專利名稱：由Burkholderia contaminans菌株產(chǎn)生的獨特的抗真菌糖肽Occidiofungin的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌化合物及其在預(yù)防或治療真菌性感染或疾病的治療應(yīng)用的領(lǐng)域。 本發(fā)明涉及新型抗真菌化合物作為藥用和農(nóng)用殺真菌劑在動物和植物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生該新型抗真菌化合物的菌株。
背景技術(shù)：
本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療真菌性感染的新型抗真菌糖肽類化合物以及與其相關(guān)的至少一個新型氨基酸殘基。本發(fā)明在優(yōu)選實施方案中還提供了藥用和農(nóng)用組合物，其包括用于治療或預(yù)防真菌性感染的該新型化合物及其鹽?？紤]到病原體對當前抗真菌劑的抗性普遍增強，新型抗真菌劑的需求在不斷增長。當前有四種主要的抗真菌劑治療組多烯抗真菌劑、唑類抗真菌劑、烯丙胺類抗真菌劑和棘白菌素類(echinocandins)。前三組主要靶向麥角固醇產(chǎn)物或與麥角固醇結(jié)合， 破壞真菌的膜。麥角固醇與哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的膽固醇很像，對于維持細胞適宜的滲透性和流動性十分重要。第四組棘白菌素類是合成-修飾的脂肽，源自產(chǎn)生于構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)的天然化合物棘白菌素B (echinocandin B)。在真菌中，兩個共價交聯(lián)的多糖(1，3)-β-葡聚糖和幾丁質(zhì)(chitin)形成負責(zé)細胞壁結(jié)構(gòu)完整性和形狀的主要構(gòu)架?？拐婢鷦┑募拙仡愐种?1，3)-β-葡聚糖合成酶，該酶為使尿苷二磷酸葡葡糖聚合為(1，:3)-β-葡聚糖聚合物的酶復(fù)合物。伯克霍爾德菌屬(Burid10Ideria) —些菌株的顯著特點是產(chǎn)生各種抗真菌化合物，使該有機體具有用于真菌性疾病控制的潛力。然而，從膽囊纖維癥患者分離的伯克霍爾德菌(Buricholderia spp.)被重新分類為機會性病原體，因此妨礙該細菌直接用于真菌性疾病控制。對作為所觀察伯克霍爾德菌株的植物疾病抑制活性來源的抗真菌劑的分離和鑒別，將為開發(fā)生物殺真菌劑提供重要的途徑，而且消除了直接使用細菌帶來的潛在健康風(fēng)險。由于免疫功能不全患者的真菌性感染的重要性，以及現(xiàn)有可獲得抗真菌劑因其活性譜和毒性的限制，因此需要新型抗真菌劑。而且，新的抗真菌劑對于充足且可負擔的食物供給的生產(chǎn)和食品保存有重要的意義。本發(fā)明中，我們對命名為occidiofimgin，含義為真菌殺手的新型抗真菌化合物的結(jié)構(gòu)和活性進行了表征。該抗真菌劑的完全共價結(jié)構(gòu)已被T0CSY、 NOESY, ROESY和HSQC，2D NMR光譜實驗闡明。Occidiofungin對不同動物和真菌病原體的抗真菌活性已被檢測并證實。此外，暴露于亞致死濃度的Occidiofimgin后觀察到發(fā)生了膜形態(tài)畸變，類似于已有報道的棘白菌素類抗真菌劑，這表明Occidiofimgin也靶向細胞外被膜。這項工作為旨在理解該化合物的作用模式以及研究Occidiofimgin的藥學(xué)和農(nóng)學(xué)潛能的今后實驗提供了重要基礎(chǔ)。結(jié)果，殺 真菌劑領(lǐng)域存在對有效對抗對典型殺真菌劑具有抗性的動物和植物病原體的新型抗真菌化合物的需求，本發(fā)明提供了這樣的化合物和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種名稱為Occidiofimgin的新型抗真菌環(huán)狀糖肽化合物，其上連接新的氨基酸，還提供一種包含該化合物的組合物。本發(fā)明能有效地對抗廣譜的影響人、動物和植物的真菌性病原體。而且，本發(fā)明能破壞正常真菌的膜形態(tài)。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生該新型抗真菌化合物的新菌株。本發(fā)明是從Burkholderia contaminans菌株中純化得到，并包含八⑶個氨基酸殘基。一個氨基酸上連接?；湍咎恰Ｒ环N抗真菌組合物，其包括該新型化合物及其鹽和至少一種可接受的載體或稀釋劑用于目標施用。一種治療真菌性感染或疾病的方法，其包括在消除或減輕感染的條件下，向目標施用所述化合物和組合物一段時間。本發(fā)明前述提及的和其他目的、特征和優(yōu)點將在下文闡明，可以通過參考下面對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述和所附的權(quán)利要求更好地理解本發(fā)明的性質(zhì)。


