專利名稱：慢性阻塞性肺疾病改善劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及慢性阻塞性肺疾病改善劑，詳細(xì)地說，涉及含有卵磷脂化超氧化物歧化酶(以下，有時(shí)也簡稱為PC-S0D)作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(以下，有時(shí)也簡稱為SOD)是1965年由Huber等人從牛的血液中作為抗炎蛋白提取的生理活性蛋白，已解明其可特異性地清除作為活性氧之一的超氧陰離子(02_)。在生物體內(nèi)，活性氧主要由嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞釋放以用于殺菌，通常對(duì)于剩余的活性氧，存在以SOD為首的各種抗氧化物質(zhì)，以防御活性氧對(duì)正常細(xì)胞的傷害。但是，若活性氧過量存在并超出SOD等抗氧化物質(zhì)所產(chǎn)生的抗氧化能力，則其附近存在的物質(zhì)(特別是細(xì)胞膜)會(huì)被活性氧攻擊，表現(xiàn)出各種病狀。事實(shí)上，自從活性氧的強(qiáng)大的組織損傷性被證明以來，已解明其是導(dǎo)致炎癥、過敏、缺血再灌注所致的組織損傷、 抗癌劑所致的肺纖維化等多種病狀發(fā)生及加重的因素。在這樣的狀況下，人們發(fā)現(xiàn)了可特異性清除活性氧的S0D，對(duì)其臨床應(yīng)用的可能性進(jìn)行了廣泛的研究。本發(fā)明人也對(duì)SOD的臨床應(yīng)用性進(jìn)行了深入研究并認(rèn)識(shí)到，為了提高 SOD的臨床效果，重要的是抑制SOD從腎臟排泄以維持血中濃度，以及提高SOD對(duì)細(xì)胞膜的親和性清除細(xì)胞膜上存在的過量的活性氧，本發(fā)明人對(duì)各種修飾型SOD進(jìn)行了研究，提出了卵磷脂化超氧化物歧化酶(PC-SOD)(專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)9)。該P(yáng)C-SOD是利用基因重組技術(shù)制備Cu/Zn-人超氧化物歧化酶(SOD)后，以化學(xué)方式使每1分子SOD ( 二聚體)上鍵合平均4分子卵磷脂衍生物(磷脂酰膽堿衍生物PC) 而得到的卵磷脂化SOD。PC-SOD對(duì)細(xì)胞膜具有高親和性，已確認(rèn)其對(duì)于缺血/再灌注損傷、 蒽環(huán)類抗癌藥誘發(fā)心肌癥等活性氧作為發(fā)癥因子在病變部位以參與的疾病的治療效果高， 已經(jīng)提出了各種以該P(yáng)C-SOD作為有效成分的急性心力衰竭治療劑(專利文獻(xiàn)2)、抗病毒劑 (專利文獻(xiàn)幻、狼瘡腎炎治療劑(專利文獻(xiàn)4)、與腦血管疾病相伴的功能障礙改善劑(專利文獻(xiàn)幻、抗纖維化劑(專利文獻(xiàn)6)或者抗過敏疾病處置劑(專利文獻(xiàn)7)、燒燙傷治療劑 (專利文獻(xiàn)8)、間質(zhì)性肺炎治療劑(專利文獻(xiàn)10)等。那么，慢性阻塞性肺疾病(COPD =Chronic Obstructive Pulmonary Disease)因各種原因(特別是吸煙)而在肺中產(chǎn)生慢性的炎癥，由此引起肺泡的破壞、支氣管粘液腺的肥大，結(jié)果產(chǎn)生氣喘，咳嗽和咳痰增加。以前被稱為肺氣腫(PE :pulm0nary emphysema)的疾病與被稱為慢性支氣管炎(CB chronic bronchitis)的疾病兩者多以各種比例合并，與由該兩者所引起的閉塞性肺病一起被稱為慢性阻塞性肺疾病(以下，記為C0PD)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估算，2005年全世界一年有300萬人因COPD而喪命， 占死亡原因的第4位，并預(yù)測(cè)在今后10年間還會(huì)增加30%。根據(jù)厚生勞動(dòng)省的統(tǒng)計(jì)，在日本，2005年日本人的全部死亡人數(shù)的1.3%是因COPD而死亡，為死亡原因的第10位，若僅限于男性則占第7位。
