-50、30-60、 30-70、30-80、30-90、30-100、30-125、30-150 或 30-175 個氨基酸。在其他實施方案中，該片段大小的長度范圍為約 40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、40-125、40-150 或 40-175個氨基酸。在其他示例性實施方案中，該片段大小的長度范圍為約50-60、50-70、 50-80、50-90、50-100、50-125、50-150 或 50-175 個氨基酸。在某些實施方案中，AspRS多肽是截短的AspRS多肽。本文所用的“截短的IspRS 是指短于其對應(yīng)的全長AspRS蛋白的天冬氨酰-tRNA合成酶蛋白，例如，由于從所述全長 AspRS蛋白N末端和/或C末端移除氨基酸。截短的程度，即從全長AspRS蛋白移除的N末端和/或C末端氨基酸殘基的數(shù)量，可以明顯不同，但是如本文所述，當給予細胞、組織或個體時，仍然提供所需的細胞效應(yīng)。在某些實施方案中，從全長哺乳動物AspRS蛋白的N末端和/或C末端截去至少約5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350個氨基酸或更多，包括所有中間的長度。中間長度意圖包括它們之間的所有整數(shù)，例如6、7、8等，51、52、 53等，201、202、203等。合適地，生物活性片段的活性不少于AspRS參照多肽的非常規(guī)生物活性的約1%、10%、25%或50%。還包括AspRS多肽的蛋白水解片段，其可根據(jù)多種技術(shù)表征、鑒定或衍生。例如， 蛋白水解片段可以在體外鑒定，例如通過將全長或其他AspRS多肽與選擇的蛋白酶一起孵育，或它們可以被內(nèi)源性地(即，體內(nèi))鑒定。在某些實施方案中，諸如內(nèi)源蛋白水解片段的蛋白片段可以通過以下方法產(chǎn)生或鑒定，例如，通過在選擇的微生物或真核細胞中重組表達全長或其他AspRS多肽，并分離和表征來自其中的內(nèi)源產(chǎn)生的蛋白片段，所述微生物或真核細胞已被修飾使之包含一種或多種選擇的蛋白酶或天然地包含一種或多種可以對選擇的AspRS多肽起作用的蛋白酶。在某些實施方案中，諸如內(nèi)源(例如，天然存在的)蛋白水解片段的蛋白片段可以從以下部分產(chǎn)生或鑒定，例如多種細胞部分(例如，胞漿、膜、核)和/或多種細胞類型的生長培養(yǎng)基，所述細胞類型包括例如，諸如RAW巨噬細胞(例如，7巨噬細胞)的巨噬細胞、T細胞、包括原代T細胞和諸如Jurkat的T細胞系，以及自然殺傷(NK)細胞等。在某些實施方案中，因而產(chǎn)生的諸如內(nèi)源蛋白水解片段的蛋白片段可以通過諸如質(zhì)譜的技術(shù)或等效技術(shù)來鑒定。一旦體外或內(nèi)源鑒定的蛋白片段已經(jīng)產(chǎn)生或被鑒定，它就可以被定位或測序，并且例如，被克隆進表達載體用于重組產(chǎn)生，或合成產(chǎn)生。大量的蛋白酶可以用于產(chǎn)生、鑒定、衍生或表征AspRS蛋白水解片段的序列。一般地，通常根據(jù)三個主要標準將蛋白酶分類(i)所催化的反應(yīng)，( )催化位點的化學性質(zhì)和 (iii)由結(jié)構(gòu)揭示的進化關(guān)系。通過催化機理分類的蛋白酶或蛋白水解酶的一般實例包括天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。大多數(shù)天冬氨酸蛋白酶屬于胃蛋白酶家族。該家族包括消化酶，例如胃蛋白酶和凝乳酶，以及溶酶體組織蛋白酶D和諸如腎素的加工酶，和某些真菌蛋白酶(例如， 青霉蛋白酶(penicillop印sin)、根霉菌蛋白酶(rhizopusp印sin)、殼室囊菌蛋白酶 (endothiapepsin)).天冬氨酸蛋白酶的第二家族包括病毒蛋白水解酶，例如來自AIDS病毒(HIV)的蛋白酶，還被稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白酶(retrop印sin)。絲氨酸蛋白酶包括兩個不同的家族。第一，胰凝乳蛋白酶家族，包括哺乳動物酶， 例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和激肽釋放酶，第二，枯草桿菌蛋白酶家族，包括諸如枯草桿菌蛋白酶的細菌酶。這兩個家族之間的通用3D結(jié)構(gòu)不同，但它們具有相同的活性位點幾何構(gòu)型，并且通過相同的機理進行催化。絲氨酸蛋白酶表現(xiàn)出不同的底物特異性、 差異性，這主要與多種酶亞位點(底物殘基作用位點)中的氨基酸取代有關(guān)。某些絲氨酸蛋白酶具有擴展的與底物的作用位點，而其他絲氨酸蛋白酶具有限于Pl底物殘基的特異性。半胱氨酸蛋白酶家族包括諸如木瓜蛋白酶、獼猴桃蛋白酶和菠蘿蛋白酶的植物蛋白酶，數(shù)種哺乳動物溶酶體組織蛋白酶，胞漿鈣蛋白酶(鈣激活的)以及數(shù)種寄生蟲蛋白酶 (例如，錐蟲(Trypanosoma)、血吸蟲(Schistosoma))。木瓜蛋白酶是原型，并且是該家族中研究最多的成員。對白介素-ι-β轉(zhuǎn)化酶的X射線結(jié)構(gòu)的新的解釋已經(jīng)揭示半胱氨酸蛋白水解酶的一種新的折疊類型。金屬蛋白酶是較老的蛋白酶種類中的一種，在細菌、真菌和高等有機體中發(fā)現(xiàn)。它們在序列和3D結(jié)構(gòu)上差異顯著，但大多數(shù)酶都含有具有催化活性的鋅原子。在某些情況下，鋅可以被諸如鈷或鎳的另一金屬替換而不喪失蛋白水解活性。細菌嗜熱菌蛋白酶已被良好表征并且其結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示鋅由兩個組氨酸和一個谷氨酸結(jié)合。許多金屬蛋白酶含有序列基序ΗΕΧΧΗ，其為鋅提供兩個組氨酸配體。第三配體是谷氨酸(嗜熱菌蛋白酶、腦啡肽酶、 丙氨酰氨肽酶)或組氨酸(蝦紅素、粘質(zhì)沙雷氏菌酶(serralysin))。在某些示例性的實施方案中，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和可得到的技術(shù)、使用多種蛋白水解酶中的任何一種來產(chǎn)生截短的AspRS多肽。示例性的蛋白酶包括，例如，無色肽酶、氨肽酶、安克洛酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、菠羅蛋白酶、鈣蛋白酶、鈣蛋白酶I、鈣蛋白酶 II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、組織蛋白酶B、 組織蛋白酶C、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶G、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、胃促胰酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、膠原酶、補體Clr、補體Cls、補體因子D、補體因子I、黃瓜素、二肽基肽酶IV、彈性蛋白酶(白細胞)、彈性蛋白酶(胰腺)、內(nèi)蛋白酶Arg-C、內(nèi)蛋白酶Asp-N、內(nèi)蛋白酶Glu-C、內(nèi)蛋白酶Lys-C、腸激酶、因子Xa、無花果蛋白酶、弗林蛋白酶、粒酶A、粒酶B、HIV蛋白酶、IGase、組織激肽釋放酶、亮氨酸氨基肽酶(總的)、亮氨酸氨基肽酶(細胞溶質(zhì)的)、亮氨酸氨基肽酶(微粒體的)、基質(zhì)金屬蛋白酶、蛋氨酸氨基肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纖維蛋白溶酶、氨?；彼岫拿?、鏈酶蛋白酶E、前列腺特異性抗原、來自灰色鏈霉菌(Sti^ptomyces griseus)的堿性蛋白酶、 來自曲霉屬(Aspergillus)的蛋白酶、來自佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、來自醬油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)) (堿性的或堿性蛋白酶)、來自多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)的蛋白酶、來自芽孢桿菌(Bacillus sp.)的蛋白酶、來自根霉菌(lihizopus sp.)的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶體、 來自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶Α、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、凝乳酶、鏈激酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、胰蛋白酶、類胰蛋白酶和尿激酶。某些實施方案涉及分離的AspRS多肽，及包含該多肽的藥物組合物，和使用它們的方法，所述分離的AspRS多肽包含來源于內(nèi)源天然存在的AspRS多肽片段的氨基酸序列， 或基本上由這些氨基酸序列組成或由這些氨基酸序列組成，以。在某些實施方案中，如上文所示，諸如內(nèi)源蛋白水解片段的AspRS蛋白片段的序列可以從以下部分產(chǎn)生或鑒定，例如多種細胞部分(例如，胞漿、膜、核)和/或多種細胞類型的條件培養(yǎng)基，包括原代細胞和細胞系。這類細胞類型的實例包括但不限于，免疫細胞，例如單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞 (例如，7巨噬細胞，參見實施例5)、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和淋巴細胞，所述淋巴細胞例如B細胞和T細胞(例如，CD4+輔助細胞和CD8+殺傷細胞)(包括原代T細胞和諸如Jurkat T細胞的T細胞系)以及自然殺傷(NK)細胞。在某些實施方案中，可以通過諸如質(zhì)譜的技術(shù)或等效技術(shù)來鑒定AspRS蛋白片段。僅通過示例的方式而非限制，在某些實施方案中，來自多種生理狀態(tài)(例如，缺氧、 限定飲食、年老、患病)的多種細胞類型、組織或體液的蛋白質(zhì)組或其部分可以通過ID SDS-PAGE進行分離并按固定間隔將凝膠泳道切成條帶，然后該條帶可以任選地用諸如胰蛋白酶的合適的蛋白酶進行消化以釋放肽，該肽隨后可以通過ID反相LC-MS/MS來分析。所得的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可被整合成所謂的肽圖(P印tograph)，其中在左圖中，相對于垂直維度中的SDS-PAGE遷移(從上到下是分子量從高到低)，以水平維度繪出指定蛋白的序列范圍 (從左到右是N末端到C末端)。然后可以對具體肽片段進行測序或定位。在某些實施方案中，AspRS參照片段可以通過其例如與相應(yīng)的全長AspRS的分子量相比的獨特的分子量來表征。如上文所述，多肽變體可以通過一個或多個取代、缺失、添加和/或插入?yún)^(qū)別于本發(fā)明的AspRS多肽。這些變體可以是天然存在的或可以是合成產(chǎn)生的，例如，通過修飾一個或多個本發(fā)明的上述多肽序列并按照本文所述用本領(lǐng)域內(nèi)公知的多種技術(shù)中的任何一種評估其生物活性。在其他的示例性實施方案中，所述變體可以是天然存在的或非天然存在的剪接變體，其中所述多肽具有至少一種非常規(guī)活性，例如本文所述的非常規(guī)活性。在其他的示例性實施方案中，相對于野生型AspRS多肽序列，所述變體包含一個或多個天然存在的或非天然存在的點突變，其中所述多肽具有至少一種非常規(guī)活性，例如本文所述的非常規(guī)活性。在某些實施方案中，變體包含保守型取代。“保守型取代，，是指氨基酸被具有相似性質(zhì)的另一個氨基酸所取代，這樣肽化學領(lǐng)域技術(shù)人員會預(yù)測到基本上未改變的多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性?？梢栽诒景l(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)內(nèi)進行修飾，并且仍可獲得編碼具有所需特性的變體或衍生多肽的功能分子。當希望改變多肽的氨基酸序列來產(chǎn)生等同的甚至改進的本發(fā)明的AspRS多肽的變體時，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表1改變編碼 DNA序列的一個或多個密碼子。例如，在蛋白結(jié)構(gòu)中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不會造成與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子的結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力的明顯損失。因為通常是蛋白的相互作用能力和性質(zhì)限定該蛋白的生物功能活性，所以可以在蛋白序列中進行某些氨基酸序列取代，也當然可以在其基本的DNA編碼序列中進行取代，而仍然獲得具有相似性質(zhì)的蛋白。因此，已考慮到可以在所公開的組合物的多肽序列或編碼所述多肽的相應(yīng) DNA序列中進行各種改變，而不會造成所需的功效或活性的明顯損失。表1
錄酸密碼子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG笨丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸IleIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUC CUG CUU蛋氨酸MetMAUG天冬氨酸AsnNAACAAU
脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU谷氨酰胺GlnQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU
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在進行這些改變時，還應(yīng)當考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域內(nèi)普遍理解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用的生物學功能中的重要性(Kyte and Doolittle，1982，通過引用并入本文)。例如，已知氨基酸的相對親水特性與得到的蛋白的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，而該二級結(jié)構(gòu)隨之限定了該蛋白與諸如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等其他分子的相互作用?；诎被岬氖杷院碗姾商匦?，每種氨基酸具有指定的親水指數(shù)(Kyte and Doolittle, 1982)。這些值是異亮氨酸(+4. 5)、纈氨酸(+4. 2)、亮氨酸(+3. 8)、苯丙氨酸(+2.8)、 半胱氨酸(+2. 5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0. 7)、絲氨酸 (-0. 8)、色氨酸(-0. 9)、酪氨酸(-1. 3)、脯氨酸(-1. 6)、組氨酸(-3. 2)、谷氨酸(-3. 5)、谷氨酰胺("3. 5)、天冬氨酸(-3. 5)、天冬酰胺(-3. 5)、賴氨酸(-3. 9)和精氨酸(-4. 5)。本領(lǐng)域內(nèi)已知，某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或評分的其他氨基酸取代， 而仍產(chǎn)生具有相似生物活性的蛋白，即仍獲得生物學功能等同的蛋白。在進行這些改變時， 親水指數(shù)在士2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在士 1以內(nèi)的氨基酸的取代， 并且更特別優(yōu)選的是在士0. 5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。本領(lǐng)域內(nèi)還應(yīng)當理解，可以基于親水性有效地進行相似氨基酸的取代。如美國專利第4，554，101號詳述，已將下述親水性值指定給氨基酸殘基精氨酸(+3. 0)、賴氨酸 (+3. 0)、天冬氨酸(+3.0士1)、谷氨酸(+3.0士1)、絲氨酸(+0. 3)、天冬酰胺(+0. 2)、谷氨酰胺(+0. 2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(_0.5士1)、丙氨酸(-0. 5)、組氨酸(-0. 5)、 半胱氨酸("1. 0)、蛋氨酸(-1. 3)、纈氨酸(-1. 5)、亮氨酸(-1. 8)、異亮氨酸(-1. 8)、酪氨酸 (-2. 3)、苯丙氨酸(-2. 5)、色氨酸(-3. 4)。應(yīng)當理解，氨基酸可以被具有相似親水性值的另一氨基酸取代，且仍獲得生物學上等同的蛋白。在這類改變中，親水性值在士2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在士 1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在士0. 5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。如上文所述，氨基酸取代可以基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對的相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。綜合考慮了上述各種特性的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括精氨酸與賴氨酸、谷氨酸與天冬氨酸、絲氨酸與蘇氨酸、谷氨酰胺與天冬酰胺、以及纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。此外，任何多核苷酸可以被進一步修飾以增加體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻冢?’和/或3’端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或2’ 0-甲基而不是磷酸二酯酶連接；和/或包含非傳統(tǒng)堿基，例如次黃嘌呤核苷、Q核苷(queosine)和懷丁苷，以及乙?；鵢、甲基_、硫代-和其他修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。還可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)的相似性進行氨基酸取代。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸，以及帶有具有相似親水性值的不帶電荷極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ匦透淖兊钠渌被峤M包括(l)ala、pro、gly、glu、asp、 gin、asn> ser> thr ； (2) cys、ser> tyr> thr ； (3) val> ile、leu、met、ala> phe ； (4) lys、arg> his;和(5)phe、tyr、trp、hiS。變體還可以含有非保守型改變或可選擇地含有非保守型改變。在優(yōu)選的實施方案中，變體多肽與天然序列的區(qū)別在于5個或更少的氨基酸的取代、缺失或添加。還可以(或可選擇地)通過例如對多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)具有最小影響的
18氨基酸的缺失或添加來修飾變體。多肽在蛋白的N末端可以包含信號(或前導(dǎo))序列，其在翻譯的同時或在翻譯后指導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移。多肽還可以與連接物或其他序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定 (例如，多聚組氨酸)，或用于增強多肽與固相載體的結(jié)合。例如，多肽可以與免疫球蛋白Fc 區(qū)綴合。當比較多肽序列時，如果兩個序列中的氨基酸序列在如下文所述進行最大對應(yīng)比對時是相同的，則可以認為所述兩個序列是“同一的”。通常通過在比較窗中比較序列來進行兩個序列間的比較，從而鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文所用的“比較窗”是指至少約20個連續(xù)位置、通常30-約75個、40-約50個連續(xù)位置的節(jié)段，其中在將序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位置的參照序列最佳比對后，可以將所述序列與參照序列進行比較。例如，可以使用Lasergene生物信息學軟件套裝中的Megalign程序(DNASTAR， Inc.，Madison, WI)，使用默認參數(shù)，進行用于比較的序列的最佳比對。該程序包括以下參考文獻中描述的數(shù)種比對方案Dayhoff，M. 0. (1978)A model of evolutionary change in Proteins-Matrices for detecting distant relationships (蛋白質(zhì)白勺進化改變模型-用于檢驗遠距離關(guān)系的矩陣)Jn Dayhoff, M. 0. (ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure (蛋白質(zhì)禾口結(jié)構(gòu)圖譜)，National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl.3, pp. 345-358 ；Hein J. (1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes (比對和系統(tǒng)發(fā)生的標準方法)pp. 626-645Methods in Enzymology (酶學方法)vol. 183, Academic Press, Inc. , San Diego, CA ；Higgins, D. G. and Sharp,P. M. (1989)CABIOS 5 :151-153 ；Myers,E. W. and Muller W. (1988)CABIOS 4 :11-17 ； Robinson, E. D. (1971)Comb. Theor 11 105 ；Santou, N. Nes, Μ. (1987)Mol. Biol. Evo 1. 4 406-425 ；Sneath,P. H. A. and Sokal,R. R. (1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy (數(shù)值分類法-數(shù)值分類法的原理和實踐)，F(xiàn)reeman Press,San Francisco,CA ；Wilbur,W. J. and Lipman,D. J. (1983)Proc. Nat' 1 Acad. ,Sci. USA 80 :726-730?？蛇x擇地，可以通過以下來進行用于比較的序列的最佳比對Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2 :482 的局部同一性算法、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443 的同一性比對算法、Pearson and Lipman(1988)Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 85 J444的相似性方法搜索、這些算法的計算機執(zhí)行(Wisconsin遺傳學軟件包中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr.，Madison, WI)、或檢查。適于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST 2. O 算法，其分別描述于 Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25 :3389_；3402 和 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410中。例如，可以按照本文所述的參數(shù)使用BLAST和 BLAST 2.0，從而確定本發(fā)明多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)可以公開獲得進行 BLAST 分析的軟件。對于氨基酸序列而言，可以將評分矩陣用于計算累積評分。在以下情況時停止每個方向的字符命中延伸當累積比對評分從其最大達到的值下降量X時；由于一個或多個負評分殘基比對的累積而使累積評分達到O或低于O時；或達到任一序列的末端時。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了所述比對的靈敏度和速度。在一個示例性方法中，通過在至少20個位置的比較窗中比較兩個最佳比對的序列來確定“序列同一性百分比”，其中，與用于兩個序列最佳比對的參照序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中的多肽序列的一部分可以包含20%或更少的、通常為5%-15%、 或10% -12%的添加或缺失(S卩，空位)。通過以下來計算百分比確定兩個序列中都存在的相同氨基酸殘基的位置數(shù)量來產(chǎn)生配對位置數(shù)，將配對位置數(shù)除以參照序列中(即窗的大小)的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了融合多肽和編碼融合多肽的多核苷酸。