這些附圖以及對本發(fā)明的詳述用于進一步解釋本發(fā)明及其優(yōu)點。附圖被組合在一起并形成說明書的一部分，來說明本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案，而且，與整個說明書一起， 用于向本領(lǐng)域技術(shù)人員解釋本發(fā)明優(yōu)選實施方案。圖1是occidiofimgin的共價結(jié)構(gòu)的說明。A圖中顯示了 occidiofimgin A和 occidiofungin B的代表性結(jié)構(gòu)。B圖中顯示了新型氨基酸NAA2的代表性結(jié)構(gòu)。在它們各自的原子旁邊給出了化學(xué)位移值(ppm)。NOE值寫在環(huán)的旁邊，箭頭表示質(zhì)子的相互作用。圖2是木糖標準品㈧和occidiofungin⑶的聚糖(glycan)的GC色譜的圖解； 兩個樣品都加了內(nèi)標。木糖標準品顯示兩個峰(Xyll和Xyl2)；基于兩個峰有同樣的遷移時間，occidiofungin聚糖被鑒定為木糖。圖 3 是 occidiofungin 的 TOCSY和 NOESY NMR譜圖的圖解。A 圖中，TOCSY 2D 匪R 譜的放大圖顯示了 occidiofungin A(黑色)和occidiofungin B (灰色)中每個指定殘基的α酰胺和側(cè)鏈自旋體系酰胺。B圖中，NOESY 2D NMR譜的放大圖顯示了 occidiofungin 中的短?；湍咎堑幕瘜W(xué)位移。?；?和3中的質(zhì)子與NAA的He質(zhì)子的NOE譜(灰色) 用箭頭標示區(qū)分。圖4是occidiofungin的NOES YNMR譜的圖解。放大圖顯示了 α酰胺和側(cè)鏈酰胺的相互作用。各自的氨基酸的相互作用在殘基間NOE譜圖上用紅色標在旁邊。 occidiofungin A和occidiofungin B的殘基分別用黑色和灰色標示。圖5是occidiofungin活性譜的表格和圖注。A圖中，示出了針對幾種植物和動物病原體的MIC值。MIC和MIC50分別代表100 %的生長抑制和大于50 %的生長抑制。B圖中， 顯示了產(chǎn)脂肪酶菌(Geotrichum candidum)的生物測試板。Al孔中的初始濃度是32 μ g/mL, C2孔中的最終濃度是62.5ng/mL。最后兩個孔用作陰性對照(無抗真菌化合物)。A4 孔是MIC50的最佳代表，其中超過了 50%的真菌生長被抑制。圖6是光學(xué)顯微鏡下的畫面圖示。A圖和B圖中，與對照(B圖)相比，立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)在亞抑菌濃度(A圖)下的生長觀察到明顯的菌絲形態(tài)的變化。黑色箭頭指向的是細胞內(nèi)的內(nèi)含物形成，白色箭頭指向的是膜畸變。C圖和D圖中，產(chǎn)脂肪酶菌暴露于4μ g/mL的occidiofimgin 48小時(C圖)，與對照(D圖)相比，其結(jié)果是細胞明顯腫脹。圖7是透射電鏡的畫面圖示。產(chǎn)脂肪酶菌暴露于4 μ g/mL的occidiofimgin 48小時(B圖)，與對照(A圖)相比，其結(jié)果是明顯的形態(tài)變化。與對照相比，細胞壁厚度大大減小。經(jīng)處理的產(chǎn)脂肪酶菌外細胞壁出現(xiàn)剝落(黑色箭頭)。鑒于處理的樣品內(nèi)部缺少對照物(白色箭頭)，這表明細胞溶解和細胞內(nèi)容物流出。C圖所示為含有暴露于occidiofimgin 中的幾個分節(jié)孢子的較寬視野。圖A、B和C的放大倍數(shù)均為8000倍。發(fā)明詳述本發(fā)明的新型抗真菌環(huán)狀糖肽化合物能有效對抗廣泛的真菌性感染。本文公開了該化合物的結(jié)構(gòu)，以及與其連接的至少一個新型氨基酸的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明另一個實施方案中，一種抗真菌組合物，其包括該新型化合物及其鹽以及至少一種藥用或農(nóng)用載體或稀釋劑，在需要真菌療法和治療時施用于人、動物和/或植物目標(subject)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生包括本發(fā)明所述抗真菌化合物的新分離的菌株。出于公開的目的，各縮寫詞如下NMR，核磁共振；Ν0Ε，核歐沃豪斯效應(yīng)；N0ESY，二維核歐沃豪斯效應(yīng)譜；T0CSY，全相關(guān)譜；R0ESY，旋轉(zhuǎn)坐標系二維核歐沃豪斯效應(yīng)譜；HSQC， 異核單量子相關(guān)譜；ESI-MS，電噴霧離子化質(zhì)譜；MS/MS，串聯(lián)質(zhì)譜；GC，氣相色譜-質(zhì)譜； NRPS，非核糖體肽合成酶；NAA，新型氨基酸；MIC，最小抑菌濃度。除非特別指明，分子術(shù)語為其通常含義。術(shù)語“酰基(acyl)定義為一個羰基自由基接在烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基上，實例包括但不限于自由基如乙?；捅锦；Ｔ~語“治療有效量”定義為真菌與所述化合物或組合物接觸，足以導(dǎo)致殺真菌效果的給藥量。藥學(xué)上或農(nóng)業(yè)上組合物的治療有效量取決于含有該組合物的成分和組分以及治療理論。本發(fā)明中，菌株BurWiolderia contaminans MS 14是從抑制草坪草褐斑病的土壤中分離。