COPD的最大原因?yàn)槲鼰?。COPD患者的90%為吸煙者(非專利文獻(xiàn)1)，與非吸煙者相比吸煙者中COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為6倍以上。吸煙者的約10 15%會(huì)患C0PD，若僅限于高齡者則近50%為COPD。作為其他原因，可以舉出室內(nèi)空氣污染、大氣污染、化學(xué)物質(zhì)或粉塵的吸入、遺傳所致的原因、幼兒期的肺炎/支氣管炎等。作為其病狀，其是特征在于氣流受限、即難以呼氣的疾病，但病狀的本質(zhì)為呼吸道的慢性炎癥。由于吸煙或吸入物質(zhì)，從中央氣道至末梢支氣管以各種水平引起肺的炎癥。其結(jié)果，認(rèn)為由于蛋白酶/抗蛋白酶的不均勻、和氧化劑/抗氧化劑的不均勻等而引起肺泡的破壞、支氣管粘液腺的肥大。該COPD產(chǎn)生不可逆的呼吸道的破壞，因此是無法治愈的疾病。只能通過禁煙；利用支氣管擴(kuò)張劑、祛痰劑、止咳劑等給藥的藥物療法；氧療法等來緩解癥狀，其為極其麻煩的疾病。從上述觀點(diǎn)出發(fā)，迄今為止提出了各種COPD改善劑或改善方法(例如，專利文獻(xiàn) 11、12)，但現(xiàn)狀是期待更優(yōu)異的COPD改善劑的出現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 日本特開平9-117279號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2 日本特開平9-52843號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)3 日本特開平9-59178號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)4 日本特開平9-110717號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)5 日本特開平10-338645號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)6 日本特開2001-2585號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)7 日本特開2001-151695號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)8 日本特開2006-169128號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)9 日本特開2001-64199號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)10日本特愿2007-099201
專利文獻(xiàn)11日本特開2006-56890號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)12日本特開2008-189667號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1 Annual Review of Medicine, 40 :1989，pp411_429
若COPD的發(fā)病與肺組織中的炎癥有關(guān)，則其誘發(fā)與超氧陰離子等活性氧、鐵絡(luò)合
物有關(guān)，因此認(rèn)為，通過利用SOD等清除這些活性氧來抑制其誘導(dǎo)，結(jié)果能夠改善COPD癥狀。 于是，本發(fā)明人立足于該觀點(diǎn)，研究了之前提出的細(xì)胞親和性高的卵磷脂化超氧化物歧化酶(PC-SOD)在COPD中的應(yīng)用，結(jié)果確認(rèn)到該P(yáng)C-SOD對(duì)于COPD癥狀的改善極其有效，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的課題在于提供一種以PC-SOD作為有效成分的安全、有效的COPD改善劑。