融合多肽是指直接地或間接地通過氨基酸連接物共價連接于一個或多個異源多肽序列(融合伴侶)的本發(fā)明的AspRS多肽。形成融合蛋白的多肽通常是將C末端連接至N末端，但是它們也可以是C末端連接至C末端、N末端連接至N末端、或N末端連接至C末端。融合蛋白的多肽可以為任何順序?？梢詾榱藥缀跞魏嗡枘康脑O(shè)計并包括融合伴侶，只要它們對多肽所需的活性沒有不利影響。例如，在一個實施方案中，融合伴侶包含有助于以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量表達蛋白的序列(表達增強子)。可以選擇另外的融合伴侶以增加蛋白的溶解性或使蛋白被靶向所需的細胞內(nèi)區(qū)室。其他融合伴侶包括促進蛋白純化的親和性標簽。更一般地，可以利用與諸如Fc片段的異源序列的融合來去除AspRS多肽的不需要的特性或改善AspRS多肽所需的特性(例如，藥物動力學特性)。例如，與異源序列的融合可以增加AspRS多肽的化學穩(wěn)定性、降低免疫原性、改善體內(nèi)靶向和/或增加循環(huán)半衰期。與異源序列的融合還可以用于產(chǎn)生雙功能融合蛋白，例如不僅通過AspRS多肽具有選擇的非常規(guī)活性，而且還能夠通過異源多肽修飾(即，刺激或抑制)其他途徑的雙功能蛋白。這些途徑的實例包括，但不限于，多種免疫系統(tǒng)相關(guān)的途徑，諸如先天或獲得性免疫激活途徑，或者細胞生長調(diào)節(jié)途徑，諸如血管生成作用。在某些方面，異源多肽可以與AspRS 多肽協(xié)同作用以調(diào)節(jié)個體中的細胞途徑?？梢杂糜谏呻p功能融合蛋白的異源多肽的實例包括，但不限于，促血小板生成素、細胞因子(例如，IL-11)、趨化因子和多種造血生長因子，以及以上的生物活性片段和/或變體。通常可以用標準技術(shù)制備融合蛋白。例如，可以分別組裝編碼所需融合的多肽組分的DNA序列，并將其連入合適的表達載體中。使用或不使用肽連接物將編碼一種多肽組分的DNA序列的3'端與編碼第二多肽組分的DNA序列的5'端連接，使得序列的讀碼框是同相的。這允許翻譯為同時保留兩個組分多肽的生物活性的單一融合蛋白。如果需要，可以用肽連接物序列將第一和第二多肽組分隔開足以確保每種多肽能折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)的距離。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的標準技術(shù)將這類肽連接物序列并入融合蛋白?？梢曰谙率鲆蛩剡x擇某些肽連接物連接物序列(1)它們采取柔韌的、伸展的構(gòu)型的能力；(2)它們不會采取與第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)的能力；和⑶可以與所述多肽功能表位反應(yīng)的疏水或帶電殘基的缺乏。優(yōu)選的肽連接物序列包含Gly、Asn和Ser殘基。諸如Thr和Ala的其他接近中性的氨基酸也可以用于連接物序列中?？梢杂行У赜米鬟B接物的氨基酸序列包括公開于Maratea et al. , Gene 40: 39 46(1985) ；Murphy et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262(1986)；美國專利第4，935，233號和第4，751，180號中的那些氨基酸序列。通常，連接物序列的長度可以為1-約50個氨基酸。當?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌梢杂脕砀糸_功能結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N末端氨基酸區(qū)時，不需要連接物序列。將連接的DNA序列可操作地連接于合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。負責DNA表達的調(diào)節(jié)元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'。類似地，需要結(jié)束翻譯和轉(zhuǎn)錄終止信號的終止密碼子僅存在于編碼第二多肽的DNA序列的3'。通常，多肽和融合多肽(以及它們的編碼多核苷酸)是分離的?！胺蛛x的”多肽或多核苷酸是從其原始環(huán)境中移出的多肽或多核苷酸。例如，如果將天然存在的蛋白與天然系統(tǒng)中的部分或所有的共存物質(zhì)分開，則該天然存在的蛋白是分離的。優(yōu)選地，這類多肽是至少約90%純的，更優(yōu)選為至少約95%純的和最優(yōu)選為至少約99%純的。例如，如果多核苷酸被克隆入不是天然環(huán)境的一部分的載體中，則認為所述多核苷酸是分離的。在其他的實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽可以是二聚體的一部分。二聚體可以包括，例如，兩個相同AspRS多肽之間的同二聚體、兩個不同AspRS多肽(例如，全長AspRS 多肽和截短的AspRS多肽或兩個不同的截短的AspRS多肽)之間的異二聚體、和/或AspRS 多肽和異源多肽之間的異二聚體。單體和/或二聚體可以是可溶的，并且可以被分離為或純化為同質(zhì)性。諸如AspRS多肽和異源多肽之間的異二聚體的某些異二聚體可以是雙功能的。還包括AspRS多肽的單體，包括分離的AspRS單體，所述分離的AspRS單體無論是否由于一個或多個取代、截短、缺失、添加、或化學修飾或這些改變的組合，都基本上不與它們自己二聚化(同源二聚化)或與第二種AspRS多肽二聚化(異源二聚化)。在某些實施方案中，單體AspRS多肽具有生物活性，包括二聚體或多聚體AspRS多肽復(fù)合物不具有的非常規(guī)活性。在其他的實施方案中，本發(fā)明的AspRS多肽可以是多單元復(fù)合物的一部分。本發(fā)明的多單元復(fù)合物可以包括，例如，至少2、3、4、或5或更多的單體。本發(fā)明的單體和/或多單元復(fù)合物可以是可溶的，并且可以被分離為或純化為同質(zhì)性。多單元復(fù)合物的單體單元彼此之間可以是不同的、同源的、基本上同源的或相同的。然而，本發(fā)明的多單元復(fù)合物包括至少1個單體，所述單體包含如本發(fā)明所述的一種AspRS多肽或在其他的實施方案中，包含至少兩種或更多種如本文所述的AspRS多肽。共價連接的單體可以是直接(通過鍵)連接的或間接(例如，通過連接物)連接的。為了直接連接本文的多肽單體，修飾本文的多肽以增強二聚化可能是有益的。例如，可以通過一個或多個半胱氨酸的添加或取代來修飾AspRS多肽的一個或多個氨基酸殘基。產(chǎn)生諸如半胱氨酸取代的氨基酸取代或其他修飾來促進連接的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。如本文所述，本發(fā)明的某些實施方案還考慮修飾的AspRS多肽的用途，包括改善 AspRS多肽所需特性的修飾。本發(fā)明AspRS多肽的示例性修飾包括，但不限于，一個或多個組成氨基酸的化學和/或酶促衍生作用，包括側(cè)鏈修飾、主鏈修飾和N末端與C末端修飾，這些修飾包括乙?；⒘u基化、甲基化、酰胺化；和碳水化合物或脂質(zhì)部分、輔因子等的連接。示例性修飾還包括AspRS多肽的聚乙二醇化(參見，例如，Veronese and Harris, Advanced Drug Delivery Reviews (藥物遞送發(fā)展綜述)54 :453-456, 2002，其通過引用的方式并入本文)。
在某些方面，可以利用化學選擇性連接技術(shù)來修飾本發(fā)明截短的AspRS多肽，諸如通過以位點特異性和受控的方式連接聚合物。這種技術(shù)通常依賴于通過化學的或重組方式將化學選擇性錨定物并入蛋白骨架，以及用攜帶互補連接物的聚合物進行隨后的修飾。 因此，可以控制組裝過程和產(chǎn)生的蛋白-聚合物綴合物的共價結(jié)構(gòu)，這使得諸如功效和藥物代謝動力學特性的藥物性質(zhì)的合理優(yōu)化成為可能(參見，例如，Kochendoerfer, Current Opinion in Chemical Biology 9:555-560,2005)。本文所述的AspRS多肽可以通過本領(lǐng)域人員已知的任何合適的方法制備，例如通過重組技術(shù)。例如，AspRS多肽可以通過包括下述步驟的方法來制備(a)制備包含多核苷酸序列的構(gòu)建體，該多核苷酸序列編碼AspRS多肽并被可操作地連接到調(diào)節(jié)元件；(b) 將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞；(c)培養(yǎng)宿主細胞以表達AspRS多肽；以及(d)從宿主細胞分離 AspRS多肽。利用以下所述的標準方案方便地制備重組AspRS多肽例如Sambrook，et al.，(1989，同上)，特別是 16 和 17 節(jié)；Ausubel et al.，(1994，同上)，特別是 10 和 16 章；以及 Coligan et al. , Current Protocols in Protein Science (John ffiley&Sons, Inc. 1995-1997)，特別是第 1、5 和 6 章。除了重組產(chǎn)生方法，還可以通過使用固相技術(shù)的直接肽合成來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽及其片段(Merrifield，J. Am. Chem. Soc. 85 :2149-2154 (1963))?？梢杂檬謩蛹夹g(shù)或通過自動化來進行蛋白合成。例如，可以用Applied Biosystems的431A肽合成儀(Perkin Elmer) 實現(xiàn)自動化合成。可選擇地，不同的片度可以分別通過化學方式合成并利用化學方法進行組合以制備所需的分子。多核苷酸組合物本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明AspRS多肽的分離的多核苷酸，以及包含這些多核苷酸的組合物。如本文所述，本發(fā)明的AspRS多核苷酸還包括引物、探針、反義寡核苷酸和RNA 干擾劑，所述引物、探針、反義寡核苷酸和RNA干擾劑包含AspRS參照多核苷酸的全部或一
部分、它們與這些參照多核苷酸的全部或一部分互補或者與這些參照多核苷酸特異性雜 、-父。如本文所用的術(shù)語“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”是指從具體物種的總基因組DNA 分離出來的DNA分子。因此，編碼多肽的DNA節(jié)段是指這樣的DNA節(jié)段，其含有一種或多種編碼序列，而基本上從獲得所述DNA節(jié)段的物種的總基因組DNA分離出來或純化出來。術(shù)語“DNA節(jié)段”和“多核苷酸”包括DNA節(jié)段和這些節(jié)段的較小片段，并且還包括重組載體， 包括例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、噬菌體、病毒等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的多核苷酸序列可以包括基因組序列、基因組外序列和質(zhì)粒編碼的序列以及表達或被改造來表達蛋白、多肽、肽等的較小的工程基因節(jié)段。這類節(jié)段可以是天然分離的，或人工合成修飾的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識的，多核苷酸可以是單鏈(編碼的或反義的)或雙鏈的， 以及可以是DNA(基因組的、cDNA或合成的)或RNA分子。其他編碼或非編碼序列可以，但不需要，存在于本發(fā)明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不需要，與其他的分子和/或支持物質(zhì)連接。多核苷酸可以包含天然序列(即，編碼AspRS或其部分的內(nèi)源序列)，或可以包含變體，或該序列的生物學功能等同物。如下面進一步論述，多核苷酸變體可以包含一個或多
22個取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選使得所編碼的多肽的所需活性相對于未修飾的多肽沒有顯著減弱。通常，可以按本文所述來評價對于所編碼的多肽的活性的影響。在其他的實施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包含與天冬氨酰-tRNA 合成酶相同或互補的序列的不同長度的連續(xù)區(qū)段，其中所述分離的多核苷酸編碼本文所述的AspRS。例如，本發(fā)明提供的多核苷酸編碼至少約100、150、200、250、300、350、400、450或 500或更多個本發(fā)明AspRS多肽的連續(xù)氨基酸殘基，以及所有的中間長度。應(yīng)當容易理解， 此處的“中間長度”表示所提到的值之間的任何長度，例如101、102、103等；151、152、153 等；201,202,203 等。本發(fā)明的多核苷酸，不管其編碼序列自身的長度，可以與其他DNA序列組合，所述其他DNA序列例如啟動子、聚腺苷化信號、其他限制性酶切位點、多克隆位點、其他編碼節(jié)段等，使得它們的總長度可以顯著不同。因此可以考慮，可以利用幾乎任意長度的多核苷酸片段，總長度優(yōu)選地受在計劃的重組DNA流程中制備和使用的便利性的限制。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，由于遺傳密碼的簡并性，有很多核苷酸序列編碼本文所述的多肽。這些多核苷酸中的某些與任何天然基因的核苷酸序列具有低的同源性。雖然如此，本發(fā)明特別考慮到由于密碼子使用中的差異而不同的多核苷酸，例如，為人和/或靈長類動物密碼子選擇而優(yōu)化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。等位基因是由于一個或多個諸如核苷酸的缺失、添加和/或取代的突變而改變的內(nèi)源基因。所得到的mRNA和蛋白可以，但不需要，具有改變的結(jié)構(gòu)或功能?？梢杂脴藴始夹g(shù)鑒定等位基因(例如雜交、擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)?？梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的多種公認的技術(shù)中的任何一種來制備、操控和/或表達多核苷酸及其融合物。例如，編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其融合蛋白或功能等同物可以用于重組DNA分子中以指導(dǎo)AspRS多肽在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_。由于遺傳密碼子固有的簡并性，可以產(chǎn)生編碼基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他 DNA序列，并且這些序列可以用于克隆和表達給定的多肽。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解地，在一些情況下，產(chǎn)生具有非天然存在的密碼子的編碼多肽的核苷酸序列是有利的。例如，可以選擇特定原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子以增加蛋白表達速率或以產(chǎn)生具有所需特性的重組RNA轉(zhuǎn)錄本，所述所需特性例如半衰期長于從天然存在序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的半衰期。此外，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法改造本發(fā)明的多核苷酸序列，從而為了多種原因改變多肽編碼序列的多核苷酸，包括但不限于修飾基因產(chǎn)物的克隆、加工、表達和/或活性的改變。為了表達所需的多肽，可以將編碼多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合適的表達載體中，即包含插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建含有編碼目的多肽的序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、以及體內(nèi)遺傳重組。這些技術(shù)描述
Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual ()
(1989)禾口 Ausubel et al. ,Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學技術(shù))(1989)中。多種表達載體/宿主系統(tǒng)是已知的，并且可以用來包含和表達多核苷酸序列。這些表達載體/宿主系統(tǒng)包括但不限于，諸如用重組噬菌體、質(zhì)粒、或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌的微生物；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒TMV)或用細菌表達載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)，例如基于病毒的表達系統(tǒng)。表達載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是與宿主細胞蛋白相互作用來進行轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體的那些非翻譯區(qū)(增強子、啟動子、5'和3'非翻譯區(qū))。這些元件在它們的強度和特異性上可以不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。例如，當在細菌系統(tǒng)克隆時，可以使用誘導(dǎo)型啟動子，例如 PBLUESCRIPT 噬菌粒(Stratagene，La Jolla, Calif.)或 SPORTl 質(zhì)粒(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)的雜合IacZ啟動子等。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。如果生成包含編碼多肽的序列的多個拷貝的細胞系是必需的，則基于SV40或EBV的載體可以有利地與適當?shù)倪x擇標志物一起使用。也可以使用特定的起始信號來實現(xiàn)編碼目的多肽的序列的更高效的翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。如果將編碼多肽的序列、其起始密碼子和上游序列插入合適的表達載體中，則可以不需要其他的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號。然而，如果僅將編碼序列或其一部分插入，則應(yīng)該提供包括ATG起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯控制信號。此外，起始密碼子應(yīng)該在正確的讀碼框中以確保全部插入物的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是不同來源的，可以是天然的或合成的?？梢酝ㄟ^包含適于所用的特定細胞系統(tǒng)的增強子來增強表達效率，諸如文獻中描述的那些增強子(Scharf et al. , Results Probl. Cell Differ. 20 125-162(1994))。此外，可以基于宿主細胞株調(diào)節(jié)插入的序列的表達或以所需的方式加工所表達的蛋白的能力來選擇宿主細胞株。多肽的這些修飾包括但不限于，乙?；?、羧基化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和?；?。切割蛋白的“前原(Pr印ro)”形式的翻譯后加工也可以用來促進正確的插入、折疊和/或功能?？梢赃x擇諸如CHO、HeLa, MDCK, HEK293和W138的、對于這類翻譯后活性具有特異性的細胞體系和特征機制的不同宿主細胞，以確保外源蛋白的正確修飾和加工。為了長期、高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白，通常優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，可以用表達載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達目的多核苷酸的細胞系，所述表達載體可以在同一載體或分別的載體上含有病毒復(fù)制起點和/或內(nèi)源表達元件以及選擇標記基因。引入載體后，在將細胞轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基之前，可以允許細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天。選擇標記的目的是賦予對于選擇的抗性，并且選擇標記的存在允許成功表達引入的序列的細胞的生長和恢復(fù)?？梢杂眠m合細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞的抗性克隆?？梢杂萌魏螖?shù)量的選擇系統(tǒng)來恢復(fù)轉(zhuǎn)化的細胞系。這些選擇系統(tǒng)包括，但不限于，可以分別用于tk-或aprt-細胞中的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler et al. , Cell 11 :223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy et al.，Cell 22 :817-823(1990)) 基因。另外，抗代謝物、抗生素或除草劑抗性可以作為選擇的基礎(chǔ)；例如，提供甲氨蝶呤抗性的 dhfr (Wigler et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 77 :3567-70(1980))；提供對氨基糖苷類、新霉素和 G-418 抗性的 npt (Colbere-Garapin et al.，J. MoI. Biol. 50 1-14(1981))；以及分別提供對氯磺隆和草丁膦(phosphinotricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性的 als gJc pat (Murry,同)。用于檢測和測量多核苷酸編碼的產(chǎn)物的表達的多種方法是本領(lǐng)域已知的，所述方法利用本領(lǐng)域已知的對所述產(chǎn)物特異的多克隆或單克隆抗體。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光活化的細胞分選(FACS)。在Hampton et al.， Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)禾口 Maddox et al.，J. Exp. Med. 158 1211-1216(1983)中以及其他地方描述了這些和其他測定。廣泛多種的標記和綴合技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以用于各種核酸和氨基酸測定中。制備用于檢測多核苷酸相關(guān)序列的標記的雜交或PCR探針的方法包括寡核苷酸標記、缺口平移、末端標記或利用標記的核苷酸的PCR擴增?？蛇x擇地，可以將序列或其任何一部分克隆入載體中，用于產(chǎn)生mRNA探針。這種載體在本領(lǐng)域是已知的，并且可以商購，并且可以通過添加諸如T7、T3或SP6的合適的RNA聚合酶和標記的核苷酸來體外合成RNA探針?？梢允褂枚喾N可商業(yè)購得的試劑盒進行這些步驟。可以使用的合適的報告分子或標記物包括放射性核素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑或產(chǎn)色劑以及底物、輔因子、抑制劑、 磁性顆粒等?？梢栽谶m合蛋白從細胞培養(yǎng)物中表達和回收的條件下，培養(yǎng)用目的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。根據(jù)所用的序列和/或載體，重組細胞產(chǎn)生的蛋白可以是分泌的或包含在細胞內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以將包含本發(fā)明多核苷酸的表達載體設(shè)計為包含指導(dǎo)編碼的多肽通過原核生物或真核生物細胞膜分泌的信號序列?？梢杂闷渌闹亟M構(gòu)造將編碼目的多肽的序列連接至編碼促進可溶蛋白純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。按照本發(fā)明的另一方面，可以例如使用基因治療技術(shù)將編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸體內(nèi)遞送至個體。基因治療通常是指將異源核酸轉(zhuǎn)移至患有該治療所針對的病癥或疾病狀態(tài)的哺乳動物，尤其是人的某些細胞、靶細胞。以下述方式將核酸引入選擇的靶細胞，使得異源DNA表達并從而產(chǎn)生所編碼的治療產(chǎn)物。如本文所教導(dǎo)的能用于基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)，或優(yōu)選地諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA病毒。優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠或鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物或是慢病毒載體。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體?？梢圆迦雴我煌庠椿虻哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體的實例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒 (MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和勞氏肉瘤病毒(RSV)。多種其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以并入多個基因。所有的這些載體能轉(zhuǎn)移或并入選擇性標志物基因，以便鑒定和產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的細胞。例如，通過將來源于鋅指的DNA結(jié)合目的多肽序列以及編碼對于特異性靶細胞上的受體的配體的另一基因插入病毒載體，可以使所述載體成為靶標特異性的。例如，通過插入編碼蛋白(二聚體)的多核苷酸，可以使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成為靶標特異性的。通過使用抗體來靶向于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以實現(xiàn)示例性的靶向。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道或利用有限的實驗就能容易確定具體的多核苷酸序列，所述具體的多核苷酸序列能被插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中，從而允許含有鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的靶標特異性遞送。由于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是缺陷型的，所以它們需要輔助以產(chǎn)生感染性載體顆粒。例