該新型抗真菌化合物是從這種細菌的液體培養(yǎng)基中純化而得。兩種純化的緊密相關(guān)的抗真菌化合物的完全共價結(jié)構(gòu)通過T0CSY、N0ESY、R0ESY、13C HSQC 2D NMR、ESI_MS和 GC確定。純化的制備產(chǎn)物的單一同位素質(zhì)量分析表明存在兩種相關(guān)的化合物，測定的質(zhì)量為1199. 543Da和1215. 518Da ；該差異是由一個氧原的質(zhì)量產(chǎn)生的。GC分析表明該抗真菌化合物連接一個木糖。NMR實驗表明該化合物是環(huán)狀的，包括八個氨基酸，其中兩個是Tyr 和Asn的羥基衍生物，一個是新型的氨基酸。該新型氨基酸作為構(gòu)架連接木糖與短?；湣？拐婢钚缘幕钚宰V和濃度通過微量滴定盤檢測進行確定。該抗真菌化合物對廣泛的真菌性植物和動物病原體及兩種腐霉菌(Pythium spp.)具有強大的抗真菌活性。顯微鏡觀察表明該抗真菌化合物破壞了正常的膜形態(tài)。暴露于抗真菌化合物的亞抑菌濃度下，真菌細胞充滿了大量包涵體，膜變?yōu)榛尾⒛[脹。我們的數(shù)據(jù)支持新型抗真菌劑的認定，該化合物被命名為occidiofungin，意為真菌殺手。Burkholderia contaminans菌株MS 14是預(yù)先從抑病土壤中分離出來的，該土壤中土壤傳播的病原體在對宿主植物的損害很少或沒有。對這種菌株的最初表征表明它抑制廣譜真菌病原體的生長。接下來，轉(zhuǎn)座子突變確證了產(chǎn)生抗真菌活性的基因組區(qū)域，56-kb 基因DNA片斷已測序并存儲于GenBank，登錄號為EU938698。這個基因組區(qū)域包括幾個開放閱讀框，其中一些編碼調(diào)節(jié)蛋白、環(huán)狀肽轉(zhuǎn)運載體、糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶和非核糖體肽合成酶(NRPS)催化模塊。分離該抗真菌化合物，氨基酸分析證實該抗真菌化合物的骨架是一個通過NRPS機理合成的寡肽。
實驗規(guī)程所有的化學(xué)試劑均購自Sigma (St. Louis，M0)，且除非特別指出，均是最高級別。按照前面所述的方法合成和純化Occidiofungin。質(zhì)譜。該抗真菌化合物活性部分用電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)分析，使用 Micromass Q-TOF II質(zhì)譜儀。將該化合物溶于50/50的乙腈/水(ν/ν)的0.1%甲酸溶液中，用Harvard注射泵以1 μ L/min流速注入該同樣的溶劑。流體用納米LC接口進行噴霧。 以單電荷離子用標準碰撞能(34V)及較高的碰撞能(50V)進行串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)。單糖組分分析。純化的occidiofungin中的單糖通過氣液色譜分析確定為甲基葡糖苷三氟醋酸酯(trifiuoroacetate of methyl glycoside)。通過裝配25_m熔融石英 (內(nèi)徑 0. 22-mm)0V-1701WC0T 柱(Chrompack，Bridgewater, NJ)和電子捕獲檢測器的氣相色譜分析儀(5890型，Hewlett-Packard, Sacramento, CA)進行分析。同時處理糖標準品 (戊糖、己糖、N-乙酰氨基己糖)作為測試化合物，基于與糖標準品的色譜圖進行比較，確定 occidiofungin中的糖。山梨醇為內(nèi)標。NMR光譜。Occidiofiingin不溶于適于NMR測試所需濃度的水溶液。因此，在總體積為700 μ L的50%乙腈_d3(劍橋同分異構(gòu)，Cambridge Isotopes)和50%水中制備5mM Occidiofiingin 樣品。NMR 數(shù)據(jù)由 Varian NMR 系統(tǒng) Cold Probe 分光儀采集，在 800MHz 的質(zhì)子頻率下操作。按照TOCSY和NOESY儀器的標準方法指認1H共振。ROESY和13C-HSQC 實驗用于澄清TOCSY和NOESY光譜的模糊區(qū)。TOCSY、NOESY和13C HSQC NMR實驗在25°C下采集，ROESY實驗于4°C下采集。載波頻率以水的共振為中心，用極有效的雙脈沖梯度選擇回波共振技術(shù)控制。掃描之間有1.5s的弛豫延遲。TOCSY實驗用DIPSI-2序列設(shè)定60ms 的混合時間。NOESY和ROESY實驗分別設(shè)定400ms和IOOms的混合時間。將采集HSQC譜的參數(shù)優(yōu)化，以觀察脂肪族CH基團(轉(zhuǎn)移延遲時間調(diào)整為140Hz耦合常數(shù)，13C補償設(shè)置為 35ppm)。T0CSY、N0ESY 和 ROESY 的光譜掃描寬度在二維上均為 9000Hz (11. 25ppm)。HSQC 的光譜掃描寬度在質(zhì)子維度上為9000. OHz (11. 25ppm)、碳維度上為21，200. OHz (105. 5ppm)。 除了 HSQC數(shù)據(jù)分別在直接和間接維度的1024和192復(fù)點采集外，所有2維數(shù)據(jù)均在獲得維度的8192復(fù)點和間接維度上的320 512復(fù)點采集。