為了解決上述課題，本發(fā)明的基本方式在于一種COPD改善劑，其特征在于，其以如下通式(I)表示的卵磷脂化超氧化物歧化酶作為有效成分。SOD， (Q-B)m (I)(式中，SOD’表示超氧化物歧化酶的殘基，Q表示化學(xué)交聯(lián)，B表示從在甘油部的2 位具有羥基的溶血卵磷脂中的所述羥基上除去氫原子后的殘基，m為溶血卵磷脂在1分子超氧化物歧化酶上的平均鍵合數(shù)，且表示1以上的整數(shù)。)更優(yōu)選的是一種COPD改善劑，其特征在于，在本發(fā)明中使用的式(I)表示的卵磷脂化超氧化物歧化酶中，Q為-C (0) - (CH2)n-C (0)-(式中，η表示2以上的整數(shù))。此外，更具體地說，本發(fā)明涉及一種COPD改善劑，其特征在于，SOD’為人超氧化物歧化酶的殘基，具體地說，SOD’為人超氧化物歧化酶的氨基酸序列中的第111位氨基酸變成S-(2-羥乙基硫代)半胱氨酸的超氧化物歧化酶修飾體的殘基。最具體地說，本發(fā)明涉及一種COPD改善劑，其特征在于，超氧化物歧化酶為在活性中心含有銅和鋅的超氧化物歧化酶。此外，本發(fā)明涉及一種COPD改善劑，該COPD改善劑含有卵磷脂化超氧化物歧化酶的同時(shí)還含有其穩(wěn)定化劑，作為穩(wěn)定化劑，含有糖成分、特別是蔗糖。更具體地說，本發(fā)明涉及一種COPD改善劑，其特征在于，其為注射劑的形態(tài)或吸入劑的形態(tài)。本發(fā)明中，COPD的發(fā)病是在從中央支氣管至末梢氣道的呼吸道產(chǎn)生慢性炎癥的疾病，其誘發(fā)與超氧陰離子等活性氧、鐵絡(luò)合物有關(guān)，因此通過利用SOD等清除這些活性氧來有效地抑制其誘導(dǎo)，其結(jié)果能夠進(jìn)行COPD的有效的改善治療。在迄今為止不存在有效的COPD改善劑的狀況下，通過給予特異性的PC-SOD能夠改善其癥狀，從這方面來看，本發(fā)明在醫(yī)療上的效果是極其特異的。另外，本發(fā)明中使用的PC-SOD與細(xì)胞膜的親和性優(yōu)于現(xiàn)有的S0D，清除病變部位的超氧陰離子的能力高。而且，通過作為穩(wěn)定化劑一同含有糖成分、特別是蔗糖，能夠使 PC-SOD自身的穩(wěn)定性優(yōu)異，可以持續(xù)地發(fā)揮半衰期短的SOD的效果，能夠進(jìn)行COPD的改善， 從該方面出發(fā)本發(fā)明是特別優(yōu)異的。


圖1是表示試驗(yàn)例1中的肺泡清洗液中的總細(xì)胞數(shù)的圖。圖2是作為試驗(yàn)例1中的炎性細(xì)胞數(shù)表示肺泡巨噬細(xì)胞的結(jié)果的圖。圖3是作為試驗(yàn)例1中的炎性細(xì)胞數(shù)表示嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)果的圖。圖4是作為試驗(yàn)例1中的炎性細(xì)胞數(shù)表示淋巴細(xì)胞的結(jié)果的圖。圖5是試驗(yàn)例1中經(jīng)H&E染色的肺組織的顯微鏡照片。圖6是表示試驗(yàn)例1中的肺泡平均截距(Mean Linear Intercept μ m)的結(jié)果的圖。圖7是表示試驗(yàn)例2中的肺泡清洗液中的總細(xì)胞數(shù)的圖。圖8是作為試驗(yàn)例2中的炎性細(xì)胞數(shù)表示肺泡巨噬細(xì)胞的結(jié)果的圖。圖9是作為試驗(yàn)例2中的炎性細(xì)胞數(shù)表示嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)果的圖。圖10是作為試驗(yàn)例2中的炎性細(xì)胞數(shù)表示淋巴細(xì)胞的結(jié)果的圖。