25如，可以通過使用輔助細胞系來提供該輔助，所述輔助細胞系含有編碼在LTR中的調(diào)節(jié)序列控制下的所有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒缺少能使包裝機制識別用于封裝的 RNA轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列。缺失包裝信號的輔助細胞系包括但不限于，例如PSI. 2、PA317和 PA12。由于未包裝基因組，所以這些細胞系產(chǎn)生空的病毒體。如果將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入包裝信號完整的這類細胞中，而用其他目的基因替代結(jié)構(gòu)基因，則所述載體可以被包裝并可以產(chǎn)生載體病毒體。通過該方法產(chǎn)生的載體病毒體隨后可以用來感染諸如NIH 3T3細胞的組織細胞系，以產(chǎn)生大量嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒體。也能使用用于基因治療的“非病毒”遞送技術(shù)，包括，例如，DNA-配體復(fù)合物、腺病毒-配體-DNA復(fù)合物、DNA的直接注射、CaPO4沉淀、基因槍技術(shù)、電穿孔、脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染等。這些方法中的任何一種對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可廣泛獲得的，并適于用在本發(fā)明中。其他合適的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可獲得的，并且應(yīng)當理解，可以使用可獲得的任何轉(zhuǎn)染方法來實現(xiàn)本發(fā)明。通過將分離的DNA分子封裝于脂質(zhì)體顆粒中并將該脂質(zhì)體顆粒與靶細胞的細胞膜接觸，能實現(xiàn)脂轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體是自我組裝的膠體顆粒，其中由諸如磷脂酰絲氨酸或磷脂酰膽堿的兩性分子組成的脂質(zhì)雙分子層封裝了周圍介質(zhì)的一部分，這樣所述脂質(zhì)雙分子層包圍了親水內(nèi)部。可以這樣構(gòu)建單層或多層脂質(zhì)體，使得內(nèi)部含有所需的化學品、藥物或本發(fā)明中的分離的DNA分子。某些實施方案包括在下文所述的嚴緊條件下能與參照AspRS多核苷酸序列或它們的互補物雜交的多核苷酸互補物。如本文使用的，術(shù)語“低嚴緊、中等嚴緊、高嚴緊或極高嚴緊條件下的雜交”描述了用于雜交和洗滌的條件。進行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可以見于Ausubel et al. , (1998，同上)，第6. 3. 1-6. 3. 6節(jié)。在該參考文獻中描述了水性和非水性方法，可以使用任一種。本文參考的低嚴緊條件包括以及涵蓋用至少約ν/ν-至少約15% ν/ν的甲酰胺，和至少約IM-至少約2Μ鹽在42°C雜交；以及用至少約IM-至少約2M鹽在42°C洗滌。 低嚴緊條件還可以包括用牛血清白蛋白(BSA)、lmM EDTA、0. 5M NaHPO4(pH 7. 2),7% SDS在65°C雜交，以及用(i)2XSSC、0. SDS，或(ii)0. 5% BSAUmM EDTA、40mMNaHP04(pH 7. 2)、5% SDS在室溫洗滌。低嚴緊條件的一個實施方案包括在約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，隨后至少在50°C (對于低嚴緊條件，洗滌的溫度可以提高到55°C) 下，在0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗滌兩次。中等嚴緊條件包括和涵蓋用至少約16% ν/ν-至少約30% ν/ν的甲酰胺和至少約0. 5Μ-至少約0. 9Μ的鹽在42°C雜交，以及用至少約0. IM-至少約0. 2M鹽在55°C洗滌。 中等嚴緊條件還可以包括用牛血清白蛋白(BSA)、lmM EDTA、0. 5M NaHPO4(pH 7. 2),7% SDS 在 65°C 雜交，以及用(i)2XSSC、0. 1%SDS ；或(ii)0. 5% BSAUmM EDTA、40mMNaHP04 (pH 7. 2)、5% SDS在60-65°C洗滌。中等嚴緊條件的一個實施方案包括在約45°C下在6 X SSC中雜交，隨后在60°C下，在0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗滌一次或多次。高嚴緊條件包括和涵蓋用至少約31% ν/ν-至少約50% ν/ν的甲酰胺和至少約0. OlM-至少約0. 15Μ的鹽在42°C 雜交，以及用約0. OlM-約0. 02M的鹽在55°C洗滌。高嚴緊條件還可以包括用BSAUmM EDTA、0. 5M NaHP04(pH7. 2)、7% SDS在65°C 雜交，以及用(i)0. 2XSSC、0. 1% SDS ；或(ii)0. 5% BSAUmM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7. 2)、
SDS在超過65°C的溫度下洗滌。高嚴緊條件的一個實施方案包括在約45°C下在6 X SSC中雜交，隨后在65°C下，在0.2XSSC、0. 1% SDS中洗滌一次或多次。極高嚴緊條件的一個實施方案包括用0. 5M磷酸鈉、7% SDS在65°C雜交，隨后在在65°C下，在0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗滌一次或多次。本領(lǐng)域熟知其他嚴緊條件，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到能夠操縱多種因素來優(yōu)化雜交的特異性。最后洗滌的嚴緊性優(yōu)化可以確保高度的雜交。對于具體的實例，參見 Ausubel et al,同上，在第 2. 10. 1 至 2. 10. 16 頁以及 Sambrook et al. (1989，同上)的第 1. 101 至 1. 104 節(jié)。盡管嚴緊洗滌通常在約42°C至68°C的溫度下進行，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，其他溫度可以適用于嚴緊條件。最大雜交速率通常發(fā)生在低于1約201至25°C下以形成DNA-DNA雜合體。本領(lǐng)域公知，Tm是解鏈溫度，或者是兩條互補的多核苷酸序列分離的溫度。用于估算Tm的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見Ausubel et al.，同上在第2. 10. 8頁)。通常，完美匹配的DNA雙螺旋的Tm可以根據(jù)以下公式近似預(yù)測Tm = 81. 5+16. 6 (Iog10M) +0. 41(% G+C) -0. 63 (% 甲酰胺)-(600/ 長度)，其中M 是 Na+ 的濃度， 范圍優(yōu)選為0. 01摩爾至0. 4摩爾；％ G+C是鳥嘌呤和胞嘧啶堿基之和占堿基總數(shù)的百分比，在30%至75% G+C的范圍內(nèi)；％甲酰胺是甲酰胺濃度的體積百分比；長度是DNA雙螺旋中堿基對的數(shù)目。隨機錯配的堿基對的數(shù)目每增加1%，雙股DNAW Tm降低約1°C。對于高嚴緊條件，一般在Tm-15°C下進行洗滌，或?qū)τ谥械葒谰o條件，在Tm-3(TC下進行洗滌。在雜交方案的一個實例中，將包含固定的DNA的膜(例如，硝酸纖維素膜或尼龍膜)在含有標記的探針的雜交緩沖液(50%去離子甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt' s溶液 (0. 聚蔗糖、0. 聚乙烯吡咯烷酮和0. 牛血清白蛋白)、0. 1% SDS和200mg/mL變性的鮭魚精子DNA)中于42°C下過夜雜交。然后將膜進行兩次相繼的中等嚴緊洗滌(即，用 2XSSC、0. 1% SDS，在45°C下進行15分鐘；隨后是用2XSSC、0. 1% SDS，在50°C下進行15 分鐘)，隨后是兩次相繼的更高的嚴緊洗滌(即，用0. 2XSSC、0. 1% SDS，在55°C下進行12 分鐘；隨后是用0. 2 X SSC和0. 1% SDS溶液，在65-68°C下進行12分鐘)。本發(fā)明的實施方案還包括無論是用于檢測、擴增、反義治療還是其他目的的寡核苷酸。為了這些和相關(guān)的目的，術(shù)語“寡核苷酸(oligonucleotide)”或“寡核苷酸(oligo) ” 或“寡聚體”意圖包括單數(shù)形式的“寡核苷酸”以及復(fù)數(shù)形式的“寡核苷酸”，并且是指能在本發(fā)明的擴增方法中以及隨后的檢測方法中用作試劑的兩個或更多個核苷酸、核苷、核堿基或相關(guān)化合物的任何聚合物。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA和/或它們的類似物。術(shù)語寡核苷酸并不用必須指出該試劑的任何特定功能，而是僅一般地用于覆蓋本文所述的所有這類試劑。寡核苷酸可以具有多種不同的功能，例如如果寡核苷酸能夠與互補鏈雜交并在核酸聚合酶的存在下能被進一步延伸，則它可以起引物的作用，如果寡核苷酸包含能被RNA聚合酶識別的序列并允許轉(zhuǎn)錄，則它起啟動子的作用，如果適當放置和/或修飾，它可以起防止雜交或妨礙引物延伸的作用。寡核苷酸可以起探針或反義試劑的作用。 寡核苷酸實際上可以是任何長度的，該長度僅受其具體的作用所限，例如在擴增反應(yīng)中、在檢測擴增反應(yīng)的擴增產(chǎn)物中或在反義或RNA干擾應(yīng)用中的作用。本文所述的任何寡核苷酸可以用作引物、探針、反義寡聚體或RNA干擾劑。本文所用的術(shù)語“引物”是指在由諸如緩沖液和溫度所限定的合適的條件下，在四種不同的核苷三磷酸和諸如DNA或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的聚合試劑的存在下，能夠作為模板指導(dǎo)的DNA合成的起始位點的單鏈寡核苷酸。在任何給定的情況下，引物的長度取決于例如引物的預(yù)期用途，并且范圍通常為約15-30個核苷酸，但是可以使用更短和更長的引物。短引物分子通常需要更低的溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不需要反映模板的確切序列，但必須足夠互補以便與該模板雜交。引物位點是模板上與引物雜交的區(qū)域。引物對是一組引物，包括與待擴增的序列的5’端雜交的5’上游引物和與待擴增的序列的3’端的互補物互補物雜交的3’下游引物。本文所用的術(shù)語“探針”是指可以被特定靶標識別的表面固定的分子。參見，例如， 以美國專利第6，582，908號為例展示具有10、12和更多堿基的探針的所有可能組合。本文所用的探針和引物通常包含已知序列的至少12-15個連續(xù)核苷酸。為了增強特異性，還可以使用更長的探針和引物，例如包含AspRS參照序列或其互補物的至少20、25、30、40、50、 60、70、80、90、100或至少150個核苷酸的探針和引物。探針和引物可以顯著長于這些實例， 并且應(yīng)當理解可以使用由本領(lǐng)域知識以及本說明書，包括表格、圖和序列表支持的任何長度。制備和使用探針和引物的方法描述于參考文獻中，例如Sambrook，J. et al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，2. sup. nd ed. , vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N. Y. ；Ausubel, F. Μ. et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù))，Greene Publ. Assoc. &ffiley-lntersciences, New York N. Y. ；Innis, Μ. et al. (1990)PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR 實驗技術(shù)，方法和應(yīng)用指南)，Academic Press, San Diego Calif。PCR引物對可以來源于已知序列，例如通過使用用于該目的的計算機程序，例如 Primer (0. 5 版，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge Mass)?？梢允褂妙I(lǐng)域內(nèi)已知的軟件選擇用作引物或探針的寡核苷酸。例如，0LIG0 4.06 軟件用于選擇每條高達100個核苷酸的PCR引物對，和用于分析寡核苷酸和來自高達321Λ 的輸入多核苷酸序列的高達5，000個核苷酸的更大的多核苷酸。Primerf引物選擇程序 (可從 Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge Mass 公開獲得)允許使用者輸入“引物錯配庫(mispriming library) ”，其中避免作為引物結(jié)合位點的序列由使用者指定。通過上述任何選擇方法鑒定的寡核苷酸和多核苷酸片段可用于雜交技術(shù)中，例如，用作PCR或測序引物、微陣列元件或特異性探針以鑒定核酸樣品中完全或部分互補的多核苷酸。寡核苷酸選擇的方法不限于本文所述的那些方法。 術(shù)語“反義寡聚體”或“反義化合物”或“反義寡核苷酸”可交換地使用，并且是指每個均攜帶堿基配對部分的環(huán)狀亞單元序列，其通過亞單元間的鍵而連接，所述亞單元間的鍵允許堿基配對部分通過Watson-Crick堿基配對與核酸(通常是RNA)中靶序列雜交， 從而在靶序列中形成核酸寡聚體異源雙螺旋，并通常以此防止該RNA的翻譯。還包括使用它來調(diào)節(jié)選擇的AspRS轉(zhuǎn)錄本和/或其相應(yīng)的多肽的表達的方法，所述選擇的AspRS轉(zhuǎn)錄本例如剪接變體或蛋白水解片段。 反義寡核苷酸可以包含約8-40個亞單元，通常約8-25個亞單元，并優(yōu)選約12_25 個亞單元。在某些實施方案中，寡核苷酸可以具有與靶序列精確互補的序列或如下文所定義的接近互補的序列。在某些實施方案中，靶標和反義靶向序列之間互補的程度足以形成
28穩(wěn)定的雙螺旋。反義寡聚體與靶RNA序列之間互補的區(qū)域可以短至8-11個堿基，但優(yōu)選 12-15個堿基或更多，例如12-20個堿基，或12-25個堿基，包括這些范圍之間的所有整數(shù)。 約14-15個堿基的反義寡聚體通常是足夠長的，從而使之在靶向于選擇的AspRS轉(zhuǎn)錄本時具有唯一的互補序列。在某些實施方案中，長達40個堿基的反義寡聚體可以是合適的，其中至少有例如 10-12個堿基的最少堿基數(shù)與靶序列互補。然而，通常小于約30的寡聚體長度被優(yōu)化為易于向細胞內(nèi)攝取或主動向細胞內(nèi)攝取。對于下文進一步描述的某些寡聚體，結(jié)合穩(wěn)定性和攝取的最佳平衡通常發(fā)生在18-25個堿基的長度。包括由約10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個堿基組成的反義寡聚體(例如PNA、LNA、2，-0Me、M0E、嗎啉代)，其中至少約6、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或40個連續(xù)或非連續(xù)堿基與它們的AspRS靶序列或其變體互補。在某些實施方案中，反義寡聚體可以與AspRS核酸靶序列100%互補，或其可以包含錯配，例如，以適應(yīng)變體，只要在寡聚體和AspRS核酸靶序列之間形成的異源雙螺旋能足以穩(wěn)定地耐受細胞核酸酶的作用和體內(nèi)可能發(fā)生的其它降解模式。下文討論了不易受核酸酶切割的寡聚體主鏈。如果存在錯配，相對于雜合體雙螺旋的中間區(qū)域，其對末端區(qū)域產(chǎn)生的不穩(wěn)定影響較小。根據(jù)雙螺旋穩(wěn)定性的公知原則，允許錯配的數(shù)目將取決于寡聚體的長度，雙螺旋中G C堿基對的百分比，和雙螺旋中錯配的位置。盡管這樣的反義寡聚體沒有必要與AspRS核酸靶序列100%互補，但是其對于與靶序列穩(wěn)定且特異性地結(jié)合，從而調(diào)節(jié)核酸靶標的生物活性，例如AspRS蛋白的表達是有效的。寡聚體和靶序列之間形成的雙螺旋的穩(wěn)定性是結(jié)合Tm和雙螺旋對細胞酶促切割的敏感性的函數(shù)。反義寡核苷酸與互補序列RNA的Tm可以通過常規(guī)方法測量，例如描述于 Hames et al. ， Nucleic Acid Hybridization (), IRL Press, 1985, pp. 107-108 或描述于 Miyada C. G. and Wallace R. B. ,1987, Oligonucleotide hybridization techniques (寡核苷酸雜交技術(shù))，Methods Enzymo 1. Vol. 154 pp. 94-107.中的那些方法。 在某些實施方案中，反義寡聚體與互補序列RNA之間的結(jié)合Tm可以高于體溫并優(yōu)選高于 50°C。60-80°C范圍內(nèi)或更高的Tm是優(yōu)選的。根據(jù)公知原則，可以通過增加雙螺旋中C G 配對堿基的比例和/或通過增加異源雙螺旋的(堿基對)長度來增加寡聚體化合物與互補堿基的RNA雜合體之間的Tm?？梢栽O(shè)計反義寡聚體用于阻斷或抑制mRNA的翻譯或用于抑制天然前mRNA剪接加工或誘導(dǎo)靶mRNA的降解，并可以稱該反義寡聚體“針對”或“靶向”其雜交的靶序列。在某些實施方案中，靶序列可以包含AspRSmRNA轉(zhuǎn)錄本的任何編碼或非編碼序列，并因而可以在外顯子中或在內(nèi)含子中。在某些實施方案中，靶序列在AspRS中是相對獨特或異常的， 并被選擇用于降低選擇的AspRS蛋白水解片段或剪接變體的表達。在某些實施方案中，靶位點包含加工前mRNA的3’或5’剪接位點或分支點。剪接位點的靶序列可以包含這樣的 mRNA序列，該mRNA序列在其5’端具有加工前mRNA中剪接受體點下游或剪接供體點上游的1-約25-約50個堿基對。當寡聚體以本文所述的方式靶向靶標核酸時，該寡聚體更常被稱為“靶向”生物學相關(guān)的靶標，例如參照AspRS多核苷酸。寡核苷酸的“亞單元”是指一個核苷酸(或核苷酸類似物)單元。該術(shù)語可以指具有或不具有連接的亞單元間的鍵的核苷酸，但是當涉及“帶電的亞單元”時，電荷通常位于亞單元間的鍵(例如，磷酸酯或硫代磷酸酯鍵或陽離子鍵)當中。寡核苷酸的環(huán)狀亞單元可以基于核糖或另一戊糖，或在某些實施方案中，基于改變的或修飾的基團。修飾的寡核苷酸主鏈的實例包括，但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯，包括3’亞烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯，包括3’氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、 硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3’ -5’鍵的硼烷磷酸酯， 它們的2’ -5’連接的類似物和具有反向極性的那些，其中鄰近的核苷酸單元對以3’ -5’與 5’ -3’連接或以2’ -5’與5’ -2’連接。還考慮肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、2’ -0-甲基寡核苷酸(2’ -Ome), 2'-甲氧基乙氧基寡核苷酸(MOE)、嗎啉代、以及領(lǐng)域內(nèi)已知的其他寡核苷酸。嘌呤或嘧啶堿基配對部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或次黃嘌呤。還包括以下堿基，例如吡啶-4-酮、卩比啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲115 氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5’烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5_烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5_鹵代尿苷(例如，5-溴代尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷、2-硫脲核苷、4-硫脲核苷、懷丁苷、wybutoxosine,
4-乙酰胞苷、5-(羧基羥基甲基)尿苷、5’-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌酐、2，2_ 二甲基鳥苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、Ν6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲核苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷(5-methylcarbonyhnethyluridine)、
5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫脲核苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、β-D-甘露糖Q核苷、 尿苷-5-羥丙酸、2-巰基胞苷、蘇氨酸衍生物等(Burgin et al.，1996，Biochemistry, 35, 14090 ；Uhlman&Peyman,同上)。在這方面，“修飾的堿基”是指上文所列舉的除了腺嘌呤 (A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶⑶之外的核苷酸堿基，這類堿基可以在反義分子中的任何位置使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，根據(jù)寡聚體的用途，T和U是可交換的。例如，與更像RNA的諸如2’-0_甲基反義寡核苷酸的其他反義化學基相比，T堿基可以顯示為U。寡核苷酸通常與諸如靶DNA或RNA的靶序列互補。術(shù)語“互補的”和“互補性”是指通過堿基配對原則而相關(guān)的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”與序列 “T-C-A”互補。互補性可以是“部分地”，其中只有部分核酸堿基根據(jù)堿基配對原則匹配?；蛘?，核酸之間可以是“完全”或“全部”的互補性(100%)。核酸鏈間的互補性程度對核酸鏈間的雜交的效率和強度具有重要的影響。盡管通常期望完美的互補性，但是某些實施方案可以包括與靶序列的一個或多個，但優(yōu)選20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、 6、5、4、3、2或1個錯配。包括寡聚體中任意位置處的變異。在某些實施方案中，相對于內(nèi)部的變異，序列中接近寡聚體末端的變異通常是更優(yōu)選的，并且如果存在，通常在5’和/或 3，末端的約10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個核苷酸內(nèi)。術(shù)語“靶序列”是指寡核苷酸所針對的靶RNA的一部分，即通過互補序列的 Watson-Crick堿基配對與寡核苷酸雜交的序列。在某些實施方案中，靶序列可以是AspRS mRNA的連續(xù)區(qū)域(例如，AspRS mRNA的獨特剪接點)，或可以由該mRNA的非連續(xù)區(qū)域組成。