N0ESY、ROESY和TOCSY實驗的相位感應(yīng)間接檢測通過States-TPPI法完成。利用梯度選擇高靈敏度增強脈沖序列采集HSQC 譜。1H化學(xué)位移以乙腈(1.93ppm)為參比。用nmrPipe軟件處理數(shù)據(jù)，首先通過去卷積減去水殘留信號，乘以兩個維度數(shù)據(jù)的余弦平方函數(shù)，或者乘以608位移(對于HSQC譜中的IH 維度)的余弦平方函數(shù)，清零一次，傅立葉變換，基線修正。用交互式計算機程序NMR View處理數(shù)據(jù)。用NMR View測量NOE交叉峰強度。根據(jù)rab6 = r。al6 (V。al/Vab) >關(guān)聯(lián)計算距離， 其中rab是原子a和b之間的距離，Vab是NOESY譜中a到b交叉峰的體積，r。al是已知距離， V—是NOESY譜校準交叉峰的相應(yīng)體積。用于校準的距離為β-羥基Tyr4 Hs和Ηε芳香質(zhì)子(2.46 Λ)。微生物。真菌菌株來自美國密西西比州立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)研究診斷實驗中心 (Mississippi State University' s Veterinary Medical Research and Diagnostic Laboratory System)和昆蟲和植物病理學(xué)系保藏處，或購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection，]\fem￡iss￡is，Vel ) 。^石開胃|^_白勺
鏈抱霉(Alternaria alternata)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger.)、番爺鍵刀菌萎焉病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)ATCC9848、白地霉(Geotrichum candidum)F-260、桑樹內(nèi)生真菌(Macrophomina phaseolina)61、石膏樣小抱子菌(Microsporum gypseum)、青霉菌(Penicillium sp)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)MSCOT-I 禾口須發(fā)痛菌(Trichophyton mentagrophytes)。而且，對兩種腐霄屬的菌株也進行了試驗刺腐霉(Pythium spinosum) 472-04和終極腐霉(Pythium ultimum)671-04?？拐婢舾行栽囼?。最小抑菌濃度通過微量瓊脂稀釋法確定。Occidiofungin被無菌水連續(xù)兩倍稀釋(32 μ g/mL至62. 5ng/mL)，加入至平底的12孔板。每個孔注入一個(1) mL 沙保羅氏(Sabouraud)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 Difco (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ)。當瓊脂凝固后，平板倒置于4°C下保存待用。真菌培養(yǎng)物生長于100 X 15mm沙保羅氏葡萄糖瓊脂板(Thermo Fisher Scientific Remel Products，Lenexa，KS)上，22°C生長 7 天。 從真菌匯合生長的板區(qū)域制作一個圓形穿孔，其含有直徑Icm的瓊脂板真菌塞(plug)。將該真菌塞置于3mL PBS中，用Ten-brock均質(zhì)機以約30次擠壓進行研磨。將五(5) μ L上清液置于每個孔的中心，干燥，然后于22°C在微量滴定板上孵育。除須發(fā)癬菌(Trichophyton mentagrophytes)在72小時測定外，每種菌株在48小時測定最小抑菌濃度。MIC確定為抑制可見的真菌生長的最小濃度。MIC5tl值確定為與對照比較，抑制可見的菌群生長降低超過 50% (直徑)的濃度。顯微鏡檢查。前面所述的生長在平底12孔板的真菌用于檢驗occidiofungin對真菌菌絲和分節(jié)孢子的效果。對于每個真菌，取在48小時觀察到MIC5tl的與MIC孔相鄰生長的菌絲或分節(jié)孢子，制備光學(xué)顯微鏡和透射電鏡(TEM)的載玻片。對于光學(xué)顯微鏡，用乳酚棉藍液(lactophenol cotton blue solution) (sigma)作為陽性染色劑和載玻片裝載媒介。 對于TEM，在4°C用2. 5%戊二醛的0. IM磷酸緩沖液(pH 7. 2)固定白地霉(G. candidum)樣品。以緩沖液沖洗后，樣本用2%四氧化鋨的該磷酸緩沖液中再固定。用磷酸緩沖液清洗樣本后，用系列梯度乙醇(50 100% )脫水，然后包埋在Spurr樹脂中。用Reichert-Jung Ultracut E(Reichert-Jung Ultracut E Ultramicrotome) (60-90nm)