圖11是試驗(yàn)例2中經(jīng)H&E染色的肺組織的顯微鏡照片。圖12是表示試驗(yàn)例2中的肺泡平均截距(Mean Linear Intercept μ m)的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的COPD改善劑中所使用的卵磷脂化超氧化物歧化酶(PC-SOD)中，“卵磷脂”是指意味著磷脂酰膽堿的通常的卵磷脂，“溶血卵磷脂”是指鍵合在卵磷脂的甘油部的2位上的1分子脂肪酸被除去、在2位碳原子上鍵合了羥基的化合物。本發(fā)明使用的PC-SOD通?？梢匀缦芦@得使溶血卵磷脂的2位的羥基與化學(xué)交聯(lián)劑鍵合，得到卵磷脂衍生物，使1個(gè)以上的卵磷脂衍生物與SOD鍵合，從而得到本發(fā)明使用的PC-S0D。該P(yáng)C-SOD可以通過下式(I)表示。SOD， (Q-B)m (I)(式中，SOD’表示超氧化物歧化酶的殘基，Q表示化學(xué)交聯(lián)，B表示從在甘油部的2 位具有羥基的溶血卵磷脂中的所述羥基上除去氫原子后的殘基，m為溶血卵磷脂在1分子超氧化物歧化酶上的平均鍵合數(shù)，且表示1以上的整數(shù)。)在此使用的SOD’只要能夠發(fā)揮分解生物體內(nèi)的活性氧(02_)這樣其原本的功能， 則對(duì)其來源無特別限定，可以廣泛地使用來自各種動(dòng)植物或微生物的SOD殘基。但是，考慮到作為藥品的用途時(shí)，優(yōu)選盡可能減小SOD’在生物體內(nèi)的抗原性。因此，作為所使用的 SOD’，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的COPD改善劑的給藥對(duì)象來適當(dāng)選擇合適的SOD殘基。例如，由于要以現(xiàn)實(shí)的COPD患者為對(duì)象進(jìn)行給藥，因此為了盡可能減少給藥所引起的生物體內(nèi)的抗原性，優(yōu)選使用人源SOD殘基。因此，作為本發(fā)明的COPD改善劑，考慮到抗原性，以使用人源SOD為宜。作為人源S0D，人源Cu/Zn SOD (在活性中心含有銅和鋅的人源SOD ；以下有時(shí)也簡稱為人Cu/Zn SOD)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量多，而且基于基因工程學(xué)方法的生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)得到確立，能夠大量制備，因此特別優(yōu)選使用。該人Cu/Zn SOD可以是任意的人Cu/Zn S0D，包括由人組織或培養(yǎng)細(xì)胞制造的天然的人Cu/Zn SOD ；通過基因工程學(xué)方法制造的人Cu/Zn SOD ；具有與天然的人Cu/Zn SOD實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列的重組人Cu/Zn SOD;這些人Cu/Zn SOD的氨基酸序列式中的部分氨基酸發(fā)生缺失、插入、置換、或者化學(xué)修飾或改變而得到的SOD等。其中，優(yōu)選天然的人Cu/Zn SOD的氨基酸序列式中的第111位氨基酸(半胱氨酸 Cys)變成S-(2-羥乙基硫代)半胱氨酸的人Cu/Zn SOD。該人Cu/Zn SOD詳細(xì)記載于例如日本特開平9-117279號(hào)公報(bào)中，可以根據(jù)該方法獲得。因此，記載于日本特開平9-117279號(hào)公報(bào)中的人Cu/Zn SOD的制備構(gòu)成本說明書的一部分，本發(fā)明中使用的PC-SOD可以以這些人Cu/Zn SOD作為材料而獲得。本發(fā)明中使用的由式⑴表示的PC-SOD中，B表示的“從在甘油部的2位具有羥基的溶血卵磷脂中的所述羥基上除去氫原子后的殘基”具體地說由下式(II)表示。-O-CH(CH2OR) [CH2OP (0) (CT) (OCH2CH2N+ (CH3) 3) ] (II)(式中，R為脂肪酸殘基(?；?。)作為R表示的脂肪酸殘基(?；?，優(yōu)選碳原子數(shù)為10 28的飽和或不飽和脂肪酸殘基，更優(yōu)選肉豆蔻?；?、棕櫚?；?、硬脂?；?、二十?；?、二十二酰基、其他碳原子數(shù)為14 22的飽和脂肪酸殘基，特別優(yōu)選作為具有16個(gè)碳原子的飽和脂肪酸殘基的棕櫚?；?。另外，對(duì)通式(I)中以Q表示的化學(xué)交聯(lián)沒有特別限定，只要能夠使SOD和卵磷脂交聯(lián)而形成化學(xué)鍵(共價(jià)鍵)即可。作為這樣的化學(xué)交聯(lián)，特別優(yōu)選殘基-C(O)-(CH2) n-C(0)_(式中，η表示2以上的整數(shù))。