術(shù)語“靶向序列”或某些實施方案中的“反義靶向序列”是指寡核苷酸中與DNA或 RNA靶分子中的靶序列互補(還表示基本上互補)的序列。反義化合物的全部序列或只有一部分可以與靶序列互補。例如，在具有20-30個堿基的寡核苷酸中，約6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 個可以是與靶區(qū)域互補的靶向序列。通常，靶向序列由連續(xù)堿基形成，但是可選地，靶向序列可以由非連續(xù)序列形成， 當將所述非連續(xù)序列例如從寡核苷酸的相反末端放置在一起時構(gòu)成跨越靶序列的序列。當以反向平行構(gòu)型發(fā)生雜交時，靶序列和靶向序列被描述為彼此“互補”。靶向序列可以具有與靶序列“近似的”或“大體的”互補性，并仍為了本發(fā)明的目的起作用，即其仍可以是功能“互補的”。如果寡聚體在生理條件下(Tm基本上高于45 °C，優(yōu)選至少50 °C或通常為 60°C-80°C或更高)與靶標(例如，AspRS參照多核苷酸或其互補物)雜交，，則寡核苷酸與靶多核苷酸序列“特異性雜交”。這類雜交優(yōu)選符合嚴緊雜交條件。在給定的離子強度和PH 下，Tm是50%的靶序列與互補多核苷酸雜交時的溫度。此外，在反義寡聚體與靶序列具有 “近似的”或“大體的”互補性，以及具有精確的互補性的條件下，可以發(fā)生這類雜交。術(shù)語特異性結(jié)合或特異性雜交通常是指在選擇的雜交條件下寡核苷酸探針或寡核苷酸序列不僅與其預(yù)期的靶基因序列結(jié)合，并且不與樣品中其他靶序列顯著結(jié)合，從而在靶標池中區(qū)分其預(yù)期的靶標和所有其他靶標。如本文所述，與其預(yù)期靶序列特異性雜交的探針還可以在選擇的雜交條件下檢測濃度差異。如上文所述，本文提供的某些寡核苷酸包含肽核酸(PNA)。還包括“鎖核酸”亞單元(LNA)。LNA的結(jié)構(gòu)在領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如，ffengel, et al.，Chemical Communications(1998) 455 ；Tetrahedron(1998)54,3607, VX R Accounts of Chem. Research(1999)32, 301) ；0bika，et al.,Tetrahedron Letters(1997)38，8735 ;(1998)39， 5401，以及Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16，9230。某些寡核苷酸可以包含通過不帶電的或基本上不帶電的鍵連接的具有堿基配對部分的基于嗎啉代的亞單元。術(shù)語“嗎啉代寡聚體”或“ΡΜ0”(氨基磷酸酯或磷酸二胺嗎啉代寡聚體)是指由嗎啉代亞單元結(jié)構(gòu)組成的寡核苷酸類似物，其中(i)該結(jié)構(gòu)通過含有磷的鍵連接在一起，所述含有磷的鍵為1-3 個原子長，優(yōu)選2個原子長，并且優(yōu)選是不帶電的或是陽離子，將一個亞單元的嗎啉代氮與鄰近亞單元的5’環(huán)外碳連接，并且(ii)每個嗎啉代環(huán)具有通過堿基特異氫鍵而與多核苷酸中的堿基有效結(jié)合的嘌呤或嘧啶或等效的堿基配對部分。在某些實施方案中，可以通過逐步固相合成，利用上述參考文獻中詳述的方法以及下文關(guān)于具有混合的或不帶電的和陽離子的主鏈鍵的寡核苷酸的合成的方法制備寡核苷酸。在某些情況下，可取的是，將其他化學部分添加到寡核苷酸上，例如，用以增強藥代動力學或促進化合物的俘獲或檢測。這些部分通?？梢愿鶕?jù)標準合成方法共價連接到寡聚體的末端。例如，聚乙二醇部分或其他親水性聚合物(例如具有10-100個單體亞單元的一種)的添加，可以用于提高溶解度。一種或多種帶電基團，例如帶負電荷的基團，例如有機酸，可以增強細胞攝入。多種可檢測分子可以用于致使寡核苷酸可被檢測，例如可以直接(例如通過光發(fā)射)或間接(例如通過與熒光標記的抗體結(jié)合)檢測的放射性同位素、熒光色素、染料、酶、 納米粒子、化學發(fā)光標志物、生物素或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他單體。
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某些實施方案涉及RNA干擾(RNAi)劑，所述RNA干擾劑靶向AspRS參照多核苷酸的一種或多種mRNA轉(zhuǎn)錄本，包括mRNA轉(zhuǎn)錄本的片段或變體。還包括使用該試劑調(diào)節(jié)選擇的AspRS轉(zhuǎn)錄本的水平的方法，所述AspRS轉(zhuǎn)錄本例如AspRS剪接變體或蛋白水解片段。術(shù)語“雙鏈的”是指包含這種區(qū)域的兩個單獨的核酸鏈，其中所述區(qū)域中鏈的至少一部分足以互補成氫鍵并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。術(shù)語“雙螺旋”或“雙螺旋結(jié)構(gòu)”是指雙鏈分子的區(qū)域，其中兩個單獨的鏈基本上互補并因此彼此雜交。“ dsRNA ”是指具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的核糖核酸分子，所述雙螺旋結(jié)構(gòu)包含兩條互補的和反向平行的核酸鏈(即有義鏈和反義鏈)。 不是所有的dsRNA的核苷酸必須展現(xiàn)Watson-Crick堿基對，兩條RNA鏈可以是基本上互補的。RNA鏈可以具有相同或不同數(shù)目的核苷酸。dsRNA的鏈足夠互補以雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，互補的RNA鏈可以小于30個核苷酸，長度小于25個核苷酸，或甚至長度為19-M個核苷酸。在某些方面， 互補的核苷酸序列的長度可以為20-23個核苷酸或長度為22個核苷酸。在某些實施方案中，RNA鏈的至少一條包含長度為1-4個核苷酸的核苷酸突出。在其他實施方案中，一條或兩條鏈是鈍末端。在某些實施方案中，dsRNA還可以包含至少一個化學修飾的核苷酸。本發(fā)明的某些實施方案可以包含微RNA。微RNA代表有機體中天然產(chǎn)生的一大類小RNA，其中某些能調(diào)節(jié)靶基因的表達。通過Dicer從約70個核苷酸的單鏈發(fā)夾前體轉(zhuǎn)錄本形成微 RNA。(V. Ambros et al. Current Biology 13:807,2003)。某些實施方案還可以利用短干擾RNA(siRNA)。siRNA試劑的每條鏈的長度可以等于或少于35、30、25、M、23、22、21、20、19、18、17、16或15個核苷酸。該鏈的長度優(yōu)選為至少19個核苷酸。例如，每條鏈可以長度為21-25個核苷酸。優(yōu)選的siRNA試劑具有17、18、 19、四、21、22、23、對或25個核苷酸對的雙螺旋區(qū)，和一個或多個突出，優(yōu)選2-3個核苷酸的一側(cè)或兩側(cè)3’突出。如本文所用的“單鏈RNAi試劑”是由單分子制成的RNAi試劑。RNAi試劑可以包含通過鏈內(nèi)配對形成的雙螺旋區(qū)，例如其可以是或可以包含發(fā)夾或盤-柄結(jié)構(gòu)。單鏈RNAi 試劑的長度為至少14個核苷酸，并且更優(yōu)選至少15、20、25、29、35、40或50個核苷酸。其長度優(yōu)選小于200、100或60個核苷酸。發(fā)夾RNAi調(diào)節(jié)劑可以具有等于或至少12、18、19、29、21、22、23、24或25個核苷酸對的雙螺旋區(qū)。雙螺旋區(qū)的長度可以優(yōu)選等于或小于200、100或50。雙螺旋區(qū)的長度的某些范圍為15-30、17-23、19-23和19-21個核苷酸。發(fā)夾可以具有單鏈突出，或末端非配對區(qū)，優(yōu)選在3’端，并優(yōu)選在發(fā)夾的反義側(cè)。在某些實施方案中，突出的長度可以為2-3個核苷酸。本發(fā)明還包括利用核酶的寡核苷酸。還包括可以表達本文所述的靶向AspRS的序列的載體遞送系統(tǒng)。包括表達siRNA或其他形成雙螺旋的RNA干擾分子的載體。示例性的遞送系統(tǒng)可以包括病毒載體系統(tǒng)(即病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo))，包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒)載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和皰疹病毒載體以及本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他病毒載體。靶向AspRS多核苷酸參照序列或其互補物的一部分或多部分的寡核苷酸和RNAi 試劑可以用在本文所述的任何治療、診斷或藥物篩選方法中，并對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的?？贵w組合物、其片段和其他結(jié)合劑按照另一方面，本發(fā)明還提供了對于本文所公開的多肽、或其一部分、變體或衍生物表現(xiàn)出結(jié)合特異性的結(jié)合劑以及使用所述結(jié)合劑的方法，所述結(jié)合劑例如抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、可溶性受體、小分子、適體等。優(yōu)選地，這些結(jié)合劑能有效地調(diào)節(jié)本發(fā)明的 AspRS多肽所介導(dǎo)的一種或多種非常規(guī)活性。例如，在一些實施方案中，所述結(jié)合劑是與本發(fā)明的AspRS多肽結(jié)合并抑制所述AspRS多肽與一種或多種其細胞結(jié)合伴侶結(jié)合的能力的結(jié)合劑。因此，這些結(jié)合劑通過拮抗本發(fā)明的AspRS多肽的活性可以用來治療或預(yù)防所述 AspRS多肽介導(dǎo)的疾病、病癥或其他疾病狀態(tài)。如果抗體或其抗原結(jié)合片段與多肽以可檢測的水平(例如，在ELISA測定中)發(fā)生反應(yīng)，并且在相似條件下不與無關(guān)的多肽發(fā)生可檢測地反應(yīng)，則認為所述抗體或其抗原結(jié)合片段與本發(fā)明多肽“特異性結(jié)合”、“免疫結(jié)合”和/或是“免疫反應(yīng)性的”。在本文背景下所用的免疫結(jié)合通常是指免疫球蛋白分子和該免疫球蛋白特異性針對的抗原之間發(fā)生的非共價型相互作用。可以用相互作用的解離常數(shù)(Kd)來表示免疫結(jié)合相互作用的強度或親和力，其中Kd越小表示親和力越高?？梢杂帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的方法對所選多肽的免疫結(jié)合特性進行定量。一種這類方法需要檢測抗原結(jié)合位點/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中那些速率取決于復(fù)合物伴侶的濃度、相互作用的親和力和等同影響雙向速率的幾何參數(shù)。因此，可以通過計算濃度和結(jié)合與解離的實際速率來確定“結(jié)合速率常數(shù)”(k。n)和“解離速率常數(shù)”(kMf)。kMf/k。n的比值可以消去與親和力無關(guān)的所有參數(shù)，并且因此等于解離常數(shù)Kd。參見例如，Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59 439-473。抗體的“抗原-結(jié)合位點”或“結(jié)合部分”是指免疫球蛋白分子參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合位點由重(“H”)和輕(“L”)鏈N-末端可變區(qū)(“V”)的氨基酸殘基形成。 重鏈和輕鏈的V區(qū)中的三個高度不同的區(qū)段被稱為“高變區(qū)”，其插在稱為“框架區(qū)”或“FR” 的較保守的側(cè)翼區(qū)段之間。因此，術(shù)語“FR”是指天然見于免疫球蛋白中高變區(qū)之間并鄰近高變區(qū)的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個高變區(qū)和重鏈的三個高變區(qū)在三維空間彼此相對排列，形成抗原結(jié)合表面。該抗原結(jié)合表面與結(jié)合的抗原的三維表面互補，并且每條重和輕鏈的三個高變區(qū)被稱作“互補決定區(qū)”或“⑶R”。結(jié)合劑可以是例如帶有或不帶有肽組分的核糖體、RNA分子或多肽。在優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任何一種制備抗體。參見,例如 Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。對感興趣的多肽特異的單克隆抗體可以使用例如 Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6 :511-519,1976 的技術(shù)以及對其改進的技術(shù)來制備。本發(fā)明的多肽可以用于例如親和層析步驟的純化過程中。通過優(yōu)先蛋白水解切割I(lǐng)gM可以產(chǎn)生“Fv”片段，但是蛋白水解切割I(lǐng)gG或IgA 免疫球蛋白分子很少產(chǎn)生“Fv”片段。然而，更通常使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的重組技術(shù)衍生出 Fv片段。Fv片段包括非共價VH: 異二聚體，該異二聚體包括保留了天然抗體分子的大部分抗原識別和結(jié)合能力的抗原結(jié)合位點。Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69 :2659-2662 ；Hochman et al. (1976)Biochem 15 :2706-2710 ；和 Ehrlich et al. (1980)Biochem 19 :4091_4096。單鏈Fv( “sFv”)多肽是從融合基因表達的共價連接的VH: 異二聚體，所述融合基因包括通過肽編碼連接物連接的Vi^PVl編碼基因。Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16) :5879-5883.已有多種方法描述了分辨化學結(jié)構(gòu)，用于將來自抗體 V區(qū)的天然聚集的但化學分離的輕多肽鏈和重多肽鏈轉(zhuǎn)換成sFv分子，所述sFv分子會折疊成基本上相似于抗原結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。參見，例如，Huston等的美國專利第 5，091，513號和第5，132，405號；和Ladner等的美國專利第4，946，778號。每個上述分子包括分別插在重鏈和輕鏈FR組之間的重鏈和輕鏈⑶R組，所述FR 組為CDR提供支持并且限定了 CDR相對于彼此的空間關(guān)系。如本文所用的術(shù)語“CDR組”是指重鏈或輕鏈V區(qū)的三個高變區(qū)。從重鏈或輕鏈的N末端開始，將這些區(qū)分別表示為“CDR1”、 “⑶R2”和“⑶R3”。因此，抗原結(jié)合位點包括6個⑶R，包含來自每條重鏈和輕鏈V區(qū)的⑶R 組。在本文中，包含單一⑶R(例如，⑶R1、⑶R2或⑶R3)的多肽被稱為“分子識別單元”。 多個抗原抗體復(fù)合物的晶體分析已經(jīng)證實，CDR的氨基酸殘基與結(jié)合的抗原形成廣泛接觸， 其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3。因此，所述分子識別單元主要負責抗原結(jié)合位點的特異性。如本文所用的術(shù)語“FR組”是指為重鏈或輕鏈V區(qū)的⑶R組的⑶R提供框架的四個側(cè)翼氨基酸序列。一些FR殘基可以接觸結(jié)合的抗原；然而，F(xiàn)R主要負責將V區(qū)折疊為抗原結(jié)合位點，尤其是直接鄰近CDR的FR殘基。在FR中，某些氨基酸殘基和某些結(jié)構(gòu)特征是高度保守的。在這點上，所有的V區(qū)序列包含約90個氨基酸殘基的內(nèi)部二硫環(huán)。當V區(qū)折疊成結(jié)合位點時，CDR表現(xiàn)為突出的環(huán)狀基序，該環(huán)狀基序形成抗原結(jié)合表面。普遍公認的是，F(xiàn)R的保守結(jié)構(gòu)區(qū)影響CDR環(huán)某些“常規(guī)”結(jié)構(gòu)的折疊形狀，與具體的CDR氨基酸序列無關(guān)。而且，已知某些FR殘基參與非共價的結(jié)構(gòu)域間接觸，該結(jié)構(gòu)域間接觸使抗體重鏈和輕鏈的相互作用穩(wěn)定。很多包含來自非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的“人源化”抗體分子已有描述， 包括以下嵌合抗體具有與人恒定結(jié)構(gòu)域融合的嚙齒動物V區(qū)及其相關(guān)CDR(Winter et al. (1991)Nature 349 :293-299 ；Lobuglio et al. (1989)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 4220-4224 ；Shaw et al. (1987) Jlmmunol. 138 :4534-4538 ；禾口 Brown et al. (1987) Cancer Res. 47 :3577-3583)，在與合適的人抗體恒定結(jié)構(gòu)域融合之前移植進人支持FR中的嚙齒動物 CDR(Riechmann et al. (1988) Nature 332 :323-327 ；Verhoeyen et al. (1988) Science 239 1534-1536 ；和 Jones et al. (1986)Nature 321 :522-525)，以及由重組相嵌的(veneered)嚙齒動物FR支持的嚙齒動物CDR(歐洲專利公開第519，596號，于1992年 12月23日公布)。這些“人源化”分子被設(shè)計為將對于嚙齒動物抗人抗體分子的不希望的免疫應(yīng)答降至最低，該免疫應(yīng)答限制了那些部分在人接受體中的治療應(yīng)用的持續(xù)時間和功效。如上文所述，結(jié)合劑包括“肽”。術(shù)語肽通常是指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成類似物。在某些實施方案中，術(shù)語“肽”是指相對短的多肽，包括由約2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個(包括兩者之間的所有整數(shù)和范圍(例如，5-10、8-12、10-15))氨基酸組成并且與AspRS多肽、其細胞結(jié)合伴侶或二者相互作用的肽。如本文所述，肽可以由天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸組成。
結(jié)合劑可以包含肽模擬物或其他小分子?！靶》肿印笔侵负铣蓙碓椿蛏飦碓?生物分子)的有機化合物，但通常不是聚合物。有機化合物是指其分子包含碳的一大類化合物，通常排除僅含有碳酸鹽、碳的單純氧化物或氰化物的那些化合物?！吧锓肿印蓖ǔＪ侵赣苫畹挠袡C體產(chǎn)生的有機分子，包括大的聚合分子(生物聚合物)，例如肽、多糖和核酸以及小分子，例如初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物、類脂、磷脂、糖脂、留醇類、甘油脂類、維生素類和激素類?！熬酆衔?，，通常是指由重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成的大分子或高分子，所述重復(fù)結(jié)構(gòu)單元通常由共價化學鍵連接。在某些實施方案中，小分子具有小于1000道爾頓的分子量，通常為約300-700道爾頓，并包括約 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、500、650、600、750、700、 850、800、950 或 1000 道爾頓。結(jié)合劑還包括適體。適體的實例包括核酸適體(例如，DNA適體、RNA適體)和肽適體。核酸適體通常是指已經(jīng)通過例如SELEX(通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)性進化)的體外選擇或等效方法的重復(fù)輪次被工程化改造，從而與多種分子靶標結(jié)合的核酸種類，所述分子靶標例如小分子、蛋白、核酸并且甚至是細胞、組織和有機體。因此，包括與本文所述的 AspRS多肽和/或它們的細胞結(jié)合伴侶結(jié)合的核酸適體。肽適體通常包括兩端連接到蛋白支架(即，通常將肽適體的結(jié)合親和力增強到與抗體的結(jié)合親和力相當?shù)乃?例如，在納摩爾范圍內(nèi))的雙結(jié)構(gòu)約束)的可變的肽環(huán)。在某些實施方案中，可變環(huán)長度可以由約10-20個(包括二者之間的所有整數(shù))氨基酸組成， 并且該支架可以包括具有良好溶解度和容納性質(zhì)的任何蛋白。某些示例性的實施方案可以使用細菌蛋白硫氧還蛋白A作為支架蛋白，待插入還原活性位點的可變環(huán)(野生型蛋白中的-Cys-Gly-Pro-Cys-環(huán))具有可以形成二硫鍵的兩個半胱氨酸側(cè)鏈。因此，包括與本文所述的AspRS多肽和/或它們的細胞結(jié)合伴侶結(jié)合的肽適體?？梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的不同系統(tǒng)，包括酵母雙雜交系統(tǒng)，進行肽適體選擇。如上文所述，本發(fā)明的AspRS多肽和結(jié)合劑可以用于本文所述的任何診斷、藥物開發(fā)或治療方法中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以將本發(fā)明的諸如單克隆抗體的結(jié)合劑與一種或多種目的試劑結(jié)合。例如，可以將治療劑直接地或間接地(例如，通過連接物基團)與合適的單克隆抗體結(jié)合(例如，共價鍵合)。當試劑和抗體中的每一個都具有能與另一個反應(yīng)的取代基時，試劑和抗體之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，一個上的諸如氨基或巰基的親核基團能與另一個上的諸如酸酐或酸鹵化物的含有羧基的基團反應(yīng)或與含有良好離去基團 (例如，鹵化物)的烴基反應(yīng)。可選擇地，通過連接物基團將治療劑和抗體結(jié)合是可取的。連接物基團的功能可以是間隔物來使抗體與試劑保持距離，從而避免結(jié)合能力的干擾。連接物基團也可以增加試劑或抗體上的取代基的化學反應(yīng)性，并因此增強結(jié)合效率。化學反應(yīng)性的增強也可以促進試劑、或試劑上的官能團的效用，否則將無法實現(xiàn)這點。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，包括同功能的和異功能的在內(nèi)的多種雙功能或多功能試劑(例如描述于Pierce Chemical Co. , Rockford, IL目錄中的那些)可以用作連接物基團。例如，可以通過氨基、羧基、巰基或氧化的碳水化合物殘基而實現(xiàn)結(jié)合。有多個參考文獻描述了這類方法，例如，Rodwell等的美國專利第4，671，958號。