切片，如前述的用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。在透射電鏡Jeol JEM-I00CXII(Joel Ltd.，Tokyo, Japan)下觀察柵格，圖像放大倍數(shù)為5000 8000。結(jié)果Occidiofungin是一種環(huán)狀糖肽。高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示存在兩種結(jié)構(gòu)變體的抗真菌肽，一個的單一同位素質(zhì)量是1，199. 543Da,另一個的單一同位素質(zhì)量是1215. 518Da,其相應(yīng)于第一個化合物增加了氧。這些質(zhì)量與圖1中闡明的結(jié)構(gòu)相一致(計算的單一同位素質(zhì)量為1199. 5584和1215. 5533)。鑒于兩種結(jié)構(gòu)變體的存在，該抗真菌化合物的變體被稱為 occidiofungin A(l, 199. 5584Da)和 occidiofungin B(l, 215. 5533Da)。抗真菌化合物的ESI-TOF MS/MS分析是非決定性的，因為標準碰撞能量僅導(dǎo)致聚糖(glycan)的損失， 而擊碎抗真菌化合物所需的高碰撞能量產(chǎn)生了子離子的系列組合。然而，需要高分裂能量以產(chǎn)生碎片的事實說明該化合物是一個環(huán)狀肽。標準分裂方法只導(dǎo)致母離子中損失149Da， 表明有戊糖存在。GC分析表明連接在寡肽上的糖是木糖(圖2)。如先前所報道，氨基酸分析表明存在賴氨酸。然而，試圖用胰蛋白酶消化肽，沒有成功，可能是因為該化合物(數(shù)據(jù)未示出)特殊的結(jié)構(gòu)特征。抗真菌劑的肽沒有實現(xiàn)線性化，妨礙了后續(xù)的ESI-MS分析。 NMR被證實是用來確定抗真菌劑的寡肽結(jié)構(gòu)的可靠方法。為確定該抗真菌劑肽的完全共價結(jié)構(gòu)，我們采集了 TOCSY、NOESY、ROESY和HSQC數(shù)據(jù)。TOCSY和NOESY數(shù)據(jù)組提供了清楚的順序排列，ROESY和HSQC數(shù)據(jù)組用于支持證明基于質(zhì)子的排列。T0CSY/N0ESY數(shù)據(jù)組表明在光譜的酰胺質(zhì)子頻率中有13個明顯的自旋體系存在。自旋體系的數(shù)量比預(yù)期質(zhì)量為1199和1215Da的寡肽多。進一步的分析數(shù)據(jù)表明有氧化變體occidiofungin B在 TOCSY光譜(圖3A)的酰胺頻率中有幾個明顯的自旋體系存在。Occidiofungin A 包括 Asnl-新型氨基酸 2 (NAA2) _Trp3_ β -羥基 Tyr4-Lys5-Gly6-Asn7-Ser8 (圖1A)。氨基酸的數(shù)字排列歸因于測序數(shù)據(jù)指示出NRPS復(fù)合物中硫酯酶區(qū)域的位置；硫酯酶區(qū)域的位置通常被指定在寡肽的C末端。occidiofungin A的殘基1和7有Asn殘基的化學(xué)位移圖譜特征(表1)。NAA2有脫氨基賴氨酸的化學(xué)位移圖譜特征，連接有短?；?acyl)和木糖(圖IB和3B)。鑒于該殘基獨特的特征，其結(jié)構(gòu)在下面單獨討論。殘基3有Trp殘基的化學(xué)位移圖譜特征。該化合物中吲哚環(huán)上的質(zhì)子與Trp上的β質(zhì)子以及其他殘基之間不存在NOE效應(yīng)。這表明在溶劑中色氨酸環(huán)非受限制地旋轉(zhuǎn)，由于構(gòu)象的平均距離大于5Α,致使一個信號損失。色氨酸吲哚環(huán)的溶劑可接觸性(solvent accessibility)的進一步證據(jù)源自Trp的吲哚環(huán)NH( O的共振缺失。當吲哚環(huán)處于酸性PH值的溶劑中，吲哚環(huán)上的NH質(zhì)子與水環(huán)境的交換加速，由于譜線變寬導(dǎo)致信號缺失。殘基4是經(jīng)修飾的Tyr殘基。β碳被羥基化，導(dǎo)致β質(zhì)子明顯的低場位移至 5. 16ppm。在芳環(huán)δ質(zhì)子至β羥基Tyr的β質(zhì)子之間觀察到Ν0Ε，因而最后確定芳香質(zhì)子頻率的排列。殘基5、6和8分別有典型的Lys、GIy和Ser化學(xué)位移圖譜。Occidiofungin B與occidiofungin A的不同之處在于Asn 1的β碳被羥基化，導(dǎo)致位置1有β-羥基Asn 殘基。β碳的羥基化導(dǎo)致β質(zhì)子從2. 67ppm低場位移到4. 24ppm。而且，Asnl中β碳的羥基化導(dǎo)致ΝΑΑ2、Trp3、Asn7和SerS的酰胺質(zhì)子頻率產(chǎn)生明顯的化學(xué)位移變化，表明 occidiofungin A的整體構(gòu)象不同于occidiofungin B?？拐婢衔镏兴械腁sn殘基和β-羥基Asn殘基明確的排列均來自ROESY數(shù)據(jù)組，其中觀察到酰胺基團β質(zhì)子到δ 質(zhì)子之間的ROE效應(yīng)(數(shù)據(jù)未示出)。occidiofungin A 和 occidiofungin B 中的殘基 1 至 8 通過丨和 H0 丨至 HNi+1 的序貫行進(sequential walk)而順序排列。occidiofunginA 和 occidiofunginB 的 NOE 連通性在圖4中用紅色表示。能完成對occidiofungin的兩個變體進行完整的序貫行進。每個變體的Asnl的和H0與β -羥基Asnl的與ΝΑΑ2的Hn之間存在Ν0Ε。每個變體的NAA2的Ha、He和Hy與 ρ3的Hn之間存在ΝΟΕ。