該殘基是除去了存在于以式=HO-C(O)-(CH2) n-C(0)-0H表示的直鏈狀的二羧酸、其酸酐、酯、鹵化物等的兩端的羥基(其中，對(duì)于酸酐、 酯、鹵化物的情況，除去存在于兩端的相當(dāng)于羥基的部分)后的殘基。通式(I)中，Q為上述直鏈狀的二羧酸殘基的情況下，Q的一端通過酯鍵與來自上述式(II)的溶血卵磷脂殘基的羥基上的氧鍵合。另外，形成酯鍵的Q的另一端通過酰胺鍵等與SOD的氨基直接鍵合。需要說明的是，上述化學(xué)交聯(lián)的殘基中，η為2以上的整數(shù)，優(yōu)選為2 10的整數(shù)。另外，式(I)中，m表示溶血卵磷脂在1分子SOD上的平均鍵合數(shù)。因此，m為1以上的整數(shù)，優(yōu)選為1 12，特別優(yōu)選為4。本發(fā)明中使用的PC-SOD的制造方法(即卵磷脂衍生物與SOD、優(yōu)選為人Cu/ZnSOD 的鍵合方法)例如可以通過日本特開平9-117279號(hào)公報(bào)中記載的方法進(jìn)行。示意性地表示其優(yōu)選的PC-SOD的化學(xué)結(jié)構(gòu)的話，特別優(yōu)選以下的PC-S0D。(m為所鍵合的卵磷脂衍生物數(shù)。)S卩，對(duì)于以大腸桿菌(E. coli)為宿主通過基因重組而制造的人Cu/Zn SOD的游離氨基，平均共價(jià)鍵合4分子的卵磷脂衍生物。本發(fā)明的COPD改善劑中使用的PC-SOD優(yōu)選被精制成能夠作為藥品使用的程度， 且實(shí)質(zhì)上不含有作為藥品不允許混入的物質(zhì)。例如，PC-SOD優(yōu)選使用精制到2，500U/mg以上的SOD比活性后的物質(zhì)，更優(yōu)選使用精制到3，000U/mg以上的SOD比活性后的物質(zhì)。需要說明的是，本發(fā)明中，IU (單位)表示如下PC-SOD的酶量在pH7.8/30°C的條件下使用 NBT (硝基四氮唑藍(lán))并根據(jù) J. Biol. Chem.，vol. 244，No. 226049-6055(1969)中記載的方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，抑制NBT的還原速度50%時(shí)的PC-SOD的酶量。本發(fā)明所提供的COPD改善劑是以如此制備的PC-SOD為有效成分的COPD改善劑， 但優(yōu)選與PC-SOD—起含有穩(wěn)定化劑。作為這樣的穩(wěn)定化劑，例如可以舉出糖成分。作為糖成分，只要是可藥用的糖成分則沒有特別限定，其中優(yōu)選為蔗糖。因此，本發(fā)明所提供的最優(yōu)選的COPD改善劑是同時(shí)含有PC-SOD和蔗糖的組合物。作為蔗糖，優(yōu)選精制到能夠用作藥品的程度，特別優(yōu)選使用經(jīng)活性炭處理的蔗糖。通過將這樣的蔗糖與PC-SOD —起使用， 能夠防止長時(shí)間保存所導(dǎo)致的PC-SOD的活性降低，從而能夠制備出穩(wěn)定性高、且即使在進(jìn)行了冷凍干燥的情況下也能保持特別良好的形狀的組合物。
本發(fā)明的COPD改善劑中的PC-SOD與蔗糖的混合比例可以根據(jù)給藥量、制劑的形態(tài)等而適當(dāng)決定，沒有特別限定。但是，以PC-SOD與蔗糖的重量比計(jì)，優(yōu)選其處于 0. 1/100 80/100程度的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為0. 4/100 60/100的程度。只要不對(duì)PC-SOD的活性產(chǎn)生影響且不對(duì)制劑的效果產(chǎn)生影響，則本發(fā)明的COPD 改善劑中還可以添加其他藥物活性成分、慣用的制劑成分，例如，賦形劑、粘合劑、潤滑劑、 著色劑、崩解劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、無痛劑等。本發(fā)明所提供的COPD改善劑的制備中，可以使用PC-SOD和蔗糖通過制劑學(xué)上公知、慣用的方法來進(jìn)行。