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如果當治療劑脫離本發(fā)明免疫綴合物的抗體部分時，其更有效，則可能需要使用在細胞內(nèi)化過程中或細胞內(nèi)化時可切割的連接物基團。多種不同的可切割的連接物基團已有描述。試劑從這些連接物基團的細胞內(nèi)釋放機制包括通過以下的切割二硫鍵的還原 (例如，Spitler的美國專利第4，489，710號)、光不穩(wěn)定的鍵的照射(例如，Senter等的美國專利第4，625，014號)、衍生氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，Kohn等的美國專利第4，638，045 號)、血清補體介導(dǎo)的水解(例如，Rodwell等的美國專利第4，671，958號)、和酸催化的水解(例如，Blattler等的美國專利第4，569，789號)。將多于一種的試劑與抗體結(jié)合是可取的。在一個實施方案中，多個試劑分子與一個抗體分子結(jié)合。在另一個實施方案中，可以將多于一種的試劑與一個抗體結(jié)合。不考慮特定實施方案，可以用很多方法制備具有多于一種的試劑的免疫綴合物。例如，可以將多于一種的試劑直接與抗體分子結(jié)合，或可以使用提供多個連接位點的連接物。制劑和給藥通常將本發(fā)明的組合物(例如，多肽、多核苷酸、抗體等)配制于藥學可接受的或生理可接受的溶液中，用于單獨給予細胞、組織或動物或與一種或多種其他治療形式聯(lián)合給予細胞、組織或動物。還應(yīng)當理解，如果需要，本發(fā)明的組合物也可以與其他試劑聯(lián)合給藥，例如，其他的蛋白或多肽或各種藥物活性劑。對所述組合物中還包括的其他組分幾乎沒有限制，只要其他試劑對本發(fā)明的AspRS多肽的預(yù)期達到的所需效果沒有不利影響。在本發(fā)明的藥物組合物中，藥學可接受的賦形劑和載體溶液的配制是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，在多個治療方案中使用本文所描述的具體組合物的合適的劑量和治療方案的開發(fā)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括例如，口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、顱內(nèi)以及肌肉內(nèi)給藥和制劑。在某些應(yīng)用中，可以將本文所公開的藥物組合物通過口服給藥遞送至個體。因此， 可以將這些組合物與惰性稀釋液或與可吸收可食用的載體一起配制、或可以將它們封裝于硬殼或軟殼的明膠膠囊中、或可以將它們壓成片劑、或可以將它們直接合并到飲食食物中。在某些情況下，將本文所公開的藥物組合物經(jīng)胃腸外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)甚或腹膜內(nèi)遞送是理想的，如例如在美國專利第5，543, 158號、美國專利第5，641，515號和美國專利第 5，399，363號(其每一篇通過引用的方式以其整體并入本文)中所描述的?？梢栽谶m當混合了諸如羥丙纖維素的表面活性劑水中制備作為游離堿或藥學可接受的鹽的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物中和在油中制備分散液。在常規(guī)的保存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。適于注射使用的藥物形式包括無菌水性溶液或分散液和用于無菌可注射溶液或分散液的臨時制備的無菌粉末(美國專利第5，466，468號，通過引用將其全部特別并入本文)。在任何情況下，所述形式應(yīng)該是無菌的，并且流動性應(yīng)達到易于注射的程度。在制備和保存的條件下，它應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且應(yīng)該針對諸如細菌和真菌的微生物的污染作用而進行防腐。所述載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、以上合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)。通過以下可以保持合適的流動性例如，使用諸如卵磷脂的包被、對于分散液保持所需的顆粒大小和使用表面活性劑。各種抗細菌劑和抗真菌劑可以促進預(yù)防微生物作用，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等。在多數(shù)情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。通過在組合物中使用諸如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的試劑可以實現(xiàn)注射組合物的延長吸收。對于水性溶液的胃腸外給藥，例如，如果需要，應(yīng)當使溶液適當緩沖，并且首先用足夠的鹽溶液或葡萄糖使液體稀釋劑成為等滲的。這些特定的水性溶液尤其適于靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥和腹膜內(nèi)給藥。在該方面，根據(jù)本公開，可以利用的無菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可將1個劑量溶于Iml等滲NaCl溶液中，并且或者加至IOOOml的皮下注射液或者在計劃的輸注部位進行注射(參見，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓制藥科學)，第 15 版，pp. 1035-1038 和 1570-1580)。根據(jù)待治療個體的疾病狀態(tài)，劑量必然會發(fā)生某些變化。在任何情況下，負責給藥的人應(yīng)當確定對于單獨個體的合適劑量。而且，對于人類給藥，制劑應(yīng)該滿足FDA生物制劑辦公室標準所要求的無菌、致熱原性、以及一般的安全和純度標準?？梢酝ㄟ^以下制備無菌的可注射溶液將合適的溶劑中的所需量的活性化合物與上面列舉的各種其他成分合并，如果需要，隨后進行過濾滅菌。通常，通過將各種滅菌的活性成分合并入無菌媒介中來制備分散液，所述無菌媒介含有基本的分散介質(zhì)和來自那些上文列舉的所需的其他成分。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)可以從事先的無菌過濾溶液產(chǎn)生活性成分外加任何其他所需成分的粉末?？梢詫⒈疚乃_的組合物配制為中性形式或鹽形式。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的自由氨基基團形成的)，并且所述酸加成鹽可以與諸如鹽酸或磷酸的無機酸形成或與諸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有機酸形成。與自由羧基基團形成的鹽也可以來源于諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵的無機堿和諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等的有機堿。通過配制后，按照與劑型相容的方式和治療有效量給予溶液?？梢砸远喾N劑型容易地給予制劑，例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等。如本文所用的“載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、媒介、包被、稀釋劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這樣的介質(zhì)和試劑作為藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域是眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容，否則考慮在治療組合物中使用它。補充的活性成分也能合并入組合物中。短語“藥學可接受的”是指這樣的分子實體和組合物，當將其給予人時，不會產(chǎn)生過敏性或相似的不良反應(yīng)。包含作為活性成分的蛋白的水性組合物的制備是本領(lǐng)域公知的。通常，將這類組合物制備成或為液體溶液或為懸浮液的注射液；還可以制備成在注射前適于溶解或懸浮于液體中的固體形式。也可以將制劑乳化。在某些實施方案中，可以通過鼻內(nèi)噴霧、吸入和/或其他氣溶膠遞送媒介遞送藥物組合物。通過鼻內(nèi)氣溶膠噴霧將基因、多核苷酸和肽組合物直接遞送至肺的方法已有描述，例如，美國專利第5，756，353號和美國專利第5，804，212號(通過引用將每一篇的全部特別并入本文)。同樣，使用鼻內(nèi)微粒樹脂(Takenaga et al. , 1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美國專利第5，725，871號，通過引用將其全部特別并入本文)的藥物遞送在制藥行業(yè)內(nèi)也是公知的。同樣，聚四氟乙烯支持基質(zhì)的形式的跨粘膜的藥物遞送描述于美國專利第5，780’ 045號(通過引用將其全部特別并入本文)。在某些實施方案中，可以通過使用脂質(zhì)體、納米膠囊、微顆粒、微球、脂質(zhì)顆粒、囊泡等進行遞送，用于將本發(fā)明組合物引入合適的宿主細胞中。特別是，可以配制本發(fā)明組合物用于封裝在脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球、納米顆粒等中的遞送。可以用已知的和常規(guī)的技術(shù)進行這類遞送媒介的配制和使用。包含本發(fā)明組合物的試劑盒在其他方面，本發(fā)明提供了包含一個或多個容器的試劑盒，所述容器填充了如本文所述的本發(fā)明的一種或多種多肽、多核苷酸、抗體、多單元復(fù)合物、以上的組合物等。所述試劑盒包括如何使用這些組合物的書面說明書(例如，調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成、癌癥、炎性條件等)。本文的試劑盒還可以包含一種或多種其他的治療劑或待治療的適應(yīng)癥所適用的或所需要的其他組分。如果需要，其他的治療劑可以容納在第二容器中。其他治療劑的實例包括，但不限于，抗腫瘤劑、抗炎劑、抗細菌劑、抗病毒劑、血管生成劑等。本文的試劑盒還可以包含一種或多種注射器或?qū)嵤┯媱澾f送方式所必需或所需要的其他組分(例如，支架、可植入的貯庫等)。使用方法本發(fā)明的實施方案還包括使用本文所述的AspRS組合物或“試劑”用于診斷、藥物開發(fā)和/或治療目的的方法。術(shù)語AspRS “試劑”通常是指AspRS多核苷酸、AspRS多肽、 結(jié)合劑和本文所述的其他化合物。對于診斷目的而言，AspRS試劑可以以多種不限制的方法使用，從而區(qū)分不同的細胞類型或不同的細胞狀態(tài)，或用于鑒定具有相關(guān)疾病或疾病狀態(tài)的個體。對于藥物開發(fā)目的而言，AspRS試劑可以用于鑒定AspRS多肽的一種或多種細胞“結(jié)合伴侶”，表征AspRS多肽的一種或多種“非常規(guī)”活性，鑒定選擇性地或非選擇性地激動或拮抗AspRS多肽與其結(jié)合伴侶的相互作用的試劑，和/或鑒定選擇性或非選擇性地激動或拮抗AspRS多肽的一種或多種“非常規(guī)”活性的試劑。對于治療目的而言，本文所提供的AspRS試劑或組合物可以用于治療下文所述的多種疾病或疾病狀態(tài)。A.診斷如上文所述，本文所述的AspRS試劑可以用于診斷測定中。這些實施方案包括檢測一種或多種新鑒定的AspRS蛋白片段的AspRS多核苷酸序列或相應(yīng)的多肽序列或其一部分。在某些實施方案中，一種或多種新鑒定的AspRS序列的存在或水平與一種或多種細胞類型或細胞狀態(tài)有聯(lián)系或相關(guān)。因此，如上文所述，AspRS序列的存在或水平可以用于區(qū)分不同的細胞類型或不同的細胞狀態(tài)?？梢愿鶕?jù)基于多核苷酸和/或多肽的診斷技術(shù)來檢測 AspRS序列的存在或水平。本文提供的某些方法依賴于AspRS序列的差異表達，來表征細胞、組織或個體的疾病狀態(tài)或狀態(tài)并且將其與另一細胞、組織或個體區(qū)分。非限制性的實例包括，檢測生物樣品中AspRS序列的存在或水平以區(qū)分不同種類的細胞或組織，不同組織或器官的細胞，諸如新生的或成體的細胞發(fā)育狀態(tài)，細胞分化狀態(tài)，諸如健康、患病和受治療的狀況，細胞內(nèi)和細胞外部分，以及原代細胞培養(yǎng)物和其他細胞培養(yǎng)物，例如永生化細胞培養(yǎng)物。差異表達通常是指相對于合適的對照中AspRS多核苷酸或多肽序列的表達水平， 相同序列的一種或多種基因表達水平在統(tǒng)計學上的顯著性差異。統(tǒng)計學上的顯著性差異可以指所測量的表達水平的增加或降低，所述測量是通過RNA水平、蛋白水平、蛋白功能或諸如本文所述的那些基因表達的任何其他相關(guān)測量進行的。如果結(jié)果不可能是偶然發(fā)生的，則結(jié)果通常被稱為統(tǒng)計學上顯著的。測試或結(jié)果
38的顯著性水平通常涉及概率統(tǒng)計假定檢驗概念。在簡單情況下，統(tǒng)計學上的顯著性可以被定義為當零假設(shè)事實上為真時做出否決該零假設(shè)的判定的概率(被稱為I型錯誤或“假陽性確定”的判定)。該判定通常用P值進行如果P值小于顯著性水平，則否決零假設(shè)。P值越小，結(jié)果越顯著。貝葉斯因子也可用于確定統(tǒng)計學上的顯著性(參見，例如，Goodman S.， Ann Intern Med 130 1005—13，1999)。在更復(fù)雜的但實際上重要的情況下，測試或結(jié)果的顯著性水平可以反映在這樣的分析中，其中當零假設(shè)事實上為真的時做出否決該零假設(shè)的判定的概率不超過規(guī)定的概率。該類分析允許那些應(yīng)用，其中決定否決的概率可以遠小于零假設(shè)中所包含的某些假定集合的顯著性水平。在某些示例性的實施方案中，統(tǒng)計學上顯著的差異表達可以包括這樣的情況，其中相對于合適的對照，可疑的生物樣品中給定的AspRS序列的表達水平提供表達上至少約 1. 2Χ、1· 3Χ、1· 4Χ、1· 5Χ、1· 6Χ、1· 7Χ、1· 8Χ、1· 9Χ、2· ΟΧ,2. 2Χ、2· 4Χ、2· 6Χ、2，8Χ、3· ΟΧ,4. ΟΧ、 5. ΟΧ,6. ΟΧ,7. ΟΧ,8. ΟΧ,9. 0Χ、10· 0Χ、15· ΟΧ,20. ΟΧ,50. 0Χ、100· OX 或更大的差異(即，可以更高或更低表達的差異表達)，包括二者之間的所有整數(shù)和小數(shù)(例如，1. 24XU. 25X、 2. 1X、2. 5X、60. 0X、75. OX等)。在某些實施方案中，統(tǒng)計學上顯著的差異表達可以包括這樣的情況，其中相對于合適的對照，可疑的生物樣品中給定的AspRS序列的表達水平提供表達上至少約 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 百分比(% )或更大的差異(即， 可以更高或更低的差異表達)，包括二者之間的所有整數(shù)和小數(shù)。作為額外的實例，還可以通過進行本文所述及領(lǐng)域內(nèi)已知的Z檢驗確定差異表達，即計算絕對Z評分(參見實施例1)。Z檢驗通常用于鑒定樣品平均值和群體平均值之間的顯著性差異。例如，相對于95%置信區(qū)間(即5%的顯著性水平)的標準正常表(例如，對照組織)，絕對值大于1. 96的Z評分指示非隨機性。對于99%的置信區(qū)間，如果絕對 Z大于2. 58，意味著ρ < . 01，并且差異更加顯著——可以更高置信地否決零假設(shè)。在這些和相關(guān)實施方案中，1. 96,2,2. 58、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更高的絕對Z評分，包括兩者之間的所有小數(shù)(例如，10. 1,10. 6、11. 2等)，可以為統(tǒng)計學上的顯著性提供有力標準。在某些實施方案中，大于6的絕對Z評分提供特別高的統(tǒng)計學上的顯著性。基本上相似地通常是指生物樣品與參考對照之間的表達水平缺乏統(tǒng)計學上的顯著性差異?；旧舷嗨频谋磉_水平的實例可以包括這樣的情況，其中相對于參照樣品，可疑的生物樣品中給定的SSCIGS的表達水平提供表達上少于.05X、0. 1X、0. 2X、0. 3X、0. 4X、 0. 5X、0. 6X、0. 7X、0. 8X、0. 9X、1. OX.、1. 1X、1. 2X、1. 3X 或 1. 4X 的差異(即，可以更高或更低表達的差異表達)，包括二者之間的所有小數(shù)(例如，.15乂、0.25乂、0.35乂等)。在某些實施方案中，差異表達可以包括這樣的情況，其中相對于參照樣品，可疑的生物樣品中給定的 AspRS 序列的表達水平提供表達上少于 0. 25,0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、30、40、50百分比(% )的差異(即，可以更高或更低的差異表達)。在某些實施方案中，例如當使用Affymethx Microarray檢測AspRS多核苷酸或多肽序列的表達水平時，還可以通過平均表達值確定差異表達，所述平均表達值由Affymethx Microarray Suite 5軟件(Affymetrix，Santa Clara, CA)或其他相似軟件所概括，通常折合成1000的平均表達值。本發(fā)明的實施方案包括檢測AspRS多核苷酸或多肽參照序列或其部分的存在或水平以區(qū)分不同有機體或物種的細胞、組織或其他生物樣品的方法，其中該序列的存在或水平與選擇的有機體或種類相關(guān)。通常的實例包括在人與細菌、真菌、植物和其他非人動物的任意組合之間進行區(qū)分的方法。動物中包括在人與脊椎動物和無脊椎動物的任意組合之間進行區(qū)分的方法，包括諸如魚、兩棲動物、爬行類、鳥和非人哺乳動物的脊椎動物以及諸如昆蟲、軟體動物、甲殼類和珊瑚蟲等無脊椎動物。非人哺乳動物中包括在人與非人哺乳動物的任意組合之間進行區(qū)分的方法，所述非人哺乳動物來自非洲猥目、象駒目、管齒目、蹄兔目、長鼻目、海牛目、帶甲目、披毛目、樹駒目、皮翼目、靈長目、哨齒目、兔形目、猬形目、鼠句形目、翼手目、鱗甲目、鯨目、食肉目、奇蹄目或偶蹄目。靈長目包括猴子、猿、大猩猩和黑猩猩以及領(lǐng)域內(nèi)已知的其他種類。因此，本文所述的AspRS多核苷酸或多肽參照序列或變體的存在或水平可以用于鑒定諸如細胞、組織或器官的給定的生物樣品的來源，所述鑒定通過區(qū)分這些有機體的任意組合，或通過區(qū)分人與這些有機體的任意一種或多種(例如有機體組)來進行。在某些實施方案中，還可以通過將AspRS序列或其部分的存在或水平與預(yù)定值比較來確定給定的生物樣品的來源。本發(fā)明的實施方案包括檢測AspRS多核苷酸或多肽參照序列或其部分的存在或水平，以區(qū)分來自不同組織或器官的細胞或其他生物樣品的方法。非限制性的實例包括區(qū)分來自以下的任意組合的細胞或其他生物樣品的方法皮膚(例如，真皮、表皮、皮下組織層)、毛囊、神經(jīng)系統(tǒng)(例如，腦、脊髓、外周神經(jīng))、聽覺系統(tǒng)或平衡器官(如，內(nèi)耳，中耳，外耳)、呼吸系統(tǒng)(例如，鼻、氣管、肺)、胃食管組織、胃腸道系統(tǒng)(例如，口腔、食道、胃、小腸、 大腸、直腸)、血管系統(tǒng)(例如，心臟、血管和動脈)、肝臟、膽囊、淋巴/免疫系統(tǒng)(例如，淋巴結(jié)、淋巴濾泡、脾臟、胸腺、骨髓)、泌尿生殖系統(tǒng)(如，腎、輸尿管、膀胱、尿道、子宮頸、輸卵管、卵巢、子宮、外陰、前列腺、尿道球腺體、附睪、前列腺、精囊、睪丸)、肌肉骨骼系統(tǒng)(例如，骨骼肌、平滑肌、骨、軟骨、肌腱、韌帶)、脂肪組織、乳房以及內(nèi)分泌系統(tǒng)(例如，下丘腦、 垂體、甲狀腺、胰腺、腎上腺)。因此，根據(jù)本文所述的AspRS多核苷酸或多肽序列的聯(lián)合，這些方法可以用于鑒定或表征細胞或其他生物樣品所來源的組織或器官。本發(fā)明的實施方案包括檢測AspRS多核苷酸或多肽參照序列或其部分的存在或水平，以區(qū)分或表征細胞的發(fā)育或分化狀態(tài)的方法。還包括區(qū)分生殖細胞、干細胞和體細胞的方法。發(fā)育狀態(tài)的實例包括新生的和成體的。細胞分化狀態(tài)的實例包括全能細胞、多能細胞、多能祖干細胞和成熟的、完全分化的細胞之間的所有精細且可確認的階段。全能細胞具有全部潛能，通常在有性和無性繁殖時出現(xiàn)，并包括孢子與合子，盡管在某些情況下細胞可以去分化并恢復(fù)全能性。多能細胞包括具有分化為三種胚層中任何一種的潛能的干細胞，所述胚層包括內(nèi)胚層(內(nèi)胃壁、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、骨骼、血液、 泌尿生殖系統(tǒng))和外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。多潛能祖細胞通?？梢苑只癁橛邢迶?shù)目的組織類型。多潛能細胞的實例包括，但不限于，來自骨髓的產(chǎn)生諸如紅細胞、白細胞和血小板的免疫細胞的造血干細胞(成體干細胞)，來自骨髓的產(chǎn)生基質(zhì)細胞、脂肪細胞和各種類型的骨細胞的間質(zhì)干細胞(成體干細胞)，產(chǎn)生各種類型的皮膚細胞的上皮干細胞(祖細胞)和產(chǎn)生分化的肌肉組織的肌衛(wèi)星細胞(祖細胞)。因此，與對照或預(yù)定水平相比，特定AspRS多核苷酸或多肽序列的存在或水平可用于區(qū)分或表征上述細胞分化狀態(tài)。
本發(fā)明的實施方案包括檢測AspRS多核苷酸或多肽參照序列的存在或水平以表征或診斷細胞、組織、器官或個體的狀況的方法，其中該狀況可以表征為健康的、患病的、 有患病風險的或受治療的。為了該診斷目的，術(shù)語“診斷的(diagnostic)”或“診斷的 (diagnosed) ”包括鑒定病理狀態(tài)的存在或性質(zhì)，表征發(fā)展為這種狀態(tài)的風險和/或檢測該病理狀態(tài)響應(yīng)于治療的改變(或未改變)。診斷方法在其靈敏度和特異性上有差異。在某些實施方案，診斷測定的“靈敏度”是指測試為陽性的患病細胞、組織或個體的百分比(“真陽性”的百分比)。未被該測定檢測到的患病細胞、組織或個體通常被稱為“假陰性”。未患病且在測定中測試為陰性的細胞、組織或個體可以稱為“真陰性”。在某些實施方案中，診斷測定的“特異性”可以定義為1(1)減假陽性比例，其中“假陽性”比例被定義為沒有疾病且測試為陽性的那些樣品或個體的比例。雖然特定診斷方法可能不能提供狀態(tài)的最終診斷， 但是如果該方法能提供輔助診斷的陽性指示，它就足夠了。在某些實例中，可以通過將與病理狀態(tài)相關(guān)的一種或多種選擇的AspRS多核苷酸或多肽參照序列或其部分的存在或水平與合適的對照相比(無論水平是增加的還是降低) 來診斷病理狀態(tài)的存在或發(fā)展為病理狀態(tài)的風險。“合適的對照”或“適當?shù)膶φ铡卑ńM織或有機體的細胞或其他生物樣品中確定的值、水平、特征、特性或性質(zhì)，例如，表現(xiàn)出諸如不存在所述狀態(tài)的正常性狀的對照或正常細胞、組織或有機體。在某些實施方案中，“合適的對照”或“適當?shù)膶φ铡笔穷A(yù)先確定的值、水平、特征、特性或性質(zhì)。其他合適的對照對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。疾病或疾病狀態(tài)的實例在本文他處描述。本發(fā)明的實施方案包括基于AspRS多核苷酸或核酸的檢測技術(shù)，該技術(shù)由于檢測的靈敏度而提供某些優(yōu)勢。因此，某些實施方案涉及作為診斷方法或測定的一部分的AspRS 多核苷酸的使用或檢測。AspRS多核苷酸的存在和/或水平可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法測量，包括諸如Northern印跡的雜交測定、定量或定性聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、定量或定性逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、微陣列、點印跡或槽印跡、或諸如熒光原位雜交(FISH)的原位雜交以及其他。這些方法中的某些在下文更詳細描述?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法從血液、生物流體、組織、器官、細胞系或其他相關(guān)樣品中收集和/或產(chǎn)生諸如DNA和RNA的AspRS多核苷酸，例如描述于以下的那些方法 Kingston. (2002 Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù))，Greene Publ. Assoc. Inc. &John ffiley&Sons, Inc.，NY，NY(參見，例如，描述于 Nelson et al. Proc Natl Acad Sci U S A,99 :11890-11895,2002)等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法產(chǎn)生互補DNA(cDNA)文庫，例如描述于以下的那些 :Ausubel et al. (2001Current Protocols in Molecular Biology (MiX^l^^.^
學實驗技術(shù))，Greene Publ. Assoc. Inc. &John Wiley&Sons，Inc.，NY, NY) ；Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning(分子克隆),Second Ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) ；Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)等。某些實施方案可以利用用于檢測AspRS多核苷酸序列的雜交方法。用于進行多核苷酸雜交測定的方法在領(lǐng)域內(nèi)發(fā)展良好。雜交測定步驟和條件根據(jù)應(yīng)用而變化，并且根據(jù)已知的通用結(jié)合方法進行選擇，包括描述于以下的那些方法Maniatis et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)(aid Ed. Cold Spring Harbor,N. Y. , 1989) ；Berger and Kimmel Methods in Enzymology (酶學方法)，Vol. 152，Guide to Molecular Cloning Techniques (分子克隆技術(shù)指導(dǎo))(Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. , 1987) ；Young and Davism，P. N. A. S，80 :1194(1983)。進行重復(fù)和受控的雜交反應(yīng)的方法和裝置已經(jīng)描述于美國專利第5，871，928號、第5，874，219號、第6，045，996號和第 6，386，749號、第6，391，623號，通過引用將每篇并入本文。 某些實施方案可以利用用于檢測AspRS多核苷酸序列的核酸擴增方法。術(shù)語“擴增”或“核酸擴增”是指包含預(yù)期的特異性靶核酸序列的至少一部分的靶核酸的多個拷貝的產(chǎn)生。多個拷貝可以被稱為擴增子或擴增產(chǎn)物。在某些實施方案中，擴增的靶標所包含的序列小于完整的靶基因序列(內(nèi)含子和外顯子)或表達的靶基因序列(外顯子和位于側(cè)翼的非翻譯序列的剪接的轉(zhuǎn)錄本)。例如，可以利用與靶多核苷酸的內(nèi)部位置雜交并從該位置啟動聚合的擴增引物通過擴增該靶多核苷酸的一部分來產(chǎn)生特異的擴增子。優(yōu)選地，擴增出的部分包含可以利用多種公知方法的任一種進行檢測的可檢測的靶序列。