ρ3與β -羥基Tyr4的Hn具有Ha質(zhì)子的ΝΟΕ。β -羥基Tyr4和Lys5的和H0與Lys5和Gly6的Hn之間分別存在Ν0Ε。每個變體的Gly6與Asn7的Hn具有質(zhì)子的Ν0Ε。其它的NOE存在于每個變體的Asn7的和H0與Ser8的Hn之間。此外，寡肽的環(huán)狀性質(zhì)的證據(jù)來自于occidiofunginA中Ser8的 Ha以及occidiofunginB中Ser8的Ha和H0分別與Asnl的Hn和β -羥基Asnl的Hn之間存在 Ν0Ε。在 occidiofunginA 和 occidiofunginB 的 NAA2 與 Trp3、Lys5 與 Gly6、Gly6 與 Asn7以及Asn7與Ser8中均觀察到Hn1與HNi+1的NOE (數(shù)據(jù)未示出)。在occidiofunginA 和occidiofunginB的Asnl與NAA2以及β -羥基Asnl與ΝΑΑ2之間觀察到其它的Hn1與 HNi+i 的 ΝΟΕ。因其獨特的結(jié)構(gòu)，殘基2示于圖IB中。ΝΑΑ2的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)類似于脫氨基的賴氨酸。 假定這一殘基由在基因組區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的負責(zé)合成該抗真菌化合物的酮酰酯合酶和轉(zhuǎn)氨酶形成(GiuSmith和Lu，未發(fā)表)。利用脫氨基的賴氨酸的元素指認作為參比，α、β、γ、δ， ε質(zhì)子的化學(xué)位移指認得到NOE數(shù)據(jù)的支持。觀察到ΝΑΑ2的Ha、H0、Hy與Trp3的Hn之間存在Ν0Ε。當質(zhì)子與Trp3的Hn距離增加時NOE強度下降(圖1B)。此外，如前面的NOE 所觀察到的，脫氨基的氨基酸-樣的末端氨基共價連接在前面的Asn殘基的羰基上。這一區(qū)域的化學(xué)位移分析表明，NAA2提供連接四個碳?；満湍咎堑幕w(表1)。數(shù)據(jù)支持在脫氨基的賴氨酸殘基中，酰基鏈連接在δ碳、木糖連接在β碳上。預(yù)期的這一區(qū)域中位于飽和碳上質(zhì)子的化學(xué)位移值約為1. 7ppm。β和δ質(zhì)子明顯從該預(yù)期向低場位移至4. ^ppm 和3.56ppm。這些質(zhì)子的化學(xué)位移變化表明基團存在吸電子基團，例如，其附近有氧。預(yù)測 δ和β碳上的雙鍵氧，其可能作為由酮酯酰合酶合成的脂肪酸的部分，被還原為羥基，隨后四個碳酰基鏈和木糖通過濃縮反應(yīng)連接。?；?和3上的質(zhì)子與脫氨基賴氨酸樣的殘基的He質(zhì)子之間存在NOE (圖1Β)，表明酰基連接于δ碳。分子中的％1~8殘基也支持木糖的連接。然而，缺乏任何明顯的預(yù)期的化學(xué)位移值變化，而明顯增加了 ΝΑΑ2中H0質(zhì)子大幅的低場位移。分子中木糖與其它殘基的連接導(dǎo)致木糖分子中失去一個氧，導(dǎo)致比前面描述的質(zhì)譜數(shù)據(jù)所觀察的更低的質(zhì)量。因此，ΝΑΑ2中的β碳最可能是連接木糖的位置。HSQC 數(shù)據(jù)提供了更多ΝΑΑ2的質(zhì)子與經(jīng)修飾殘基的碳共振的相關(guān)性。例如，Y碳的碳共振有兩個明顯的1. 89和1. 39ppm的質(zhì)子共振(圖1)。Occidiofimgin具有廣譜的抗真菌活性。針對于廣泛的真菌性植物和動物病原體，Occidiofimgin顯示了明顯的抗真菌活性(圖5)。絲核菌(R. solani)對MIC為 2 μ g/mL的真菌實驗最敏感，而且在0. 5 μ g/mL濃度時表現(xiàn)了明顯的生長抑制。煙曲霉菌(A. fumigatus)和黑曲霉菌(A. niger)通常引起侵襲性肺曲霉病，均分別易感于MIC 8 μ g/mL禾口 4 μ g/mL的Occidiofimgin。兩種相關(guān)的真菌，石膏樣小抱子菌(Microsporum gypseum)和須發(fā)癬菌(Trichophyton mentagrophytes)與皮膚癬菌病有關(guān)，都易感于MIC 4 μ g/mL的Occidiofimgin。更多的病原性真菌，青霉菌(Penicillium sp.)、互隔交鏈孢菌(Alternaria alternata)禾口桑樹內(nèi)生真菌(Macrophomina phaseolina),分另Ij顯示出易感于 MIC 32 μ g/mL>8 μ g/mL 禾口 2 μ g/mL 的 Occidiofimgin。真菌尖鍵抱菌(F. oxysporum) 對Occidiofimgin敏感性最低，MIC > 32 μ g/mL。然而一種動物和植物酵母病原體，白地霉菌在16 μ g/mL下觀察到明顯的生長抑制，在MIC 8μ g/mL下明顯受到抑制，4 μ g/mL生長被顯著抑制(圖5B)。