需要說明的是，本發(fā)明的制劑組合物中使用的PC-SOD優(yōu)選為溶液態(tài)、冷凍狀、或冷凍干燥狀的形態(tài)。作為其中一種方式，本發(fā)明所提供的COPD改善劑可以優(yōu)選以注射劑的形態(tài)給藥。 作為注射劑，優(yōu)選為溶液、懸浮液、乳濁液、用時(shí)溶解型固態(tài)制劑等形態(tài)，這些制劑可以按照日本藥典的制劑總則中記載的方法來制備。另外，作為其他方式，本發(fā)明所提供的COPD改善劑可以優(yōu)選以吸入劑的形態(tài)給藥。所述吸入劑是指用于使之到達(dá)氣管、支氣管、肺等的醫(yī)藥組合物，優(yōu)選為滴鼻劑或者適于經(jīng)鼻或經(jīng)肺給藥的組合物，特別優(yōu)選適于經(jīng)肺給藥的組合物。作為吸入劑，可以使用上述PC-SOD作為有效成分，以粉末、溶液或懸浮液的形態(tài)來進(jìn)行制造。以粉末的形態(tài)制造吸入劑時(shí)，作為有效成分的上述PC-SOD可以直接制造，或者可以通過加入賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定化劑、矯味/矯臭劑等添加劑并微細(xì)化來制造。另外，以溶液或懸浮劑的形態(tài)制造吸入劑時(shí)，例如，可以通過將PC-SOD溶解或懸浮于水或水和輔助溶劑(例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇之類的醇類輔助溶劑)的混合物中來進(jìn)行制造。這樣的溶液或懸浮液中可以進(jìn)一步含有防腐劑、增溶劑、緩沖劑、等滲劑、吸收促進(jìn)劑、增稠劑等。對(duì)于如上制造的吸入劑，可以使用吸入劑的領(lǐng)域中常用的手段(例如玻璃吸管、 移液管、插管或噴霧機(jī)(atomizer)、霧化器(Nebulizer)等噴霧器)形成霧狀，直接給藥到鼻腔內(nèi)或口腔內(nèi)、或者氣管、支氣管、肺等。使用噴霧器時(shí)，可以與適當(dāng)?shù)膰娚鋭?例如，二氯氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷之類的含氯氟烴；或者二氧化碳等氣體等)一起作為制成加壓袋的形式的氣溶膠進(jìn)行噴霧，或者可以使用霧化器進(jìn)行給藥。本發(fā)明的COPD改善劑中的有效成分PC-SOD的量和制劑的給藥量根據(jù)制劑的制備方法、劑形、對(duì)象疾病的程度、患者的年齡、體重而異，不能一概進(jìn)行限定，例如作為臨床量可舉出成人每人每天0. 5 100mg(1500U 30萬U)。另外，給藥次數(shù)也不能一概進(jìn)行限定，還可以進(jìn)行1天1次或1天多次地給藥。實(shí)施例以下，通過說明具體的試驗(yàn)例、實(shí)施例來更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些記載。試驗(yàn)例1 =PC-SOD對(duì)于豬胰腺彈性蛋白酶誘發(fā)COPD模型小鼠的效果(靜脈內(nèi)給藥)
[方法]對(duì)于6 8周齡的BALB/c小鼠，對(duì)每一只小鼠經(jīng)呼吸道給予50 μ g的豬胰腺彈性蛋白酶，制造肺損傷。將各濃度(1. 5kU/kg和3. OkU/kg)的PC-S0D —天一次靜脈內(nèi)給藥，3天后回收肺泡清洗液，統(tǒng)計(jì)總細(xì)胞數(shù)。另外，利用DifT-Quik法對(duì)細(xì)胞染色，統(tǒng)計(jì)各炎性細(xì)胞數(shù)。進(jìn)而，將小鼠安樂死，制作肺組織的切片，進(jìn)行H&E染色，通過電子顯微鏡拍攝得到染色像(X40)。由該H&E染色像測(cè)定肺泡平均截距(Mean Linear Intercept μ m)。[結(jié)果]1.肺泡清洗液中的總細(xì)胞數(shù)見圖1。由圖中的結(jié)果可知，通過豬胰腺彈性蛋白酶給藥，總細(xì)胞數(shù)上升，可預(yù)測(cè)炎性細(xì)胞增加。另外，該上升因PC-SOD而減弱，所以可預(yù)測(cè)PC-SOD發(fā)揮了抗炎作用。2.各炎性細(xì)胞數(shù)見圖2 圖4。