本文所使用的“選擇性擴增，，或“特異性擴增，，是指擴增本發(fā)明的靶核酸序列，其中靶序列的可檢測的擴增基本上限制在從待測試的目的核酸樣品擴增靶序列而不是從來自某些其他樣品來源的靶核酸序列擴增，所述其他樣品來源例如在擴增反應(yīng)期間使用的試劑中或進行擴增反應(yīng)的環(huán)境中存在的污染。利用“擴增條件”來表示允許按照本發(fā)明進行核酸擴增的條件。在某些實施方案中，擴增條件可以不如本文所述的“嚴緊雜交條件”嚴緊。在擴增條件下，本發(fā)明的擴增反應(yīng)中使用的寡核苷酸與它們的預(yù)期靶標雜交，但在嚴緊雜交條件下可能雜交也可能不雜交。 另一方面，本發(fā)明的檢測探針通常在嚴緊雜交條件下雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所利用的特定擴增方法可易于確定按照本發(fā)明實施核酸擴增的可接受的條件。許多公知的核酸擴增方法需要熱循環(huán)以交替地使雙鏈核酸變性并使其與引物雜交；然而，其他公知的核酸擴增方法是等溫的。通常被稱為PCR的聚合酶鏈式反應(yīng)(美國專利第4，683，195號、第4，683，202號、第4，800，159號、第4，965，188號)使用變性，引物對與互補鏈的退火和引物延伸的多個循環(huán)以指數(shù)方式增加靶序列的拷貝數(shù)。在被稱作RT-PCR 的變形中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)從mRNA產(chǎn)生互補DNA (cDNA)，然后通過PCR擴增cDNA以產(chǎn)生 DNA的多個拷貝。如上所述，術(shù)語“PCR”是指選擇性地擴增靶核酸種類的多個擴增循環(huán)。包括定量 PCR(qPCI )、實時(PC 、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCIi)，并且定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (qRT-PCI )在領(lǐng)域內(nèi)有良好的描述。術(shù)語“pPCR”是指定量聚合酶鏈式反應(yīng)，術(shù)語“qRT-PCR”是指定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)。qPCR和qRT-PCR可以用于擴增靶向的cDNA分子并同時對其進行定量。它使得可以對cDNA庫中的特定序列，例如選擇的AspRS基因或轉(zhuǎn)錄本，同時進行檢測和定量。術(shù)語“實時PCR”可以使用DNA結(jié)合染料，與PCR中所有雙鏈(ds)DNA結(jié)合，引起染料發(fā)出熒光。因此，PCR期間DNA產(chǎn)物的增加導(dǎo)致熒光強度的增加，并在每個循環(huán)進行測量， 從而允許對DNA濃度進行定量。然而，諸如SYBR Green的dsDNA染料將與所有dsDNA PCR 產(chǎn)物結(jié)合。在實時PCR熱循環(huán)儀中檢測并測量熒光，并且與產(chǎn)物的指數(shù)增加相對應(yīng)的熒光的幾何級數(shù)增加用來確定每個反應(yīng)中的閾值循環(huán)(“CT”)。術(shù)語“CT評分”是指閾值循環(huán)數(shù)，這是PCR擴增已超過閾值水平時的循環(huán)。如果樣品中特定基因的mRNA的量較高，則其將比低表達的基因更早跨越閥值，因為有更多的起始RNA用于擴增。因此，CT評分低表示樣品中的基因表達高，CT評分高表示基因表達低。某些實施方案可以采用通常被稱為LCR的連接酶鏈式反應(yīng)(Weiss，R. 1991， Science 254 1292)，其使用與靶核酸的鄰近區(qū)域雜交的兩套互補的DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸可以在熱變性、雜交和連接的重復(fù)循環(huán)中通過DNA連接酶共價連接，從而產(chǎn)生可檢測的雙鏈連接的寡核苷酸產(chǎn)物。在某些實施方案中，其他技術(shù)可用于評估來自特定cDNA文庫轉(zhuǎn)錄本的RNA轉(zhuǎn)錄本，包括微陣列分析(Han，M.，et al.，Nat Biotechnol，19 :631-635,2001 ；Bao, P.，et al.， Anal Chem, 74 :1792-1797,2002 ；Schena et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-19， 1996 ；以及 Heller et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :2150-55,1997)禾口 SAGE(基因表達系列分析)。與MPSS相似，SAGE是數(shù)字化的并可以產(chǎn)生大量的信號序列(參見，例如，Velculescu, V. Ε. , et al. , Trends Genet, 16 :423-425. , 2000 ；Tuteja R. and Tuteja N. Bioessays. 2004 Aug ；26 (8) :916-22)，但是數(shù)量級小于可從諸如MPSS的技術(shù)獲得的信號序列。在某些實施方案中，術(shù)語“微陣列”包括具有與基底結(jié)合的多個核酸的“核酸微陣列”，與所述多個結(jié)合的核酸中的每個的雜交可被分別檢測?；卓梢允菍嵭牡幕蚨嗫椎?， 平面的或非平面的，整體的或分布式的。核酸微陣列包中所述的所有裝置DNA Microarrays -Λ Practical Approach (Practical Approach Series) (DNA 微陣列實用方法(實用方法系列))，Oxford University Press (1999) ；Nature Genet. 21(1) (suppl. ) 1-60(1999) ；Schena(ed. ), Microarray Biochip :Tools and Technology (微陣歹ll 生物芯片工具與技術(shù))，Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000)。核酸微陣列可以包含與基底結(jié)合的多個核酸，其中所述多個核酸位于多個珠子上而不是整體的平面基底上,例如如在Brenner et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4) :1665-1670(2000)所描述的。核酸微陣列的實例可以見于美國專利第6，391，623 號、第 6，383，754 號、第 6，383，749 號、第 6，380，377 號、第 6，379，897 號、第 6，376，191 號、 第 6，372，431 號、第 6，351，712 號、第 6，344，316 號、第 6，316，193 號、第 6，312，906 號、 第 6，309，828 號、第 6，309，824 號、第 6，306，643 號、第 6，300，063 號、第 6，287，850 號、 第 6，284，497 號、第 6，284，465 號、第 6，280，954 號、第 6，262，216 號、第 6，251，601 號、 第 6，245，518 號、第 6，263，287 號、第 6，251，601 號、第 6，238，866 號、第 6，228，575 號、 第 6，214，587 號、第 6，203，989 號、第 6，171，797 號、第 6，103，474 號、第 6，083，726 號、 第 6，054，274 號、第 6，040，138 號、第 6，083，726 號、第 6，004，755 號、第 6，001，309 號、 第 5，958，342 號、第 5，952，180 號、第 5，936，731 號、第 5，843，655 號、第 5，814，454 號、第 5，837，196號、第5，436，327號、第5，412，087號和第5，405，783號，通過引用將這些專利的公開內(nèi)容并入本文。其他實例包括可從Affymetrix (Santa Clara, Calif.)以商標名 GeneChip 商購的核酸陣列。制備和使用陣列的其他示例性的方法提供于，例如美國專利第7，028，629號、 第 7，011，949 號、第 7，011，945 號、第 6，936，419 號、第 6，927，032 號、第 6，924，103 號、第 6，921，642 號和第 6，818，394 號中。涉及陣列和微陣列的本發(fā)明還考慮連接到固體基底的聚合物的多種用途。這些用途包括基因表達監(jiān)測、譜型分析、文庫篩選、基因分型和診斷。基因表達監(jiān)測和譜型
43分析方法以及用于基因表達監(jiān)測和譜型分析的方法描述于美國專利第5，800，992號、第 6,013,449 號、第 6，020，135 號、第 6,033,860 號、第 6，040，138 號、第 6，177，248 號和第 6，309，822號中?；蚍中图捌溆猛久枋鲇诿绹暾埾盗械?0/442，021號、第10/013, 598 號(美國申請第2003/0036069號)以及美國專利第5，925，525號、第6，268, 141號、 第 5，856，092 號、第 6，267，152 號、第 6，300，063 號、第 6，525，185 號、第 6，632，611 號、 第 5，858，659 號、第 6，284，460 號、第 6，361，947 號、第 6，368，799 號、第 6，673，579 和第 6，333，179號中?？梢耘c本文所公開的方法聯(lián)合使用的核酸擴增、標記和分析的其他方法收錄在美國專利第5，871，928號、第5，902，723號、第6，045，996號、第5，541，061號和第 6，197，506 號中。如本文所述，某些實施方案可以利用諸如引物或探針的寡核苷酸用于擴增或檢測，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。如本文所述，盡管寡核苷酸的設(shè)計和序列取決于其功能，但是通常應(yīng)考慮數(shù)個變量。最相關(guān)的變量包括長度、解鏈溫度(Tm)、特異性，與系統(tǒng)內(nèi)其他寡核苷酸的互補性、G/C含量、多嘌呤(T、C)或多嘧啶(A、G)區(qū)段以及3’端序列。因此，某些實施方案包括檢測樣品中靶AspRS多核苷酸的方法，其中所述多核苷酸通常包含本文所述的參照AspRS多核苷酸的序列，所述方法包括a)將樣品與探針雜交， 所述探針包含與樣品中靶多核苷酸互補的序列，并且所述探針能與所述靶多核苷酸特異性雜交，在合適的條件下，在所述探針和所述靶多核苷酸或其片段之間能形成雜交復(fù)合物，和 b)檢測是否存在所述雜交復(fù)合物，并且任選地，如果存在，檢測其含量。還包括檢測樣品中靶AspRS多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含本文所述的參照AspRS多核苷酸序列，所述方法包括a)擴增所述靶多核苷酸或其片段，和b)檢測是否存在所述擴增的靶多核苷酸或其片段，并且任選地，如果存在，檢測其含量。本發(fā)明的實施方案包括多種基于AspRS多肽的檢測技術(shù)，包括基于抗體的檢測技術(shù)。這些實施方案中包括用AspRS多肽來產(chǎn)生抗體或其他結(jié)合劑的用途，然后所述抗體或其他結(jié)合劑可以用于診斷方法和組合物中，從而檢測通常來自個體的細胞或其他生物樣品中所選的AspRS多肽或?qū)ζ溥M行定量。某些實施方案可以利用標準方法，例如免疫印跡和免疫沉淀反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、流式細胞術(shù)和免疫熒光測定(IFA)。這些公知的方法通常利用本文所述的一種或多種單克隆或多克隆抗體，所述抗體與本發(fā)明的選擇的AspRS多肽或該AspRS多肽的獨特區(qū)域特異性結(jié)合，并通常不與諸如全長AspRS多肽的其他AspRS多肽顯著結(jié)合。在某些實施方案中，AspRS多肽的獨特區(qū)域可以由諸如蛋白水解片段的新鑒定的選擇性剪接變體或蛋白片段的獨特剪接點或特定三維結(jié)構(gòu)編碼。某些實施方案可以利用“陣列”，例如“微陣列”。在某些實施方案中，“微陣列”還可以指具有與基底結(jié)合的多肽集合或多個多肽的“肽微陣列”或“蛋白微陣列”，與所述多個結(jié)合的多肽的結(jié)合可以被單獨地檢測。可選地，肽微陣列可以具有多種結(jié)合劑，包括，但不限于，可以特異性檢測本文所述的AspRS多肽的結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體、噬菌體展示結(jié)合劑，酵母雙雜交結(jié)合劑和適體。陣列可以基于這些AspRS多肽的自身抗體檢測，例如， 如在 Robinson et al. , Nature Medicine 8(3) :295-301 (2002)中所描述。肽陣列的實例可見于 WO 02/31463,WO 02/25288,W001/94946,WO 01/88162,WO 01/6867UW0 01/57259、 WO 00/61806,WO 00/54046,WO 00/47774,WO 99/40434,WO 99/39210 和 WO 97/42507 以及美國專利第6，268，210號、第5，766，960號和第5，143，854號，通過引用將每篇并入本文。某些實施方案可以利用MS或其他基于分子量的方法用于診斷性地檢測AspRS多肽序列。質(zhì)譜法(MS)通常是指用于確定樣品或分子的元素組成的分析技術(shù)。MS還可用于確定諸如肽和其他化合物的分子的化學結(jié)構(gòu)。通常，MS原理包括將化合物電離以產(chǎn)生帶電的分子或分子片段，然后測量它們的質(zhì)荷比。在示例性的MS方案中將樣品加載到MS裝置上，并經(jīng)過汽化，通過多種方法中的一種將樣品的組分電離例如，通過用電子束轟擊它們)，這導(dǎo)致形成帶正電的粒子，然后通過磁場加速陽離子，當所述離子穿過電磁場時根據(jù)它們的運動軌跡對粒子的質(zhì)荷比(m/z) 進行計算，并且根據(jù)m/z對之前的步驟中檢測的離子進行分類。示例性的MS裝置具有三個模塊離子源，其將氣相的樣品分子轉(zhuǎn)化成離子(或在電噴霧電離的情況下，將溶液中存在的離子移動到氣相中)；質(zhì)量分析器，其使用電磁場通過離子的質(zhì)量將其分類；和檢測器，其測量指示劑量的值，并因而提供數(shù)據(jù)用于計算存在的每種離子的豐度。MS技術(shù)同時具有定性和定量用途，包括鑒定未知化合物，確定分子中元素的同位素組成，和通過觀察化合物的斷裂確定化合物的結(jié)構(gòu)。其他用途包括對樣品中化合物的量進行定量或研究氣相離子化學的原理(真空中離子和中性粒子化學)。因此，根據(jù)本文所提供的任何方法可以將MS技術(shù)用于測定生物樣品中本發(fā)明的AspRS多肽的存在或水平，并將這些水平與對照樣品或預(yù)定值進行比較。B.化合物和治療劑開發(fā)某些實施方案涉及AspRS多肽或AspRS多核苷酸參照序列在藥物開發(fā)中的用途， 通常涉及鑒定調(diào)節(jié)參照AspRS的一種或多種非常規(guī)活性的試劑。例如，某些實施方案包括鑒定AspRS參照多肽或包含AspRS參照序列的多肽的一種或多種“結(jié)合伴侶”的方法，所述結(jié)合伴侶例如與AspRS多肽相關(guān)，并參與其一種或多種非常規(guī)活性的細胞蛋白或其他宿主分子。還包括鑒定激動或拮抗AspRS參照多肽或其活性變體的非常規(guī)活性的化合物(例如， 多肽)或其他試劑的方法，例如通過使所述化合物或其他試劑與AspRS多肽和/或其一種或多種細胞結(jié)合伴侶相互作用。因此，某些實施方案包括鑒定AspRS參照多肽的結(jié)合伴侶的方法，包括a)在合適的條件下使AspRS多肽與生物樣品組合，和b)檢測AspRS多肽與結(jié)合伴侶的特異性結(jié)合， 從而鑒定與AspRS參照多肽特異性結(jié)合的結(jié)合伴侶。還包括篩選與AspRS參照多肽或AspRS 多肽的結(jié)合伴侶特異性結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括a)在合適的條件下使所述多肽或結(jié)合伴侶與至少一種受試化合物組合，和b)檢測所述多肽或結(jié)合伴侶與所述受試化合物的結(jié)合，從而鑒定與所述多肽或其結(jié)合伴侶特異性結(jié)合的化合物。在某些實施方案中， 所述化合物是多肽或肽。在某些實施方案中，所述化合物是小分子或其他(例如，非生物的)化合物。在某些實施方案中，所述化合物是肽模擬物?？梢岳眠m合檢測蛋白-蛋白相互作用的任何方法來鑒定與AspRS參照多肽相互作用，與其一種或多種細胞結(jié)合伴侶相互作用，或與以上二者相互作用的細胞蛋白?？梢岳玫某Ｒ?guī)方法的實例包括對細胞裂解物或從細胞裂解物獲得的蛋白進行免疫共沉淀反應(yīng)， 交聯(lián)和通過梯度或色譜柱共純化，主要用于鑒定裂解物中與AspRS多肽相互作用的蛋白。在這些和相關(guān)實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，例如通過Edman降解技術(shù)，可以確定與AspRS多肽或其結(jié)合伴侶相互作用的蛋白的至少一部分氨基酸序列。 參見，例如 Creighton Proteins !Structures and Molecular Principles (蛋白結(jié)構(gòu)與分子原理)，W. H. Freeman&Co.，N. Y.，pp. 3449，1983。獲得的氨基酸序列可以用作產(chǎn)生寡核苷酸混合物的引導(dǎo)，所述寡核苷酸混合物可以用于篩選編碼這類蛋白的基因序列。例如， 可以通過本文所述的和本領(lǐng)域內(nèi)已知的標準雜交或PCR技術(shù)完成篩選。用于產(chǎn)生寡核苷酸混合物和進行篩選的技術(shù)是公知的。參見，例如，Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù))Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y. , 1989 ；禾口lnnis et al. ,eds. PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 實驗技術(shù)方法和應(yīng)用指南)Academic Press, Inc. , New York，1990。此外，可以利用同時鑒定編碼結(jié)合伴侶或其他多肽的基因的方法。這些方法包括， 例如，以與λ-gtll文庫抗體探測的公知技術(shù)相似的方式，利用標記的AspRS蛋白或另一多肽、肽或融合蛋白，例如變體AspRS多肽或與標志物(例如，酶、fluor、發(fā)光蛋白或染料)融合的AspRS結(jié)構(gòu)域或Ig-Fc結(jié)構(gòu)域，探測表達文庫。檢測體內(nèi)蛋白相互作用的一個方法是雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)的實例描述于(Chien et al.，PNAS USA 88 :9578 9582,1991)中并且可從 Clontech(Palo Alto, Calif.)商購。 在某些實例中，雙雜交系統(tǒng)或其他這類方法可用于篩選與“誘餌”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白激活結(jié)構(gòu)域文庫。通過示例而非限制的方式，AspRS參照多肽或變體可用作誘餌基因產(chǎn)物。 AspRS結(jié)合伴侶也可用作“誘餌”基因產(chǎn)物?？偦蚪M或cDNA序列可被融合到編碼激活結(jié)構(gòu)域的DNA上。將該文庫和編碼誘餌AspRS基因產(chǎn)物與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的雜合體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進酵母報告菌株中，從所得的轉(zhuǎn)化體篩選表達報告基因的那些菌株。還包括三雜交系統(tǒng)，其允許在酵母中檢測RNA-蛋白相互作用。參見，例如Hook et al.，RNA. 11 :227_233，2005。因此，這些和相關(guān)方法可用于鑒定AspRS多肽的細胞結(jié)合伴侶。這些和相關(guān)方法也可用于鑒定與AspRS多肽、其細胞結(jié)合伴侶或以上二者相互作用的諸如結(jié)合劑或核酸的其他化合物。如上所述，一旦分離，可以鑒定結(jié)合伴侶，然后相應(yīng)地將該結(jié)合伴侶與標準技術(shù)聯(lián)合使用以鑒定與其相互作用的蛋白或其他化合物。因此，某些實施方案涉及篩選與AspRS 參照多肽的結(jié)合伴侶特異性結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括a)在合適的條件下使所述結(jié)合伴侶與至少一種受試化合物組合，和b)檢測所述結(jié)合伴侶與所述受試化合物的結(jié)合，從而鑒定與結(jié)合伴侶特異性結(jié)合的化合物。在某些實施方案中，所述受試化合物是多肽。在某些實施方案中，所述受試化合物是化合物，例如小分子化合物或肽模擬物。某些實施方案包括篩選調(diào)節(jié)AspRS參照多肽的活性的化合物的方法，所述方法包括a)在容許所述多肽具有活性的條件下使所述多肽與至少一種受試化合物組合，b)評定存在受試化合物時所述多肽的活性，和c)將存在受試化合物時所述多肽的活性與不存在受試化合物時所述多肽的活性進行比較，其中存在所述受試化合物時多肽活性的改變表示化合物調(diào)節(jié)所述多肽的活性。某些實施方案包括篩選調(diào)節(jié)AspRS參照多肽的結(jié)合伴侶的活性的化合物的方法， 所述方法包括a)在容許所述結(jié)合伴侶具有活性的條件下使所述多肽與至少一種受試化合物組合，b)評定存在受試化合物時所述結(jié)合伴侶的活性，和c)將存在受試化合物時所述結(jié)合伴侶的活性與不存在受試化合物時所述結(jié)合伴侶的活性進行比較，其中存在所述受試化
46合物時結(jié)合伴侶活性的改變表示化合物調(diào)節(jié)所述結(jié)合伴侶的活性。通常，這些和相關(guān)實施方案包括評定與AspRS多肽或其結(jié)合伴侶相關(guān)的選擇的非常規(guī)活性。包括體外和體內(nèi)條件，例如細胞培養(yǎng)條件。某些實施方案包括篩選有效地作為AspRS參照多肽或其活性片段或變體的完全或部分激動劑的化合物的方法，所述方法包括a)將包含所述多肽的樣品暴露于化合物，和 b)通常通過測定AspRS多肽的非常規(guī)活性的增加來檢測所述樣品中的激動劑活性。某些方法包括a)將包含AspRS多肽的結(jié)合伴侶的樣品暴露于化合物，和b)通常通過測定AspRS 多肽的選擇的非常規(guī)活性的增加來檢測所述樣品中的激動劑活性。某些實施方案包括這樣的組合物，該組合物包含通過所述方法鑒定的激動劑化合物以及藥物可接受的載體或賦形劑。還包括篩選有效地作為AspRS參照多肽的完全或部分拮抗劑的化合物的方法，所述方法包括a)將包含所述多肽的樣品暴露于化合物，和b)通常通過測定AspRS多肽的非常規(guī)活性的降低來檢測所訴樣品中的拮抗劑活性。某些方法包括a)將包含AspRS多肽的結(jié)合伴侶的樣品暴露于化合物，和b)通常通過測定AspRS多肽的選擇的非常規(guī)活性的降低來檢測所述樣品中的拮抗劑活性。某些實施方案包括這樣的組合物，該組合物包含通過所述方法鑒定的拮抗劑化合物以及藥物可接受的載體或賦形劑。在某些實施方案中，可以設(shè)計體外系統(tǒng)以鑒定可以與AspRS參照序列或其結(jié)合伴侶相互作用或調(diào)節(jié)AspRS參照序列或其結(jié)合伴侶的化合物。通過這類系統(tǒng)所鑒定出的某些化合物可用于，例如，調(diào)節(jié)途徑的活性和加工所述途徑的組分本身。它們還可在篩選中用于鑒定破壞所述途徑的組分之間的相互作用，或可以直接破壞這類相互作用的化合物。一個示例性的方法涉及在允許AspRS多肽和受試化合物相互作用和結(jié)合的條件和足夠的時間下制備它們的反應(yīng)混合物，從而形成可以從反應(yīng)混合物去除和/或檢測的復(fù)合物?？梢砸远喾N方式進行體外篩選測定。例如，可以將AspRS多肽、細胞結(jié)合伴侶或受試化合物錨定在固相上。在這些和相關(guān)實施方案中，在反應(yīng)結(jié)束時可以在固相上俘獲和檢測所得的復(fù)合物。在這類方法的一個實例中，將AspRS多肽和/或其結(jié)合伴侶錨定在固相表面上，而未錨定的受試化合物可被直接地或間接地標記，使得可以檢測固相表面上的組分對所述受試化合物的俘獲。在其他實例中，將受試化合物錨定在固相表面上，而未錨定的 AspRS多肽和/或其結(jié)合伴侶是標記的或以某種方法可檢測。在某些實施方案中，微滴定板通常可用作固相。錨定的組分(或受試化合物)可以通過非共價或共價連接被固定。通過用蛋白溶液簡單包被固相表面并干燥可以實現(xiàn)非共價連接?？蛇x擇地，可以使用對待固定的蛋白特異的固定的抗體，優(yōu)選單克隆抗體，將所述蛋白錨定在固相表面上。所述表面可以預(yù)先制備并儲存。為了進行示例性的測定，通常將未固定的組分添加到含有錨定的組分的包被表面。反應(yīng)完成之后，在所形成的任何特異性復(fù)合物仍將固定在固相表面上的條件下去除 (例如，通過沖洗)未反應(yīng)的組分?？梢砸远喾N方式實現(xiàn)錨定在固相表面上的復(fù)合物的檢測。例如，如果之前未固定的組分是預(yù)先標記的，則對固定在表面上的標記的檢測表明形成了復(fù)合物。如果之前未固定的組分是未預(yù)先標記的，則可以使用間接標記來檢測錨定在表面上的復(fù)合物，例如，使用對之前未固定的組分特異的標記抗體(隨后可以用標記的抗Ig 抗體直接標記或間接標記所述抗體)。