次腐菌和終極腐菌對Occidiofimgin最敏感，MIC分別為1 μ g/mL和2 μ g/mL。這些數(shù)據(jù)表明Occidiofungin可應(yīng)用于作為針對抗植物和動物真菌性病原體的強效廣譜抗真菌劑。 Occidiofungin改變了膜的完整性。同齡的菌絲和細胞用于本研究中。將生長于亞抑制濃度的Occidiofungin (0. 5 μ g/mL)中的立枯絲核菌的菌絲與生長于無抗真菌化合物存在下的立枯絲核菌的菌絲進行比較。在此濃度下，立枯絲核菌生長的減少超過50% (圖 5A)。Occidiofungin導(dǎo)致明顯的菌絲形態(tài)變化，最明顯的變化之一就是細胞內(nèi)包涵體的形成(圖6，A和B，黑色箭頭)。另一個值得注意的區(qū)別是暴露于Occidiofungin后，菌絲尖端畸變和細胞膜波紋狀圖案(圖6，A和B，白色箭頭)。同樣的觀察結(jié)果出現(xiàn)在生長于亞抑制濃度下的桑樹內(nèi)生真菌的菌絲形態(tài)(未顯示)。與未經(jīng)處理的細胞相比，白地霉菌的節(jié)孢子暴露于4 μ g/mL Occidiofungin中48小時后有明顯的因細胞腫脹導(dǎo)致的不定形狀(圖6 中C圖和D圖)。TEM數(shù)據(jù)表明白地霉菌暴露于Occidiofungin亞抑制濃度48小時后，細胞壁厚度有急劇下降(圖7)。此外，經(jīng)處理的樣品中有細胞壁脫落(黑色箭頭)，表明細胞壁的完整性受到暴露于Occidiofungin的影響。處理后的白地霉菌缺少細胞內(nèi)部的對比， 表明細胞被溶解(白色箭頭)。很可能變薄的細胞壁不能維持滲透壓。鑒于分節(jié)孢子為圓柱形狀以及交叉切割它們的機率很高，由TEM數(shù)據(jù)不能得到腫脹的說明。幾個分節(jié)孢子的更寬視野表明確實有幾個分節(jié)孢子保持了圓柱形狀(圖7，C圖)。雖然如此，如B圖中所示的分節(jié)孢子，它們都有細胞內(nèi)部和細胞壁形態(tài)畸變。這些觀察結(jié)果表明，occidiofungin 通過破壞細胞壁的形成靶向膜的完整性，而且occidiofungin可以抑制酶的功能，因為可見的包涵體的形成一般有助于物質(zhì)的積聚。討論此研究的發(fā)現(xiàn)包括闡述了 occidiofungin完整共價結(jié)構(gòu)包括新型的氨基酸；對 occidiofungin廣譜抗真菌活性的表征；以及對持續(xù)暴露于抗真菌化合物中的細胞內(nèi)容物和膜不穩(wěn)定性的體外觀察。結(jié)構(gòu)表征確定occidiofungin是一種獨特的抗真菌劑。上述質(zhì)譜和NMR數(shù)據(jù)完全符合并支持圖1所示的occidiofungin結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提供清晰的氨基酸排列使我們能區(qū)別 occidiofungin 的兩種變體，occidiofungin A 和 occidiofungin B。一個完全的沿著每個分子骨架的序貫行進被示出。此外，C-末端殘基Ser8與occidiofungin A中Asnl之間的Ν0Ε、以及與occidiofungin B的β羰基Asnl之間的NOE證實了此前所預(yù)測的寡肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。一種新型氨基酸被確認及通過NMR數(shù)據(jù)很好地表征。此獨特的殘基對抗真菌活性的重要性是未知的，但成為發(fā)明人小組極大關(guān)注的方面。而且，兩個氨基酸衍生物，羥基Asn (除occidiofunginB外)和β -羥基Tyr通過NMR譜確認(表1)。每個變體的色譜分離還沒有完成。因此，Asnl的β碳羥基化是否對化合物生物活性很重要尚且不知道。 靠近羥基Asnl的酰胺頻率的急劇位移表明Asnl上的β碳羥基化后確實改變了肽的構(gòu)象。Occidiofungin活性的準確機理尚不知道，但這項研究提供了堅實的基礎(chǔ)去開展闡明活性機理的實驗。Occidiofungin對兩種腐霉菌屬菌種展現(xiàn)了很強的抑制活性。腐霉屬不是一種真正的真菌，麥角固醇不是作為主要留醇存在于其細胞膜中；結(jié)果，它對靶向麥角固醇的抗真菌劑不敏感。因此，Occidiofungin的抗真菌活性很可能不包括與麥角固醇結(jié)合或抑制麥角固醇的合成。值得注意的是腐霉菌細胞壁不包括幾丁質(zhì)，該卵菌亞綱的細胞壁中含有有大量的β-葡聚糖。因此，Occidiofimgin可能不會靶向幾丁質(zhì)的合成。暴露于Occidiofimgin中的真菌的形態(tài)與文獻報道的暴露于棘白菌素的真菌的形態(tài)類似，表明Occidiofungin可以靶向葡聚糖的合成。暴露于米卡芬靜(micafungin) (一種棘白霉素)的抑制濃度的煙曲霉菌，表現(xiàn)出菌絲破裂并表現(xiàn)出波緣膜，以及在亞抑菌濃度下菌絲尖端畸變現(xiàn)象。暴露于棘白菌素的致死劑量的白色念珠菌誘導(dǎo)了腫脹，并在亞抑菌劑量下在膜上觀察到不正常的形態(tài)變化。在煙曲霉中的不正常的膜形態(tài)的形成與在亞抑菌濃度下生長的立枯絲核菌和桑樹內(nèi)生真菌所觀察到的相似，并且白色念珠菌的細胞腫脹與暴露于Occidiofungin的亞抑菌劑量的白地霉所觀察到的相似。