圖2表示的是肺泡巨噬細(xì)胞的結(jié)果，圖3表示的是嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)果，圖4表示的是淋巴細(xì)胞的結(jié)果。由圖中的結(jié)果可知，通過PC-SOD的1. 5kU/kg和3. OkU/kg靜脈給藥，觀察到炎性細(xì)胞的減少，顯示出顯著的抗炎作用。3.圖5表示的是經(jīng)H&E染色的肺組織的顯微鏡照片的結(jié)果，圖6表示的是肺泡平均截距(Mean Linear Intercept μ m)的結(jié)果。由各圖中所示的結(jié)果可知，PC-SOD的1. 5kU/kg和3. OkU/kg靜脈給藥抑制了依賴于彈性蛋白酶的肺泡平均截距的延長，抑制了肺損傷。試驗(yàn)例2 =PC-SOD對(duì)于豬胰腺彈性蛋白酶誘發(fā)COPD模型小鼠的效果(吸入給藥)[方法]對(duì)于6 8周齡的BALB/c小鼠，對(duì)每一只小鼠經(jīng)呼吸道給予50 μ g的豬胰腺彈性蛋白酶，制造肺損傷。將含有各濃度(30kU/腔室和60kU/腔室)的PC-SOD的吸入劑一天一次吸入給藥， 3天后回收肺泡清洗液，統(tǒng)計(jì)總細(xì)胞數(shù)。另外，利用Diff-Quik法對(duì)細(xì)胞染色，統(tǒng)計(jì)各炎性細(xì)胞數(shù)。進(jìn)而，將小鼠安樂死，制作肺組織的切片，進(jìn)行H&E染色，通過電子顯微鏡拍攝得到染色像(X40)。由該H&E染色像測(cè)定肺泡平均截距(Mean Linear Intercept μ m)。[結(jié)果]1.肺泡清洗液中的總細(xì)胞數(shù)見圖7。由圖中的結(jié)果可知，由于豬胰腺彈性蛋白酶給藥而上升的總細(xì)胞數(shù)因PC-SOD而減弱，因此可預(yù)測(cè)PC-SOD發(fā)揮了抗炎作用。2.各炎性細(xì)胞數(shù)見圖8 圖10。圖8表示的是肺泡巨噬細(xì)胞的結(jié)果，圖9表示的是嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)果，圖10表示的是淋巴細(xì)胞的結(jié)果。
由圖中的結(jié)果可知，含有30kU/腔室和50kU/腔室的PC-SOD的吸入劑的吸入給藥 (經(jīng)肺給藥)顯示出顯著的抗炎作用。3.圖11表示的是經(jīng)H&E染色的肺組織的顯微鏡照片的結(jié)果，圖12表示的是肺泡平均截距(Mean Linear Intercept μ m)的結(jié)果。由各圖中所示的結(jié)果可知，含有30kU/腔室和50kU/腔室的PC-SOD的吸入劑的吸入(經(jīng)肺)給藥抑制了依賴于彈性蛋白酶的肺泡平均截距的延長，抑制了肺損傷。制劑例1 靜脈注射劑將(w/w)PC-SODUO% (w/w)蔗糖、0. 05% (w/w)苯扎氯銨溶解于5%木糖醇水溶液中后，冷凍干燥。向所得到的冷凍干燥劑中加入填充到別的小瓶中的0. 5%羧甲基纖維素或注射用水，從而得到靜脈注射用劑。實(shí)施例2:吸入劑吸入用液劑(1)將(w/w)PC-SODUO% (w/w)蔗糖、0. 05% (w/w)苯扎氯銨溶解于5%木糖醇水溶液中，制備吸入用液劑。吸入用液劑(2)用1% (w/w)PC-SODUO% (w/w)蔗糖、0.05% (w/w)苯扎氯銨、10% (w/w)聚乙二醇、20% (w/w)丙二醇、和余部的純凈水制備吸入用液劑。吸入用散劑用5% (w/w)PC-SOD、余部的蔗糖(微細(xì)粉末狀)制備吸入用散劑。工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明提供的COPD改善劑以特異性的PC-SOD作為有效成分，其與細(xì)胞膜等的親和性優(yōu)于現(xiàn)有的S0D，清除病變部位的超氧陰離子的能力高。而且，通過一同含有蔗糖，其穩(wěn)定性優(yōu)異，可持續(xù)地發(fā)揮半衰期短的SOD的效果。通過利用該SOD的效果清除誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的超氧陰離子等活性氧，從而能夠有效地抑制其誘導(dǎo)，結(jié)果能夠進(jìn)行COPD的有效的改善，醫(yī)療上的價(jià)值非常大。