可選擇地，例如，可以利用表面等離子共振技術(shù)(SPR)和作為標志(index)的共振角的改變來確定是否存在受試化合物的結(jié)合，其中根據(jù)常規(guī)方法將AspRS多肽或細胞結(jié)合伴侶固定在可商購的傳感器芯片(例如，由Biacore 制造)的表面上，將受試化合物與之接觸，并且用特定波長的光從特定角度照射所述傳感器芯片。還可以通過檢測與受試化合物相應(yīng)的峰的出現(xiàn)來測定受試化合物的結(jié)合，所述檢測通過這樣的方法，其中將AspRS多肽或細胞結(jié)合伴侶固定在適用于質(zhì)譜儀的蛋白芯片的表面上，將受試化合物與之接觸，并且將諸如MALDI-MS、ESI-MS、FAB-MS等的電離方法與質(zhì)譜儀(例如，雙聚焦質(zhì)譜儀、四級桿質(zhì)譜儀、飛行時間質(zhì)譜儀、傅里葉變換質(zhì)譜儀、離子回旋質(zhì)譜儀等)結(jié)合。在某些實施方案中，基于細胞的測定，基于膜囊的測定，或基于膜部分的測定可用于鑒定調(diào)節(jié)選擇的AspRS多肽在非常規(guī)途徑中的相互作用的化合物。為此目的，可以使用表達AspRS多肽和/或結(jié)合伴侶的細胞系、或表達包含這類蛋白的結(jié)構(gòu)域或片段(或其組合)的融合蛋白的細胞系、或已經(jīng)基因工程改造以表達這類蛋白或融合蛋白的細胞系(例如，COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、Hela細胞等)。通過相對于對照或預(yù)定量監(jiān)測非常規(guī)活性的變化(例如，統(tǒng)計學上的顯著性變化)可以鑒定影響該活性的受試化合物。對于涉及反義試劑和RNAi試劑的實施方案，例如，還包括篩選有效地改變AspRS 參照多核苷酸的表達的化合物的方法，所述方法包括a)將包含AspRS參照多核苷酸的樣品暴露于諸如潛在的反義寡核苷酸的化合物，和b)檢測AspRS多核苷酸表達的改變。在某些非限制性的實例中，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，這些和相關(guān)實施方案可以用于基于細胞的測定或用于無細胞翻譯的測定中。還包括通過這類方法所鑒定的反義試劑和RNAi試劑。還包括適用于高通量篩選(HTQ的任何上述方法，或本領(lǐng)域已知的其他篩選方法。HTS通常使用自動化以運行針對候選化合物文庫的測定的篩選，例如，測量本文所述的非常規(guī)活性的增加或降低的測定。C.治療方法在另一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的組合物方法，用于使用本文所述的組合物治療細胞、組織或個體。本發(fā)明可以調(diào)節(jié)的細胞或組織優(yōu)選為哺乳動物細胞，或更優(yōu)選為人細胞。這些細胞可以是健康狀態(tài)或患病狀態(tài)的細胞。因此，本文所述的AspRS試劑，包括AspRS多肽、AspRS多核苷酸、基于AspRS多核苷酸的載體、反義寡核苷酸、RNAi試劑以及諸如肽、抗體和抗原結(jié)合片段、肽模擬物或其他小分子的結(jié)合劑，可用于治療與參照AspRS的非常規(guī)活性相關(guān)的多種非限制性疾病或疾病狀態(tài)。這類非常規(guī)活性的實例包括，細胞增殖的調(diào)節(jié)、細胞遷移的調(diào)節(jié)、細胞分化的調(diào)節(jié) (例如造血作用)、細胞凋亡或其它形式的細胞死亡的調(diào)節(jié)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、細胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、細胞代謝的調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生或活性的調(diào)節(jié)、細胞因子受體活性的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)等。包括基于多核苷酸的療法，例如反義療法和RNAi干擾療法，其通常涉及降低靶分子的表達，所述靶分子例如貢獻其非常規(guī)活性的AspRS多肽的特定剪接變體或AspRS多肽的細胞結(jié)合伴侶。反義或RNAi療法通常拮抗所述非常規(guī)活性，例如通過降低AspRS參照多肽的表達。還包括激動或拮抗AspRS參照多肽的非常規(guī)活性的基于多肽、抗體、肽模擬物或其他小分子的療法，例如通過與AspRS多肽、其細胞結(jié)合伴侶或以上二者直接相互作用。在某些實施方案中，例如，提供了用于調(diào)節(jié)治療相關(guān)的細胞活性的方法，所述治療
48相關(guān)的細胞活性包括，但不限于，細胞代謝、細胞分化、細胞增殖、細胞分化、細胞動員、細胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、細胞阻抗、細胞因子產(chǎn)生等，所述方法包括將細胞與本文所述的 AspRS組合物接觸。因此，AspRS組合物可以用來治療基本上任何可以獲益于一種或多種這些活性的調(diào)節(jié)的細胞或組織或個體。AspRS組合物還可以用于多種治療環(huán)境中的任何一種，包括例如，腫瘤疾病、免疫系統(tǒng)疾病(例如，自身免疫性疾病和炎癥)、感染性疾病、代謝疾病、神經(jīng)元/神經(jīng)病學疾病、 肌肉/心血管疾病、異常造血作用相關(guān)的疾病、異常血管生成相關(guān)的疾病、異常細胞存活相關(guān)的疾病等的治療或預(yù)防相關(guān)的那些治療環(huán)境。例如，在某些示例性實施方案中，本發(fā)明的AspRS組合物可以用于調(diào)節(jié)血管生成， 例如，通過內(nèi)皮細胞增殖和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)?？梢允褂煤线m的細胞系(例如，人微脈管內(nèi)皮肺細胞(HMVEC-L)和人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC))和使用合適的測定(例如，內(nèi)皮細胞遷移測定、內(nèi)皮細胞增殖測定、成管測定、基質(zhì)膠栓測定等)來監(jiān)測內(nèi)皮細胞的增殖和/ 或細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述測定中的多數(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且是可以獲得的。因此，在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明的組合物可以用來治療基本上任何可以獲益于血管生成調(diào)節(jié)的細胞或組織或個體。例如，在一些實施方案中，可以將經(jīng)歷或易感于血管生成的細胞或組織或個體(例如，血管生成疾病狀態(tài))與本發(fā)明合適的組合物接觸，從而抑制血管生成疾病狀態(tài)。在其他的實施方案中，可以將經(jīng)歷或易感于不足的血管生成的細胞或組織(例如，血管生成抑制的疾病狀態(tài))與本發(fā)明合適的組合物接觸，從而干擾血管生成抑制活性和/或促進血管生成。血管生成疾病狀態(tài)的示例性實例包括，但不限于，年齡相關(guān)的黃斑部退變(AMD)、 癌癥(實體的和血液學的)、發(fā)育異常(器官發(fā)生)、糖尿病致盲、子宮內(nèi)膜異位、眼部新血管生成、銀屑病、風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和皮膚變色(例如，血管瘤、鮮紅斑痣或單純痣)?？寡苌杉膊顟B(tài)的實例包括，但不限于，心血管疾病、再狹窄、缺血性組織或心力衰竭再灌注后的組織損傷、慢性炎癥和傷口愈合。本發(fā)明的組合物還可以用作免疫調(diào)節(jié)劑，用于通過調(diào)節(jié)直接或間接介導(dǎo)自身免疫性和/或炎癥疾病、疾病狀態(tài)和病癥的細胞來治療抗炎癥或促炎癥的適應(yīng)癥。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知和可獲得的任何技術(shù)來監(jiān)測本發(fā)明組合物作為免疫調(diào)節(jié)劑的功效，所述技術(shù)包括例如，遷移測定(例如，使用白細胞或淋巴細胞)，細胞因子產(chǎn)生測定或細胞活力測定(例如，使用B細胞、T細胞、單核細胞或NK細胞)。“炎癥”通常是指組織對諸如病原體、受損傷細胞(例如，創(chuàng)傷)和刺激物的有害刺激的生物應(yīng)答。術(shù)語“炎癥應(yīng)答”是指獲取和調(diào)節(jié)炎癥的具體機理，包括，僅通過示例的方式，免疫細胞的激活或遷移，細胞因子的產(chǎn)生，血管擴張(包括激肽釋放，纖溶和凝血方式) 以及本文所述的和本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方式。理想的情況下，炎癥是身體的保護性嘗試，從而既去除傷害性刺激又為受影響的一種或多種組織啟動愈合過程。如果缺乏炎癥，傷口和感染永遠不會愈合，形成這樣一種局面，組織的進行性破壞將威脅生存。另一方面，過度或慢性炎癥可能與多種疾病有關(guān)聯(lián)，如花粉熱，動脈粥樣硬化，類風濕關(guān)節(jié)炎以及本文所述的和本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他疾病。慢性炎癥的臨床體征取決于疾病的持續(xù)時間、炎性病變、原因和受影響的解剖學區(qū)域(參見，例如Kumar et al.，Robbins Basic Pathology-8th Ed.(羅賓斯基礎(chǔ)病理學第八版)，2009Elsevier，London ；Miller, LM, Pathology Lecture Notes (病理學講義)， Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI，Canada)。慢性炎癥與多種病理狀態(tài)或疾病相關(guān)，包括，例如，過敏癥，阿爾茨海默氏病，貧血，主動脈瓣狹窄，諸如類風濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎，癌癥，充血性心臟衰竭，纖維肌痛，纖維化，心臟病發(fā)作，腎功能衰竭，紅斑狼瘡，胰腺炎，中風，手術(shù)并發(fā)癥，炎性肺部疾病，炎性腸道疾病，動脈粥樣硬化， 神經(jīng)系統(tǒng)疾病，糖尿病，代謝紊亂，肥胖癥和牛皮癬以及本文所述和本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他疾病。因此，AspRS組合物可用于治療或處理慢性炎癥，調(diào)節(jié)任何一種或多種個體的慢性炎癥應(yīng)答，或治療任何一種或多種與慢性炎癥相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)。某些具體炎癥應(yīng)答包括細胞因子產(chǎn)生和活性，以及相關(guān)的途徑。例如，某些示例性的實施方案涉及經(jīng)由核因子-κ B(NF-KB)調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如通過增加該轉(zhuǎn)錄因子的下游活性。在某些實例中，NF-K B活性的增加可以導(dǎo)致細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或活性的增加， 所述細胞因子例如促炎性細胞因子(例如，TNF-α)和抗炎性細胞因子(例如，IL-10)。評估炎癥和其他疾病狀態(tài)的體征和癥狀的標準對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并由以下的教導(dǎo)例證，例如Berkow et al.，eds.，The Merck Manual (默克手冊)， 16th edition, Merck and Co. , Rahway, N. J. , 1992 ；Goodman et al. , eds. , Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeutics (古德曼、吉爾曼治療學的藥理學基礎(chǔ))，IOth edition, Pergamon Press, Inc.，Elmsford, N. Y.，(2001)； Avery ‘ s Drug Treatment Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics (Avery的藥物治療臨床藥理學和治療學理論與實踐)，3rd edition, ADIS Press, Ltd. , Williams and ffilkins, Baltimore, MD. (1987) ；Ebadi, Pharmacology, Little,Brown and Co. ,Boston,(1985) ；Osolci al.,eds. ,Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓制藥科學)，18th edition, Mack Publishing Co. , Easton, PA (1990)； Katzung,Basic and Clinical Pharmacology (基石出及臨床藥理學)，Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)，所述標準包括用于做出鑒別診斷的目的以及用于監(jiān)測治療，例如通過根據(jù)已接受的臨床標準確定的改善來確定在治療期間是否已經(jīng)給予治療有效劑量。還包括調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，例如天然免疫應(yīng)答的方法。如本文所用的術(shù)語“免疫應(yīng)答” 包括由免疫系統(tǒng)的一種或多種細胞所介導(dǎo)的對抗原、疫苗組合物或免疫調(diào)節(jié)分子發(fā)生的可測量的或可觀察的反應(yīng)。免疫應(yīng)答通常從抗原或免疫調(diào)節(jié)分子與免疫系統(tǒng)細胞的結(jié)合啟動。對抗原或免疫調(diào)節(jié)分子的反應(yīng)可以由多種細胞類型介導(dǎo)，所述細胞類型包括最初與抗原或免疫調(diào)節(jié)分子結(jié)合的細胞和參與介導(dǎo)天然、體液、細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的細胞。如本文所用的“天然免疫應(yīng)答”可以涉及病原相關(guān)的分子模式(PAMP)或AspRS多肽與諸如toll樣受體的細胞表面受體的結(jié)合。對PAMP或其他信號響應(yīng)的toll樣受體和 Ipaf信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)分子的產(chǎn)生，例如細胞因子和共刺激分子，所述免疫調(diào)節(jié)因子引發(fā)和/或增強免疫應(yīng)答。參與天然免疫應(yīng)答的細胞包括，例如，樹突狀細胞、 巨噬細胞、自然殺傷細胞和嗜中性粒細胞等。某些實施方案涉及增強天然免疫應(yīng)答。某些實施方案涉及降低天然免疫應(yīng)答。在某些方面，天然免疫應(yīng)答由一種或多種諸如TLR2和/或TLR4的toll樣受體(TLR)介導(dǎo)。 本發(fā)明的某些AspRS多肽與諸如TLR2和/或TLR4的TLR結(jié)合。TLR識別區(qū)分感染物與自身的PAMP并介導(dǎo)諸如細胞因子的免疫調(diào)節(jié)分子的產(chǎn)生，這對于有效的適應(yīng)性免疫的發(fā)展是必要的(Aderem, A and Ulevitch, R. J. Nature 406 :782-787(2000)和 Brightbill, H. D.， Immunology 101 1_10 (2000)，通過引用并入本文)。toll樣受體家族的成員識別多種抗原類型并可以區(qū)分病原體。例如，TLR2識別多種真菌，革蘭氏陽性菌和分枝桿菌組分，TLR4識別革蘭氏陰性菌產(chǎn)物脂多糖(LPS)，且TLR9識別諸如細菌DNA中CpG重復(fù)的核酸。刺激天然免疫(例如，經(jīng)由TLR2和/或TLR4)的AspRS組合物單獨或與其他療法聯(lián)合可用于治療多種疾病狀態(tài)。這類疾病狀態(tài)的具體實例包括傳染病，例如細菌、病毒和寄生蟲傳染病。無論是在活的、減毒的還是其他類型的疫苗中，刺激天然免疫的AspRS組合物還可用作疫苗佐劑，以增強個體對一級抗原的免疫應(yīng)答。病毒傳染病或媒介的實例(及它們相應(yīng)的疫苗)包括，但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、杯狀病毒相關(guān)性腹瀉、輪狀病毒腹瀉、B型流感嗜血桿菌肺炎和侵入性疾病、流感、麻疹、腮腺炎、風疹、副流感相關(guān)性肺炎、呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎、重度急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)、人乳頭瘤病毒，單純皰疹病毒2型生殖器潰瘍、HIV/AIDS、 登革熱、日本腦炎、蜱傳腦炎、西尼羅河病毒相關(guān)的疾病、黃熱病、愛潑斯坦-巴爾病毒、拉沙熱、克里米亞-剛果出血熱、埃博拉出血熱、馬爾堡出血熱、狂犬病、裂谷熱、天花、麻風病、上呼吸道和下呼吸道感染，脊髓灰質(zhì)炎以及本文他處所描述的。細菌傳染病或媒介的實例包括，但不限于，炭疽桿菌(Bacillus antracis), 伯氏疏螺旋體(Borellia burgdorferi)、流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)、 犬種布魯氏菌(Brucella canu)、羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)、豬種布魯氏菌(Brucella suis)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原體 (Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡衣原體(Chlamydia psitacci)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis) ^1 (Clostridium botulinum)、 Xf ^!爭胃(C. difficile)、Γ
莢膜梭菌(C. perfringens)、破傷風梭菌(C. tetani)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)(艮口，白喉)、腸球菌(Enterococcus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、幽門螺旋菌(Helicobacter pylori)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、鉤端螺旋體(Leptospira)、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、月市炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌 (Neisseria gonorrhea)、腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立式立克次體(Rickettsia recketisii)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)、宋內(nèi)志賀氏菌(Shigella sonnei)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、月市炎鏈球菌 (S. pneumoniae)、化胺性鏈球菌(S. pyogenes)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、 霍亂弧菌(Vibrio cholera)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)和中耳炎媒介(例如，常由肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)(Moraxella catarrhal is)弓 1 ) ^XR^fXi'k^
所描述的。寄生蟲傳染病的實例包括，但不限于，阿米巴病(如溶組織內(nèi)阿米巴)，鉤蟲病(如線蟲寄生蟲，如美洲半口線蟲和十二指腸鉤蟲)，利什曼病，瘧疾G種原生動物寄生蟲瘧原蟲，惡性瘧原蟲，間日瘧原蟲，卵形瘧原蟲和四日瘧原蟲)，血吸蟲病(寄生血吸蟲，曼氏血吸蟲，裂體血吸蟲和日本血吸蟲)，盤尾絲蟲(河盲癥)，克氏錐蟲(查加斯病/美國昏睡病)，和麥地那龍線蟲，淋巴絲蟲病。某些AspRS組合物可用于內(nèi)毒素休克的治療或緩解，所述內(nèi)毒素休克通常由于暴露于諸如脂多糖(LPS)的外源抗原而導(dǎo)致。由于內(nèi)毒素休克可以由TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)，并且天然存在的內(nèi)源AspRS片段可以刺激TLR，所以本文提供的某些結(jié)合劑、反義試劑或RNAi 試劑通過拮抗或以其他方式減少內(nèi)源AspRS片段所介導(dǎo)的TLR2和/或TLR4的刺激可以致使個體對內(nèi)毒素休克具有更強的抵抗力。還包括治療免疫疾病的方法?？梢园凑毡景l(fā)明治療的示例性免疫系統(tǒng)疾病、病癥或疾病狀態(tài)包括，但不限于，原發(fā)性免疫缺陷、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥、川崎綜合征、骨髓移植(例如，成年人或兒童的新近骨髓移植)、慢性B細胞淋巴細胞性白血病、HIV感染(例如，成年人或兒童的HIV感染)、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、輸血后紫癜等。此外，其他的疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括格林巴利綜合征、貧血癥(例如，細小病毒B19相關(guān)的貧血癥、具有高感染風險的患有穩(wěn)定多發(fā)性骨髓瘤的患者(例如，復(fù)發(fā)性感染)、自身免疫性溶血性貧血(例如，溫型自身免疫性溶血性貧血)、血小板減少癥(例如， 新生兒血小板減少癥)和免疫介導(dǎo)的嗜中性白細胞減少癥、移植(例如，巨細胞病毒(CMV) 陽性器官的CMV陰性接受體)、低丙球蛋白血癥(例如，具有感染或發(fā)病風險因素的低丙球蛋白血癥新生兒)、癲癇(例如，難治性癲癇)、系統(tǒng)性血管炎綜合征、重癥肌無力(例如，重癥肌無力的代償失調(diào))、皮肌炎和多肌炎。其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括，但不限于，自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性新生兒血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性血細胞減少、 溶血性貧血、抗磷脂綜合征、皮炎、變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎、心肌炎、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、風濕性心臟病、腎小球性腎炎(例如，IgA腎病)、多發(fā)性硬化、神經(jīng)炎、葡萄膜炎性眼炎、多內(nèi)分泌腺病、紫癜(例如，過敏性紫癜(Henloch-Scoenlein purpura))、萊特爾氏病、僵人綜合征、 自身免疫性肺部炎癥、吉蘭-巴雷綜合征、胰島素依賴性糖尿病和自身免疫炎性眼病。其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括，但不限于，自身免疫性甲狀腺炎； 甲狀腺機能減退，包括橋本氏甲狀腺炎和特征例如為細胞介導(dǎo)和體液甲狀腺細胞毒性的甲狀腺炎；SLE(其特征通常為例如循環(huán)和局部產(chǎn)生的免疫復(fù)合物)；庫德帕斯徹氏綜合征 (其特征通常為例如抗基底膜抗體)；天皰瘡(其特征通常為例如表皮棘層松解抗體)；受體自身免疫，例如，葛瑞夫茲氏病(其特征通常為例如促甲狀腺激素受體抗體)、重癥肌無力(其特征通常為例如乙酰膽堿受體抗體)；胰島素抗性(其特征通常為例如胰島素受體抗體)；自身免疫性溶血性貧血(其特征通常為例如抗體致敏的紅細胞的吞噬作用)；和自身免疫性血小板減少性紫癜(其特征通常為例如抗體致敏的血小板的吞噬作用)。其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括，但不限于，風濕性關(guān)節(jié)炎(其特征通常為例如關(guān)節(jié)中的免疫復(fù)合物)；伴隨抗膠原蛋白抗體的硬皮病(其特征通常為例如核仁和其他的核抗體)；混合性結(jié)締組織病(其特征通常為例如諸如核糖核蛋白的可提取性核抗原的抗體)；多炎癥/皮肌炎(其特征通常為例如非組蛋白抗核抗體)；惡性貧血(其特征通常為例如抗壁細胞、抗微粒體和抗內(nèi)因子抗體)；特發(fā)性阿狄森病(其特征通常為例如體液和細胞介導(dǎo)的腎上腺細胞毒性)；不育癥(其特征通常為例如antispermatozoal抗體)；腎小球性腎炎(其特征通常為例如小球基底膜抗體或免疫復(fù)合物)；原發(fā)性腎小球性腎炎、IgA腎?。淮蟀捫灶愄彀挴?其特征通常為例如基底膜中的IgG和補體)；舍格倫綜合征(其特征通常為例如多組織抗體和/或特異性非組蛋白抗核抗體(SS-B))；糖尿病 (其特征通常為例如細胞介導(dǎo)的和體液胰島細胞抗體)；和腎上腺素抗藥性，包括伴有哮喘或囊性纖維化的腎上腺素抗藥性(其特征通常為例如β腎上腺素受體抗體)。其他的自身免疫性疾病、病癥和疾病狀態(tài)包括，但不限于，慢性活動型肝炎(其特征通常為例如平滑肌抗體)；原發(fā)性膽汁性肝硬化(其特征通常為例如抗線粒體抗體)；其他的內(nèi)分泌腺衰竭(其特征通常為例如部分病例中的特異性組織抗體)；白癜風(其特征通常為例如抗黑色素細胞抗體)；脈管炎(其特征通常為例如血管壁中的免疫球蛋白和補體和/或低血清補體)；心肌梗塞后疾病狀態(tài)(其特征通常為例如抗心肌抗體)；心切開術(shù)綜合征(其特征通常為例如抗心肌抗體)；風疹(其特征通常為例如對IgE的IgG和IgM抗體)；特應(yīng)性皮炎(其特征通常為例如抗IgE的IgG和IgM抗體)；哮喘(其特征通常為例如對IgE的IgG和IgM抗體)；炎性肌??；和其他炎性病癥、肉芽腫性病癥、退行性病癥和萎縮性病癥。還包括調(diào)節(jié)造血作用和相關(guān)病理狀態(tài)的方法。