令人驚奇的是，鐮刀菌對棘白霉素有抵抗作用。其抵抗機理歸因于1，3-β-葡聚糖合成酶催化亞基中的天然變異和細胞壁結(jié)構(gòu)中天然差異，特別地，鐮刀菌具有更少的1，3-β-葡聚糖。在這項研究中， 當尖孢鐮刀菌的MIC大于32 μ g/mL時，Occidiofungin在16 μ g/mL下令人驚奇地減慢了該真菌的生長。另外的研究將揭示occidiofungin是否抑制了葡聚糖真菌細胞壁合成，尤其是其抑制1，3-β-葡聚糖合成酶的能力。細胞壁形成和對細胞壁損壞的應(yīng)答涉及復(fù)雜的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其在真菌細胞壁表面與合成及修復(fù)的生物合成酶之間進行聯(lián)系。因此， occidiofungin的準確的作用機理可能涉及全新的靶標。根據(jù)感染或疾病的嚴重程度，可以治療有效的量將包括本發(fā)明的組合物施予目標動物或植物，由此預(yù)防或減輕真菌感染的短期或長期影響。本公開第一次描述并完整表征了一系列新型且非常有效的抗真菌化合物，其用于預(yù)防和減輕在人、動物和植物對象中的廣譜真菌感染，本文還公開了產(chǎn)生抗真菌化合物的分離出的新型菌株。以上的詳細描述可使本領(lǐng)域任何技術(shù)人員制造和使用本發(fā)明。公開了具體描述以提供對本發(fā)明的綜合理解，并用于解釋其提供的信息。然而這些具體描述并不要求體現(xiàn)在本發(fā)明中，因為其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。對具體應(yīng)用、分析和計算的描述僅作為代表性的實例。各種適當變化、改進、組合和優(yōu)選實施方案的等效方案以及增加的、不同的相互作用和材料及產(chǎn)生的有益效果對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的，本發(fā)明的一般原理可適用于其他實施方案和應(yīng)用，其均包含在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。權(quán)利要求書和說明書不應(yīng)解釋為過分縮小如本發(fā)明所提出的全部保護范圍。本發(fā)明所提供的圖也應(yīng)理解為僅作示例的目的。不應(yīng)將本發(fā)明限制于所示的實施方案，本發(fā)明應(yīng)被賦予與本文所公開的原理和特征一致的最寬的可能的范圍。表1化學(xué)位移
權(quán)利要求
1. 一種抗真菌的環(huán)狀糖肽化合物及其藥用和農(nóng)用鹽，用于預(yù)防或治療真菌性感染或疾病，由式(I)表示 Occidiofungin A
2. 一種抗真菌的環(huán)狀糖肽化合物及其藥用和農(nóng)用鹽，用于預(yù)防或治療真菌性感染或疾病，由式(II)表示 Occidiofungin B 單一同位素質(zhì)量1215. 55331
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗真菌化合物，其中所述氨基酸殘基NAA2還包括連接的?；湍咎?。
4.如權(quán)利要求3所述的抗真菌化合物，其中所述氨基酸殘基NAA2具有結(jié)構(gòu)
5.如權(quán)利要求3所述的抗真菌化合物，其中所述化合物能有效抗真菌性植物、動物和人體病原體。
6.如權(quán)利要求3所述的抗真菌化合物，其中所述化合物能破壞真菌性植物、動物和人體病原體的細胞膜形態(tài)。
7.—種藥物組合物，包括如權(quán)利要求1或2所述的抗真菌化合物和至少一種藥用載體或稀釋劑。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述至少一種載體或稀釋劑為農(nóng)用載體或稀釋劑。
9.如權(quán)利要求5所述的抗真菌化合物，其中所述化合物源自真菌菌株Burkholderia Contaminans0
10.一種分離的菌株MS14，其中所述菌株屬于Burkholderia contaminans種，其基因 DNA片段已測序并存儲于Genbank，登錄號為EU938698，所述菌株具有增強產(chǎn)生至少一種抗真菌化合物的活性的基因組區(qū)域。
11.如權(quán)利要求10所述的分離的菌株，其中所述至少一種抗真菌化合物為權(quán)利要求1 所述的抗真菌的環(huán)狀糖肽化合物。
12.如權(quán)利要求10所述的分離的菌株，其中所述至少一種抗真菌化合物為權(quán)利要求2 所述的抗真菌的環(huán)狀糖肽化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由Burkholderia contaminans菌株產(chǎn)生的新型抗菌糖肽化合物及其鹽，其用于預(yù)防或治療動物和植物中的真菌性感染或疾病，還涉及產(chǎn)生該化合物的菌株。
文檔編號A61K38/00GK102448481SQ201080023431
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者盧世恩, 弗蘭克·奧斯丁, 詹姆斯·L·史密斯, 顧甘宇 申請人:密西西比州立大學(xué)