權(quán)利要求
1.一種慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，其以如下通式(I)表示的卵磷脂化超氧化物歧化酶作為有效成分，SOD， (Q-B)m (I)式(I)中，SOD’表示超氧化物歧化酶的殘基，Q表示化學(xué)交聯(lián)，B表示從在甘油部的2 位具有羥基的溶血卵磷脂中的所述羥基上除去氫原子后的殘基，m為溶血卵磷脂在1分子超氧化物歧化酶上的平均鍵合數(shù)，且表示1以上的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，式(I)中，Q 為-C (0) - (CH2) n-C (0)-，其中η表示2以上的整數(shù)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，SOD’為人超氧化物歧化酶的殘基。
4.如權(quán)利要求1或2所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，SOD’為人超氧化物歧化酶的氨基酸序列中的第111位氨基酸變成S- (2-羥乙基硫代)半胱氨酸的超氧化物歧化酶修飾體的殘基。
5.如權(quán)利要求3或4所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，超氧化物歧化酶為在活性中心含有銅和鋅的超氧化物歧化酶。
6.如權(quán)利要求2至5的任一項(xiàng)所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其中，η為2 10的整數(shù)。
7.如權(quán)利要求1至6的任一項(xiàng)所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其中，m為1 12的整數(shù)。
8.如權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，該慢性阻塞性肺疾病改善劑還含有穩(wěn)定化劑。
9.如權(quán)利要求8所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，穩(wěn)定化劑為糖。
10.如權(quán)利要求9所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，糖為蔗糖。
11.如權(quán)利要求10所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，蔗糖為經(jīng)活性炭處理的蔗糖。
12.如權(quán)利要求1所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，該慢性阻塞性肺疾病改善劑為注射劑的形態(tài)。
13.如權(quán)利要求1所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，該慢性阻塞性肺疾病改善劑為吸入劑的形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種慢性阻塞性肺疾病(COPD)改善劑，其是靜脈給藥或吸入給藥的COPD改善劑，其特征在于，其以如下通式(I)表示的卵磷脂化超氧化物歧化酶作為有效成分。式(I)中，SOD’表示超氧化物歧化酶的殘基，Q表示化學(xué)交聯(lián)，B表示從在甘油部的2位具有羥基的溶血卵磷脂中的所述羥基上除去氫原子后的殘基，m為溶血卵磷脂在1分子超氧化物歧化酶上的平均鍵合數(shù)，且表示1以上的整數(shù)。SOD’(Q-B)m(I)。
文檔編號(hào)A61P11/00GK102348465SQ20108001124
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者水島徹 申請(qǐng)人:日本株式會(huì)社Ltt生物醫(yī)藥