本發(fā)明的AspRS多肽可以調(diào)節(jié)的造血過程的實例包括，但不限于，骨髓細胞(例如，紅系細胞，肥大細胞、單核細胞/巨噬細胞，髓樣樹突狀細胞，諸如嗜堿性粒細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的粒細胞，巨核細胞，血小板)和淋巴細胞(例如，自然殺傷細胞、淋巴樣樹突狀細胞、B細胞和T細胞)的形成。某些特定的造血過程包括紅細胞生成、粒細胞生成、淋巴細胞生成、巨核細胞生成、血小板生成等。還包括調(diào)節(jié)造血細胞的轉(zhuǎn)運或動員的方法，所述造血細胞包括造血干細胞、祖細胞、紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、巨核細胞和血小板?？梢栽隗w內(nèi)、體外、離體或以上的任意組合進行調(diào)節(jié)造血作用的方法。這些方法可以在含有造血干細胞，造血祖細胞，或可以向造血譜系分化的其他干細胞或祖細胞(例如， 脂肪組織來源的干細胞)的任何生物樣品，細胞培養(yǎng)物或組織上進行。對于體外和離體方法，可以根據(jù)本文所述且本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)和特征分離和/或鑒定無論是造血來源還是其他來源的干細胞和祖細胞。在其他的實施方案中，本發(fā)明的AspRS組合物可以用于調(diào)節(jié)細胞增殖和/或存活， 并且因此，用于治療或預(yù)防特征為細胞增殖和/或存活異常的疾病、病癥或疾病狀態(tài)。例如，在某些實施方案中，AspRS組合物可以用于調(diào)節(jié)凋亡和/或治療異常凋亡相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)。凋亡是用于描述被稱為程序性細胞死亡的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的術(shù)語。對于誘導(dǎo)凋亡的分子(例如癌癥)，以及抑制凋亡的分子(即，中風、心肌梗塞、膿毒癥等)存在各種治療指征?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的任何技術(shù)監(jiān)測凋亡，包括例如，檢測DNA斷裂、膜不對稱性改變、凋亡半胱天冬酶激活和/或細胞色素C和AIF釋放的測定。增加的細胞存活或抑制凋亡相關(guān)的示例性疾病包括，但不限于，癌癥(諸如濾泡性淋巴瘤、癌和激素依賴性腫瘤，包括，但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細胞瘤、黏液瘤、肌瘤、淋巴瘤、 內(nèi)皮瘤、成骨細胞瘤、破骨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波濟氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫性病癥(諸如，多發(fā)性硬化、舍格倫綜合征、葛瑞夫茲氏病、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)的腎小球性腎炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板減少性紫癜和風濕性關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(諸如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎癥、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、急性移植排斥和慢性移植排斥。增加的細胞存活相關(guān)的其他示例性疾病或疾病狀態(tài)包括，但不限于，惡性腫瘤和相關(guān)病癥的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移，諸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細胞性白血病；包括成髓細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、骨髓單核細胞性白血病、單核細胞性白血病和紅白血病在內(nèi)的急性髓細胞性白血病)和慢性白血病(例如，慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病))、骨髓增生異常綜合征、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦氏巨球蛋白血癥、重鏈病、和實體腫瘤，所述實體腫瘤包括，但不限于，肉瘤和癌，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺瘤、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威姆氏瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。增加的凋亡相關(guān)的示例性疾病包括，但不限于，AIDS (諸如HIV誘導(dǎo)的腎病和HIV 腦炎)、神經(jīng)退行性病癥(諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)束硬化癥、色素性視網(wǎng)膜炎、小腦退變和腦瘤或與之前相關(guān)疾病)，自身免疫性病癥(例如多發(fā)性硬化、舍格倫綜合征、葛瑞夫茲氏病、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩氏病、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫相關(guān)的腎小球性腎炎、自身免疫性胃炎、血小板減少性紫癜和風濕性關(guān)節(jié)炎)、骨髓增生異常綜合征(例如再生障礙性貧血)、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、缺血性損傷(諸如由心肌梗塞、中風和再灌注性損傷引起的損傷)、肝損傷或疾病(例如，肝炎相關(guān)的肝損傷、肝硬化、缺血/再灌注性損傷、膽汁淤積癥(膽管損傷)和肝癌)、毒素誘導(dǎo)的肝疾病(諸如由酒精引起)、膿毒性休克、潰瘍性結(jié)腸炎、惡病質(zhì)和厭食癥。在其他的實施方案中，本發(fā)明組合物可以用于神經(jīng)元/神經(jīng)病學疾病或病癥的治療中，其示例性實例包括，帕金森氏癥、阿耳茨海默氏病、皮克氏病、克羅伊茨費爾特雅各布氏病、亨廷頓氏舞蹈病、交叉性肢體癱瘓、肌萎縮性側(cè)束硬化癥、共濟失調(diào)、大腦性癱瘓、慢性疲勞綜合癥、慢性疼痛綜合癥、先天性神經(jīng)異常、腦神經(jīng)疾病、譫妄、癡呆、脫髓鞘病、家族性自主神經(jīng)異常、癲癇、頭痛、亨廷頓氏舞蹈病、腦積水、腦膜炎、運動障礙、肌病、神經(jīng)系統(tǒng)瘤、神經(jīng)皮膚綜合征、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)毒性綜合癥、眼球運動障礙、周圍神經(jīng)系統(tǒng)病癥、垂體病癥、腦穿通畸形、瑞特綜合征、睡眠障礙、脊髓病癥、中風、西登哈姆氏舞蹈病、圖雷特綜合癥、神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和損傷等。此外，其他的實施方案涉及使用本發(fā)明組合物治療代謝性病癥，所述代謝性病癥例如腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克利伯病(球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、亞歷山大病、Canavan氏病(海綿樣腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)、佩利措伊斯_梅茨巴赫病、科凱恩綜合征、賀勒氏疾病、勒韋氏綜合征、利氏病、威爾遜氏病、哈勒沃登-施帕茨病、泰-薩克
54斯病等。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的任何技術(shù)來監(jiān)測本發(fā)明組合物在調(diào)節(jié)代謝過程中的功效，包括例如，檢測脂肪細胞脂肪生成或脂肪細胞脂解的測定。在本發(fā)明的更具體的實施方案中，本發(fā)明的AspRS組合物可用于調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(例如，Akt)?？梢杂萌魏我阎臏y定監(jiān)測細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 例如，可以通過多種靶蛋白的改變的磷酸化模式來監(jiān)測總體細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的發(fā)生。因此，響應(yīng)于細胞的AspRS多肽處理的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的檢測可以作為不同生物效應(yīng)的指示?？梢赃@樣選擇用于該測定的靶蛋白，使其包括主要細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的關(guān)鍵組分，從而提供細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況及其治療相關(guān)性的廣泛描述。通常，這類測定涉及用AspRS多肽處理細胞，隨后是使用特異性檢測靶蛋白的磷酸化(活化)形式的抗體的免疫檢測。用來監(jiān)測治療相關(guān)性細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的示例性靶蛋白可以包括，但不限于 P38MAPK(促分裂原活化蛋白激酶，其由細胞應(yīng)激和炎性細胞因子激活，參與細胞分化和凋亡)；SAPK/JNK (應(yīng)激激活的蛋白激酶/Jim氨基末端激酶，其由細胞應(yīng)激和炎性細胞因子激活)；Erkl/2、p44/42MAPK (促分裂原活化蛋白激酶Erkl和Erk2，其由廣泛的細胞外信號激活，參與細胞生長和分化的調(diào)節(jié))；和Akt (由胰島素和各種生長或存活因子激活，參與凋亡的抑制、糖原合成調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)節(jié)和細胞生長)。也可以監(jiān)測酪氨酸殘基的總體磷酸化， 作為磷酸化介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變的一般指示。當然，應(yīng)當理解，也可以分析諸如細胞粘附分子(例如，鈣粘蛋白、整聯(lián)蛋白、閉合蛋白、連環(huán)蛋白、選擇蛋白等)和/或離子通道蛋白的其他蛋白種類，用于監(jiān)測本發(fā)明組合物調(diào)節(jié)的細胞事件或活性。在本發(fā)明的其他具體實施方案中，本發(fā)明的AspRS組合物可用于調(diào)節(jié)細胞的細胞因子產(chǎn)生，例如，諸如單核細胞和/或淋巴細胞的免疫細胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的任何測定(即，RT-PCR、ELISA、ELISpot、流式細胞術(shù)等)來監(jiān)測細胞因子的產(chǎn)生。通常，這類測定涉及用AspRS多肽處理細胞，然后檢測細胞因子mRNA或多肽以測量細胞因子產(chǎn)生的變化。因此，響應(yīng)于細胞的AspRS多肽處理的細胞因子產(chǎn)生的增加和/或減少的檢測可以作為不同生物效應(yīng)的指示。通過調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生，本發(fā)明的AspRS多肽可以引發(fā)、增強和/ 或抑制免疫應(yīng)答或炎癥應(yīng)答。例如本發(fā)明的AspRS多肽和組合物可用于改變個體中的細胞因子譜(即，1型與2型)。用于監(jiān)測AspRS組合物的生物效應(yīng)，可以測量的示例性的細胞因子包括，但不限于，IL-lra, IL-1 α、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-10, IL-12, IL-12p40, IL-15, IL-18, IL-23, TGF-β、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN- γ , RANTES,MIP-I α、MIP-I β、MCP-I、GRO-α、GM-CSF、G-CSF 等。通過引用將本說明書所引用的所有出版物和專利申請并入本文，如同特別和單獨指出通過引用并入每一個單獨的出版物或?qū)＠暾?。盡管出于清楚理解的目的，以說明和舉例的方式詳細地描述了上述發(fā)明，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在不脫離附加的權(quán)利要求的實質(zhì)和范圍的情況下可以進行某些改變和修改。提供下述實施例僅為說明而并非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易意識到，可以改變和修改多種非關(guān)鍵參數(shù)而產(chǎn)生本質(zhì)上相似的結(jié)果。
實施例實施例1 人天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)片段的產(chǎn)生
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表達具有如SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列的全長重組人AspRS，并使用鎳IMAC 層析從大腸桿菌中純化所述全長重組人AspRS。為了通過受控制的蛋白水解產(chǎn)生AspRS片段，用42nM人嗜中性彈性蛋白酶處理所述全長蛋白30分鐘，然后通過在4-12% MOPS或 12 % MES緩沖液中運行SDS-PAGE (圖IC禾Π D)分離片段。在4-12 % MOPS中的SDS-PAGE 凝膠上運行的消化物僅顯示一個約19kDa的蛋白片段(圖1C)，而在12% MES緩沖液中的 SDS-PAGE凝膠上運行的消化物顯示至少三個額外的3-6kDa的較小的肽片段(圖1D)。實施例2 =AspRS片段激活內(nèi)皮細胞中Akt在37°C C下，通過將42nM的嗜中性彈性蛋白酶添加到2 μ g全長重組AspRS中持續(xù)30分鐘產(chǎn)生AspRS片段庫。通過添加超過蛋白酶10倍的α 1-抗胰蛋白酶(Serpin Al) 來終止反應(yīng)。用50ηΜ未切割的或用嗜中性彈性蛋白酶切割的全長AspRS蛋白的庫來處理牛大動脈內(nèi)皮細胞(bAEC)。將細胞與AspRS片段孵育10和15分鐘，收獲細胞并用抗體進行免疫印跡，該抗體僅特異性識別信號分子Akt的磷酸化(活化)形式。該處理通過磷酸化作用導(dǎo)致Akt強的可重復(fù)的活化(圖2A和2B)。由于Akt在凋亡、糖原合成、細胞周期和細胞生長的調(diào)節(jié)中的作用，所以該效應(yīng)是有意義的。實施例3 =AspRS上嗜中性彈性蛋白酶切割位點的鑒定用LC/MS/MS分析通過嗜中性彈性蛋白酶切割所產(chǎn)生的片段(圖1D)以確定每個片段的準確的量。此外，從在4-12%的MOPS或12%的MES緩沖液中運行的SDS-PAGE凝膠切下單獨的片段并進行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化，隨后用LC/MS/MS分析，從而鑒定片段產(chǎn)生自全長蛋白的哪個部分并鑒定歸因于嗜中性彈性蛋白酶的非胰蛋白酶切割位點。這些肽邊界的特征在表2中簡述。表2-AspRS 肽邊界
權(quán)利要求
1.具有非常規(guī)生物活性的分離的天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)多肽或其活性變體。
2.如權(quán)利要求1所述的天冬氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述非常規(guī)生物活性選自 細胞增殖的調(diào)節(jié)、凋亡的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)、細胞分化的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、細胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、Akt介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、細胞代謝的調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生和/或活性的調(diào)節(jié)和toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的天冬氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽是SEQID NO 1所示的全長人天冬氨酰-tRNA合成酶序列的片段。
4.如權(quán)利要求1所述的分離的天冬氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述其活性變體是這樣的多肽該多肽沿其長度與SEQ ID NO 1所示的人天冬氨酰-tRNA合成酶序列具有至少 80%或90%的同一性。
5.如權(quán)利要求1所述的分離的天冬氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽基本上由SEQ ID NO 1的氨基酸殘基1-31、1-巧4、1-171或1_174，或以上的活性片段或變體組成。
6.融合多肽，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的多肽和異源融合伴侶。
7.包含至少一種權(quán)利要求1所述的分離的天冬氨酰-tRNA合成酶多肽的二聚體復(fù)合物或多聚體復(fù)合物。
8.編碼權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽的分離的多核苷酸或其互補物。
9.包含權(quán)利要求8所述的分離的多核苷酸的表達載體。
10.包含權(quán)利要求9所述的表達載體的宿主細胞。
11.與權(quán)利要求8所述的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸。
12.如權(quán)利要求11所述的寡核苷酸，其選自引物、探針和反義寡核苷酸。
13.結(jié)合劑，其表現(xiàn)出對于權(quán)利要求1所述的分離的AspRS多肽、所述AspRS多肽的細胞結(jié)合伴侶或以上二者的結(jié)合特異性。
14.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其選自抗體、所述抗體的抗原結(jié)合片段、肽、肽模擬物、小分子和適體。
15.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑拮抗所述AspRS多肽的非常規(guī)活性。
16.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑激動所述AspRS多肽的非常規(guī)活性。
17.測定樣品中天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRQ多肽的存在或水平的方法，包括使所述樣品與一種或多種結(jié)合劑接觸，檢測是否存在所述結(jié)合劑，從而測定所述AspRS多肽的存在或水平，所述結(jié)合劑與權(quán)利要求1-6中任一項所述的AspRS多肽特異性結(jié)合。
18.測定樣品中天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRQ多肽的存在或水平的方法，包括將所述樣品導(dǎo)入分子檢測器中，從而測定所述AspRS多肽的存在或水平，所述分子檢測器能特異性地鑒定權(quán)利要求1-6中任一項所述的AspRS多肽。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分子檢測器是質(zhì)譜儀(MS)。
20.如權(quán)利要求17或18所述的方法，包括將所述AspRS蛋白片段的存在或水平與對照樣品或預(yù)定值比較。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，包括表征所述樣品的狀態(tài)以將其與對照區(qū)分。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述樣品與對照包括細胞或組織，并且所述方法包括區(qū)分不同物種的細胞或組織、不同組織或器官的細胞、不同細胞發(fā)育狀態(tài)的細胞、不同細胞分化狀態(tài)的細胞、或健康與患病的細胞。
23.鑒定與權(quán)利要求1-6中任一項所述的天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRQ多肽或一種或多種該多肽的細胞結(jié)合伴侶特異性結(jié)合的化合物的方法，包括a)在合適的條件下使所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶或以上二者與至少一種受試化合物組合，和b)檢測所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶或以上二者與所述受試化合物的結(jié)合，從而鑒定與所述 AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶或以上二者特異性結(jié)合的化合物。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述受試化合物是多肽或肽、抗體或其抗原結(jié)合片段、肽模擬物或小分子。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述受試化合物激動所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶的非常規(guī)生物活性。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述受試化合物拮抗所述AspRS多肽或其細胞結(jié)合伴侶的非常規(guī)生物活性。
27.通過權(quán)利要求23-26中任一項所述的方法鑒定的化合物
28.組合物，其包含生理可接受的載體和至少一種選自以下的組分(i)權(quán)利要求1所述的分離的多肽；( )權(quán)利要求6所述的融合蛋白；(iii)權(quán)利要求7的二聚體復(fù)合物或多聚體復(fù)合物；(iv)權(quán)利要求8所述的分離的多核苷酸；(ν)權(quán)利要求9所述的表達載體； (vi)權(quán)利要求11所述的寡核苷酸；(vii)權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑和(viii)權(quán)利要求27 所述的化合物。
29.調(diào)節(jié)細胞活性的方法，包括使細胞或組織與權(quán)利要求觀所述的組合物接觸。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述細胞活性選自細胞遷移、細胞增殖、凋亡、炎癥、細胞分化、血管生成、細胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、Akt介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞代謝、細胞因子產(chǎn)生和toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述細胞活性是細胞因子產(chǎn)生。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細胞因子是選自以下的任何一種或多種 ILl-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL_12p40、MIPl- α、MIP-I β、GRO- α、MCP-I 或 IL-Ira0
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細胞活性是toll樣受體(TLR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述TLR是TLR2、TLR4或以上二者。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述方法是激發(fā)天然免疫應(yīng)答的方法。
36.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述細胞位于個體中。
37.治療疾病狀態(tài)的方法，包括將權(quán)利要求四所述的組合物給予需要治療的個體，其中所述疾病狀態(tài)選自炎性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤疾病、代謝疾病、神經(jīng)疾病、感染、心血管疾病和異常血管生成相關(guān)的疾病。
全文摘要
提供了具有非常規(guī)生物活性的分離的天冬氨酰-tRNA合成酶多肽和多核苷酸，以及與其相關(guān)的組合物和方法。
文檔編號A61K38/43GK102449143SQ201080023661
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者伊夫·馬瑞曼, 伊娃·R·阿莫爾, 克瑞斯迪·佩耶爾, 洪非, 肯尼·達里格, 萊斯利·A·格林尼, 賴安·A·亞當斯, 趙基 申請人:Atyr醫(yī)藥公司